JP4695752B2 - エリスリトール含有培地からのエリスリトールの産生及び回収方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エリスリトール結晶の産生及び回収方法、更に詳しくは同時に比較的高い粘性のポリサッカライドを産生することなくエリスリトールを産生する醗酵法────この方法は未精製の微生物不含醗酵培養液からの直接結晶化によってエリスリトール結晶を回収するのに好都合である───に関する。
【０００２】
【従来の技術】
醗酵によってエリスリトールを産生するエリスリトール産生酵母はモニリエラ属、トリコノスポロイデス(Trichonosporoides) 属、又はトリコノスポロン(Trichonosporon)属に属する酵母であって、一般に使用される種はモニリエラトメントサバルポリニス、及びトリコノスポロイデスメガチリエンシス（Trichonosporoides megachiliensis) である。
【０００３】
水性培地中でエリスリトール産生酵母の１種を培養することによって得られた培地からのエリスリトールの慣用の単離及び回収方法は、この培地を前処理、たとえば濾過によってバイオマスを除去し、活性炭を用いて脱色し、イオン交換樹脂を用いて培地を脱塩及び脱色し、ついで培地を濃縮して冷却し、これによって目的エリスリトールを結晶化させることから成る。
【０００４】
エリスリトールの単離、結晶化及び（又は）回収に影響を及ぼす不純物は次の成分を含有する：
・ポリオール、たとえばグリセロール及びリビトール、
・出発デンプン加水分解物中に含有されるジサッカライド及び高級ジサッカライド並びにこれらから生じる反応生成物を含む、オリゴサッカライド、
・酵母によって産生された粘性菌体ポリサッカライド。
【０００５】
ポリサッカライド生成のために、培地の粘度が増加する。これは減少された酸素移行速度を生じ、嫌気性醗酵によって炭水化物源の一部はエタノールに変化し、それによってエリスリトールの産生が減少する。更に、非常に粘性の醗酵ブロス(broth) は細胞を濾過し除去する点で問題を生じ、そしてポリオール回収は極めて困難である。
【０００６】
欧州特許第０３２７０１６号明細書に、アルカリ金属又はアンモニウム型強酸性カチオン交換樹脂が充填されたクロマトグラフィー分離カラムに微生物不含醗酵ブロスを通過させることによって、エリスリトール含有培地から極めて純粋なエリスリトールを回収する方法が記載されている。これによって種々の塩、着色物質、種々のオリゴサッカライド及びポリサッカライドが得られる。この方法は、好気性条件下に水性培地中でエリスリトール産生微生物を培養し、得られた培地から細胞を除去し、アルカリ金属又はアンモニウム型強酸性カチオン交換樹脂が充填された分離カラムに得られた上澄みを通過させ、これを水で溶離し、これから主成分としてエリスリトールを含有する分画を集め、ついでこれらの分画からエリスリトールを回収する。この方法は、極めて多量の水を消費しなければならず、したがって分離された成分は非常に希釈されており、その結果として蒸発のための経費が高くなる。更に、このような分離装置に出資する費用も高くなる。
【０００７】
欧州特許第０９０８５２３号明細書に記載された発明は、高純度のエリスリトール結晶の製造方法に関する。この方法は結晶化工程と結晶分離工程から成り、その際エリスリトール含有水溶液のエリスリトール濃度を結晶化工程の開始時に３０〜６０重量％に調整する。結晶化工程の前に、この方法は微生物分離工程及びクロマトグラフィー分離を含む。
【０００８】
特開平１０−２８７６０３号公報に関するダーウェント社のアブストラクトに、生じたポリサッカライド及び不純物を加水分解するための、微生物不含のエリスリトール醗酵ブロスの酸性処理法が記載されている。この加水分解は、ある種の不純物をより小さい粘性のその他の副生成物に変えるが、原則的に全体の純度はこれによって増加されない。これらの副生成物は慣用の分離方法、たとえば活性炭及びイオン交換体処理によって引き続き除去される。
【０００９】
特開平１−２１５２９３号公報に関するダーウェント社のアブストラクトに、限外濾過膜を用いるポリサッカライド含有醗酵ブロスからのエリスリトールの回収法が記載されている。微生物不含醗酵ブロスを濁らせるポリサッカライドは１，０００〜１００，０００ダルトンのカットオフ（cut-off)を有する膜を用いる限外濾過によって完全に除去されて、エリスリトールが精製された培地から回収される。
【００１０】
米国特許第４９０６５６９号明細書に記載の発明は、エリスリトール産生微生物の培地からの高い結晶化収率での極めて純粋なエリスリトールの単離及び回収方法であって、種々の不純物及び副生成物、たとえば種々の塩、着色物質及びポリサッカライドを分離し、除去することからなる、上記方法に関する。この場合、不純物及び副生成物は強酸性カチオン交換樹脂を用いるクロマトグラフィー分離によって除去される。
【００１１】
引用されたすべての上記特許文献によれば、生じるポリサッカライドを除去するための精製工程、たとえばイオン交換樹脂、カラムクロマトグラフィー、酸加水分解又は限外濾過による処理がいずれにしても要求される。
【００１２】
欧州特許第０１３６８０５号明細書に、酵母様真菌；モニリエラトメントサバルポリニスの多量の胞子形成コロニーの存在下での醗酵法において、エリスリトール含有量に対して２．３−３．５％のポリサッカライドが生じることが記載されている。少量の胞子形成コロニーの存在下で、エリスリトール含有量に対して１６−２５％までのポリサッカライドが生じる。多量の胞子形成コロニーを用いた場合、ポリサッカライドの量はエリスリトール含有量に対して２．３−３．５％にすでに減少するが、培養ブロスを６０％乾燥物質に及び８０％乾燥物質に濃縮する前に精製することが記載されている。エリスリトールはこれから結晶化される。更に、１３日までの長い醗酵時間が、３４％のエリスリトール収率を達成するのに必要である。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、微生物不含醗酵培地を精製することなく醗酵させて、エリスリトール結晶を回収することによるエリスリトールの産生方法に対する要求がある。この回収方法は、１）広範な精製、２）多量の廃棄蒸気の発生、３）高エネルギー要求がなくて、高度に純粋なエリスリトール結晶の良好な回収をもたらさなければならない。
【００１４】
【課題を解決する手段】
本発明はこのような方法を提供するものである。
【００１５】
本発明は、微生物を用いる醗酵によるエリスリトールの産生及びこのエリスリトール結晶の回収方法であって、これが次の工程：
ａ）エリスリトール含有量に対して１％より少ないポリサッカライド、好ましくは０．１％より少ないポリサッカライドを産生する、ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール（polysaccharide negative erythritol) 産生菌株を微生物として使用し、
ｂ）醗酵培地を調製し、
ｃ）上記微生物を醗酵培地に添加し、
ｄ）少なくとも５０ｇ／Ｌのエリスリトールが醗酵培地中に得られるまで微生物を増殖させ、
ｅ）醗酵培地から微生物を除去し、
ｆ）未精製の微生物不含醗酵培地を８０％ｗ／ｗより高い乾燥物質に濃縮し、
ｇ）エリスリトールを結晶化し、そして
ｈ）エリスリトール結晶を集める
ことから成ることを特徴とする、上記方法を開示する。
【００１６】
本発明は、未精製の微生物醗酵培地を少なくとも８５％ｗ／ｗ、更に好ましくは９０％ｗ／ｗより高い乾燥物質に濃縮させる方法に関する。
【００１７】
更に、本発明に、エリスリトール結晶を少なくとも８５％の回収率で集める方法を開示する。
【００１８】
本発明は、エリスリトール結晶が少なくとも９８％ｗ／ｗ、好ましくは９９％ｗ／ｗの純度を有する方法に関する。
【００１９】
本発明は、微生物を１０日未満で増殖させる方法に関する。
【００２０】
本発明は、醗酵培地を発泡されたカラムリアクター又はエアーリフト中で調製する方法に関する。
【００２１】
更に、本発明は、工程ａ）で、モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４を使用する方法を開示する。
【００２２】
また本発明は、エリスリトール含有量に対して１％より少ないポリサッカライド、好ましくは０．１％より少ないポリサッカライドを産生する、ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール産生モニリエラ株に関する。
【００２３】
更に、本発明は、モニリエラトメントサ株、好ましくはブタペスト条約に基づきＢＣＣＭ／ＭＵＣＬ
【００２４】
【外１】
で１９９７年３月２８日に番号ＭＵＣＬ４０３８５として寄託されたモニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４である、ポリサッカライドに陰性なエリスリトール産生モニリエラ株に関する。
【００２５】
したがって、本発明は、微生物を用いる醗酵によるエリスリトールの製造及びこのエリスリトール結晶の回収方法であって、これが次の工程：
ａ）エリスリトール含有量に対して１％より少ないポリサッカライド、好ましくは０．１％より少ないポリサッカライドを産生する、ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール産生菌株を微生物として使用し、
ｂ）醗酵培地を調製し、
ｃ）上記微生物を醗酵培地に添加し、
ｄ）少なくとも５０ｇ／Ｌ、好ましくは１００ｇ／Ｌより多いエリスリトールが醗酵培地中に得られるまで微生物を増殖させ、
ｅ）醗酵培地から微生物を除去し、
ｆ）未精製の微生物不含醗酵培地を８０％ｗ／ｗより高い乾燥物質に濃縮し、
ｇ）エリスリトールを結晶化し、そして
ｈ）エリスリトール結晶を集める
ことから成ることを特徴とする、上記方法を開示する。
【００２６】
通常、かなりの量のポリサッカライドの存在のために、結晶化前に未精製の微生物不含醗酵培地を濃縮することは、急速に増加する培地の粘度をもたらす。結果として、結晶化速度は著しく低下して、それによって高純度の結晶を得るのは極めて困難になる。というのは母液からの結晶塊の分離が徐々に進行するからである。
【００２７】
エリスリトール含有量に対して２％より多いポリサッカライドの存在はあまりに多いので、８０％より高い乾燥物質への直接濃縮を行うことができない。
【００２８】
更に、これらのポリサッカライドはエリスリトールの結晶化の間に沈殿し、この様にして得られたエリスリトール結晶がこのポリサッカライドによって汚染される。これらの不純な結晶の再溶解は、溶液を混濁させる。
【００２９】
したがって結局、ポリサッカライドの沈殿を防止するためにある程度培地を濃縮することは避けられないが、これによってエリスリトールの結晶化収率は著しく低下する。エリスリトールの結晶化収率は、乾燥物質との相関関係で決まる。あまりにも低い乾燥物質は低い結晶収率を生じ、そして高度に粘性の母液の再循環はポリサッカライドの存在によって行われない。
【００３０】
ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール産生菌株は、モニリエラ属、トリコノスポロイデス属及びトリコノスポロン属から選ばれる。
【００３１】
ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール産生菌株は、エリスリトール含有量に対して１％より少ないポリサッカライド、好ましくは０．１％より少ないポリサッカライドを産生する。野生型株（ＣＢＳ４６１．６７）の存在下に、エリスリトール含有量に対して１０．５ｇ／Ｌのポリサッカライド又は３３％のポリサッカライドが集められる。
【００３２】
ポリサッカライドの含有量は高性能液体クロマトグラフィー（カチオン交換樹脂ＳｈｏｄｅｘＫＣ−８１１Ｈ+ - 型、０．０１％硫酸溶液で溶離及び溶離ピークの面積百分率を測定）によって測定する。ポリサッカライド分画は培地に添加される塩及びキサンタンガムで共溶離されるので、生じたポリサッカライドの実際の含有量は醗酵の終了時に、すなわちバイオマスの除去後に測定される最終レベルからゼロレベル（＝醗酵の出発時点で測定された塩及びキサンタンガム基本量（background）) を減じることによって決定される。
【００３３】
醗酵培地を調製するのに使用される原料は、炭素源として９０％より多いグルコースを含有するデンプン加水分解物、及びコーンスティープリカー（corn steep liquor)、酵母抽出物及び（又は）窒素源として硫酸アンモニウムである。キサンタンガム及び（又は）シリコーン油を添加して発泡を抑制することができる。
【００３４】
本発明は、未精製の微生物不含醗酵培地を少なくとも８５％ｗ／ｗ、更に好ましくは９０％ｗ／ｗより高い乾燥物質に濃縮して、集められたエリスリトール結晶が少なくとも９８％ｗ／ｗ、更に好ましくは９９％ｗ／ｗの純度を有する方法に関する。
【００３５】
未精製の微生物不含醗酵培地を、８０％ｗ／ｗ以上の乾燥物質に、好ましくは少なくとも８５％ｗ／ｗ、更に好ましくは９０％ｗ／ｗ以上の乾燥物質に直ちに濃縮し、２０℃に徐々に冷却することによって９８−９９％ｗ／ｗの純度を有するエリスリトール結晶が得られる。高い乾燥物質量での直接結晶化は高い結晶収率を生じ、一方母液をポリサッカライドの不在のために晶析装置の正面に再循環することができる。ポリサッカライドを実質上含有しない未精製の微生物不含醗酵ブロスは高い乾燥物質量への濃縮の間、粘度の増加を受けることがなく、そして醗酵の副生成物であるグリセロールの存在は９０％以上のこの様に高い乾燥物質量への濃縮に有利に働くことができる。
【００３６】
濃縮及び結晶化の前に、バイオマス（微生物）を通常公知の濾過法、たとえば遠心分離、プレコートされた（pre-coated) 減圧濾過又はマイクロ濾過（microfilitration) によって除去する。得られた未精製の微生物不含醗酵ブロスをたとえばエリスリトール結晶への濃縮及び結晶化のために使用する。残存不純物を除去するための精製工程、たとえば活性炭又はイオン交換樹脂を用いる処理はこの方法に含まれない。
【００３７】
本発明は、微生物を１０日未満で増殖させることができ、それにもかかわらず高いエリスリトール濃度が得られる方法に関する。
【００３８】
本発明は、醗酵培地を発泡されたカラムリアクター又はエアーリフト中で調製する方法に関する。培地は粘性ではなく、エリスリトールを産生するための醗酵は低いエネルギー供給でこの様に簡単な醗酵リアクター中で行うことができる。典型的には、本発明の方法はモニリエラ属、トリコノスポロイデス属及びトリコノスポロン属から選ばれた菌株を用いて好気性条件下で行われる。好ましくはモニリエラトメントサバルポリニス、及びトリコノスポロイデスメガチリエンシスの突然変異株、さらに好ましくは突然変異株モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４が適用される。突然変異株は、古典的な突然変異誘発、たとえばＵＶ照射、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、硫酸ジエチル、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、アクリジン処理等々によって得ることができる。エリスリトール含有量に対して１％より少ないポリサッカライドを産生する、ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール産生菌株は、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）の存在下での突然変異誘発によって得られるのが好ましい。単離されたコロニーを５日間培養し、細胞不含上澄みをイソプロパノールと混合し、生じた沈殿を乾燥させて、秤量する。最少量の沈殿を生じるコロニーを選択する。
【００３９】
モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４を用いる醗酵は、エリスリトール含有量に対して１ｇ／Ｌより低いか又は１％より少ないポリサッカライド、好ましくは０．１％より少ないポリサッカライドを有するポリサッカライド含有量をもたらす。
【００４０】
本発明はエリスリトール含有量に対して１％より少ないポリサッカライド、好ましくは０．１％より少ないポリサッカライドを産生する、ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール産生モニリエラ株に関する。
【００４１】
本発明は、モニリエラトメントサ株、好ましくはブタペスト条約に基づきＢＣＣＭ／ＭＵＣＬ
【００４２】
【外２】
で１９９７年３月２８日に番号ＭＵＣＬ４０３８５として寄託されたモニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４である、ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール産生モニリエラ株に関する。
【００４３】
ポリサッカライドの不在は醗酵に、微生物の除去に及び結晶化に実質的利点を生じる：
１．培地は粘性ではなく、エリスリトールを産生する醗酵は低いエネルギー供給の簡単な醗酵リアクターで、たとえばエアーリフト又は発泡されたカラムリアクター、好ましくは発泡されたカラムリアクター中で行うことができる。
２．適用される突然変異菌株は、復帰突然変異に対して極めて安定である。
３．比較的低い粘度のために、より良好な酸素移行が得られ、より低いエタノール産生及び増加されたエリスリトール収率がもたらされる。２５０ｇ／Ｌ又は３００ｇ／Ｌより高いエリスリトール濃度を達成することができる。これらの高いエリスリトール濃度が、１０日未満の醗酵時間で得られる。
４．生じるポリサッカライドの不在は、細胞内でより良好な拡散を可能にし、それによって醗酵がより高い濃度の窒素源の存在下で行うことができる。これはまた醗酵時間をかなり減少させる。
５．比較的低い粘度は改良されかつより速いバイオマス濾過をもたらし、未精製の微生物不含醗酵ブロスは活性炭及びイオン交換樹脂での前処理をすることなく高い乾燥物質への濃縮、エリスリトールの結晶化及び収集に直接委ねられる。
６．未精製の微生物不含醗酵ブロスを８０％ｗ／ｗ以上の乾燥物質に直接濃縮し、エリスリトールの高い結晶収率を生じる。
７．少なくとも８５％の高いエリスリトール回収が得られ、そしてより少量の希釈された廃水（waste stream) を生じる。
８．９８〜９９％ｗ／ｗ純度を有するエリスリトール結晶が得られる。
【００４４】
得られたエリスリトール結晶を常法にしたがって、たとえば流動床型乾燥機を用いて乾燥することができる。
【００４５】
純度を９９．５％ｗ／ｗ以上に増加させるために、９８〜９９％ｗ／ｗ純度であるエリスリトール結晶（高性能液体クロマトグラフィーによる測定（カチオン交換樹脂ＳｈｐｄｅｘＫＣ−８１１Ｈ+ - 型、０．０１％硫酸溶液で溶離及び溶離ピークの面積百分率を測定）を、第二濃縮及び結晶化の前に再溶解させ、活性炭及び（又は）イオン交換樹脂で脱色し、脱塩することができる。母液を最初の結晶化工程に再循環することができる。
【００４６】
本発明を次の例にしたがって説明する。
【００４７】
例１に、突然変異株モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４を得るための突然変異誘発法を示す。
【００４８】
例２に、天然菌株ＣＢＳ４６１．６７を用いる植菌及び醗酵を示し、そしてエリスリトールの収率及びポリサッカライドの含有量を突然変異株モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４を用いた醗酵と比較する（例４）。
【００４９】
例３に、欧州特許第０１３６９０５号明細書に記載された多量に胞子形成する亜株を用いる植菌及び醗酵を示し、そして微生物不含醗酵ブロスの粘度を突然変異株モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４を用いて得らた微生物醗酵ブロスの粘度と比較する（例４）。
【００５０】
醗酵ブロスの粘度は、醗酵ブロス中に存在するポリサッカライドの含有量と共に増加する。
【００５１】
例５に、モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４のパイロット規模での醗酵、ついでエリスリトール結晶の回収（下流処理（downstream processing)）を示す。
【００５２】
【実施例】
本発明を以下の例によって詳細に説明する。
例１−モニリエラ トメントサ バル ポリニス ＴＣＶ ３６４を得るための突然変異誘発
モニリエラポリニスを、振盪フラスコ中で３０％グルコース及び１％酵母抽出物を含有する培地上で３０℃で培養する。２日後に飽和Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）溶液１ｍＬをこの培養液に添加し、攪拌下に１時間インキュベートする。細胞を遠心分離し、新たな培地で２回洗浄する。細胞を滅菌水中で希釈し、２０％グルコース、１％酵母抽出物及び２％寒天を含有する固形培地上に塗り、１週間３０℃でインキュベートする。
【００５３】
単離されたコロニーを５日間液体培地中で培養する。
【００５４】
細胞を遠心分離によって分離し、細胞不含上澄みをイソプロパノール２部と混合する。沈殿を乾燥させて、秤量する。
【００５５】
最少量の沈殿を生じるコロニーを選ぶ。
比較例２−ポリサッカライド醗酵−天然株ＣＢＳ４６１．６７
１．植菌−エルレンマイヤー
結晶性デキストロース（Ｃ☆Ｄｅｘ０２００１）を３０％ｗ／ｖの濃度が達成されるまで水５０ｍＬに溶解する。酵母抽出物（Ｏｈｌｙ）１％ｗ／ｖを添加する。培地にペトリ皿の数個のコロニーを植菌する。温度は３０℃であり、そして培地全体を１００振盪／分で３日間振盪する。
２．醗酵
総処理容量は１．２Ｌであり、結晶性デキストロース（Ｃ☆Ｄｅｘ０２００１）を３０％ｗ／ｖの濃度が達成されるまで水に添加する。水２００ｍＬ中で別個に滅菌されたコーンスティープリカー（Ｃ☆Ｐｌｕｓ１５８５５、５％）５％ｗ／ｖを添加し、ついでエルレンマイヤー中で調製された植菌物、シルコーン油（ＳＡＧ）５００ｐｐｍ及びキサンタン５００ｐｐｍを添加する。温度は３５℃であり、ブロスを６００〜１１０００ｒｐｍで攪拌する。総醗酵時間は１２０時間である。
【００５６】
ポリサッカライド及びエリスリトールの含有量をＨＰＬＣによって測定し、その結果を表１に示す。
比較例３−欧州特許第０１３６８０５号明細書に記載された多量に胞子形成する亜株を用いる醗酵ブロスの粘度
植菌物を例２に記載したのと同一の反応条件を適用して調製する。天然株の代わりに、欧州特許第０１３６８０５号明細書に記載された多量に胞子形成する亜株のコロニーを植菌する。醗酵条件は例２記載したのと類似する。
【００５７】
微生物不含醗酵ブロスの粘度を、突然変異株モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４を用いて得られた微生物不含醗酵ブロスの粘度と比較する。
【００５８】
その結果を表２に示す。
例４−ポリサッカライド生成−突然変異株ＴＣＶ３６４
植菌物を例２に記載したのと同一の反応条件を適用して調製する。天然株の代わりに、突然変異株モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４のコロニーを植菌する。醗酵条件は例２記載したのと類似する。
【００５９】
ポリサッカライド及びエリスリトールの含有量をＨＰＬＣによって測定し、その結果を表１に示す。
例５−醗酵＋下流処理
醗酵
６０００Ｌのバブルカラムリアクターを１２１℃で３０分間滅菌する。滅菌水を添加し、植菌後の最終濃度（３６００Ｌを基礎として算出）が２２０〜２５０ｇ／Ｌになるまで、デンプン加水分解物（Ｃ☆Ｐｌｕｓ０２６６８、９５％デキストロース、７０％ｄ．ｓ．）を添加する。
【００６０】
ブロスの温度を３５℃で一定に保つ。滅菌空気をリアクターに注入して、５〜１５ｃｍ／秒のみかけのガス速度が得られる。この容量に３日目の予備培養液（その量は５００Ｌ〜１０００Ｌである。）で植菌する。
【００６１】
コーンスティープリカー（Ｃ☆Ｐｌｕｓ１５８５５、５０％ｄ．ｓ．）４．５〜５％ｗ／ｖ、シリコーン油（ＳＡＧ４７１）４００〜５００ｐｐｍ及びキサンタン４００〜５００ｐｐｍを１２１℃で３０分間滅菌し（濃度を最終容量３６００Ｌを基礎として算出）、醗酵ブロスに添加する。
【００６２】
更に３０〜４０時間後、低温滅菌されたデンプン加水分解物（Ｃ☆Ｐｌｕｓ０２６６８、９５％デキストロース、７０％ｄ．ｓ．）の添加を開始して、デキトロースレベルを２０〜１００ｇ／Ｌに維持する。ブロスの最終容量が４８００Ｌになるまでこの添加を続ける。ブロス中のデキトロースレベルが２ｇ／Ｌ未満、すなわち１０日未満でこの値になるまで醗酵を続ける。
【００６３】
エリスリトールの最終濃度は２５０〜３００ｇ／Ｌである。０．４２％のポリサッカライド（エリスリトール含有量に対して）が生じる。
結晶化
プレコートされた回転減圧フィルター上での濾過によって、バイオマスを醗酵ブロスから除去する。清澄化された醗酵ブロスをバッチ減圧蒸発器中で９０℃で９０％ｗ／ｗの総乾燥固体含有量に濃縮する。
【００６４】
この清澄化された醗酵ブロスを攪拌されるバッチ冷却結晶化器に移す。冷却は６時間かかって９０℃から２０℃に直線的に進行する。エリスリトール結晶をバッチ遠心分離によって回収する。結晶を遠心分離機中で冷水を用いて洗浄する（水と結晶の割合は１５／１００である。）。エリスリトール回収率は８５％であり、結晶の純度は９９．１％ｗ／ｗである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、エリスリトール結晶の産生及び回収方法、更に詳しくは同時に比較的高い粘性のポリサッカライドを産生することなくエリスリトールを産生する醗酵法────この方法は未精製の微生物不含醗酵培養液からの直接結晶化によってエリスリトール結晶を回収するのに好都合である───に関する。
【０００２】
【従来の技術】
醗酵によってエリスリトールを産生するエリスリトール産生酵母はモニリエラ属、トリコノスポロイデス(Trichonosporoides) 属、又はトリコノスポロン(Trichonosporon)属に属する酵母であって、一般に使用される種はモニリエラトメントサバルポリニス、及びトリコノスポロイデスメガチリエンシス（Trichonosporoides megachiliensis) である。
【０００３】
水性培地中でエリスリトール産生酵母の１種を培養することによって得られた培地からのエリスリトールの慣用の単離及び回収方法は、この培地を前処理、たとえば濾過によってバイオマスを除去し、活性炭を用いて脱色し、イオン交換樹脂を用いて培地を脱塩及び脱色し、ついで培地を濃縮して冷却し、これによって目的エリスリトールを結晶化させることから成る。
【０００４】
エリスリトールの単離、結晶化及び（又は）回収に影響を及ぼす不純物は次の成分を含有する：
・ポリオール、たとえばグリセロール及びリビトール、
・出発デンプン加水分解物中に含有されるジサッカライド及び高級ジサッカライド並びにこれらから生じる反応生成物を含む、オリゴサッカライド、
・酵母によって産生された粘性菌体ポリサッカライド。
【０００５】
ポリサッカライド生成のために、培地の粘度が増加する。これは減少された酸素移行速度を生じ、嫌気性醗酵によって炭水化物源の一部はエタノールに変化し、それによってエリスリトールの産生が減少する。更に、非常に粘性の醗酵ブロス(broth) は細胞を濾過し除去する点で問題を生じ、そしてポリオール回収は極めて困難である。
【０００６】
欧州特許第０３２７０１６号明細書に、アルカリ金属又はアンモニウム型強酸性カチオン交換樹脂が充填されたクロマトグラフィー分離カラムに微生物不含醗酵ブロスを通過させることによって、エリスリトール含有培地から極めて純粋なエリスリトールを回収する方法が記載されている。これによって種々の塩、着色物質、種々のオリゴサッカライド及びポリサッカライドが得られる。この方法は、好気性条件下に水性培地中でエリスリトール産生微生物を培養し、得られた培地から細胞を除去し、アルカリ金属又はアンモニウム型強酸性カチオン交換樹脂が充填された分離カラムに得られた上澄みを通過させ、これを水で溶離し、これから主成分としてエリスリトールを含有する分画を集め、ついでこれらの分画からエリスリトールを回収する。この方法は、極めて多量の水を消費しなければならず、したがって分離された成分は非常に希釈されており、その結果として蒸発のための経費が高くなる。更に、このような分離装置に出資する費用も高くなる。
【０００７】
欧州特許第０９０８５２３号明細書に記載された発明は、高純度のエリスリトール結晶の製造方法に関する。この方法は結晶化工程と結晶分離工程から成り、その際エリスリトール含有水溶液のエリスリトール濃度を結晶化工程の開始時に３０〜６０重量％に調整する。結晶化工程の前に、この方法は微生物分離工程及びクロマトグラフィー分離を含む。
【０００８】
特開平１０−２８７６０３号公報に関するダーウェント社のアブストラクトに、生じたポリサッカライド及び不純物を加水分解するための、微生物不含のエリスリトール醗酵ブロスの酸性処理法が記載されている。この加水分解は、ある種の不純物をより小さい粘性のその他の副生成物に変えるが、原則的に全体の純度はこれによって増加されない。これらの副生成物は慣用の分離方法、たとえば活性炭及びイオン交換体処理によって引き続き除去される。
【０００９】
特開平１−２１５２９３号公報に関するダーウェント社のアブストラクトに、限外濾過膜を用いるポリサッカライド含有醗酵ブロスからのエリスリトールの回収法が記載されている。微生物不含醗酵ブロスを濁らせるポリサッカライドは１，０００〜１００，０００ダルトンのカットオフ（cut-off)を有する膜を用いる限外濾過によって完全に除去されて、エリスリトールが精製された培地から回収される。
【００１０】
米国特許第４９０６５６９号明細書に記載の発明は、エリスリトール産生微生物の培地からの高い結晶化収率での極めて純粋なエリスリトールの単離及び回収方法であって、種々の不純物及び副生成物、たとえば種々の塩、着色物質及びポリサッカライドを分離し、除去することからなる、上記方法に関する。この場合、不純物及び副生成物は強酸性カチオン交換樹脂を用いるクロマトグラフィー分離によって除去される。
【００１１】
引用されたすべての上記特許文献によれば、生じるポリサッカライドを除去するための精製工程、たとえばイオン交換樹脂、カラムクロマトグラフィー、酸加水分解又は限外濾過による処理がいずれにしても要求される。
【００１２】
欧州特許第０１３６８０５号明細書に、酵母様真菌；モニリエラトメントサバルポリニスの多量の胞子形成コロニーの存在下での醗酵法において、エリスリトール含有量に対して２．３−３．５％のポリサッカライドが生じることが記載されている。少量の胞子形成コロニーの存在下で、エリスリトール含有量に対して１６−２５％までのポリサッカライドが生じる。多量の胞子形成コロニーを用いた場合、ポリサッカライドの量はエリスリトール含有量に対して２．３−３．５％にすでに減少するが、培養ブロスを６０％乾燥物質に及び８０％乾燥物質に濃縮する前に精製することが記載されている。エリスリトールはこれから結晶化される。更に、１３日までの長い醗酵時間が、３４％のエリスリトール収率を達成するのに必要である。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、微生物不含醗酵培地を精製することなく醗酵させて、エリスリトール結晶を回収することによるエリスリトールの産生方法に対する要求がある。この回収方法は、１）広範な精製、２）多量の廃棄蒸気の発生、３）高エネルギー要求がなくて、高度に純粋なエリスリトール結晶の良好な回収をもたらさなければならない。
【００１４】
【課題を解決する手段】
本発明はこのような方法を提供するものである。
【００１５】
本発明は、微生物を用いる醗酵によるエリスリトールの産生及びこのエリスリトール結晶の回収方法であって、これが次の工程：
ａ）エリスリトール含有量に対して１％より少ないポリサッカライド、好ましくは０．１％より少ないポリサッカライドを産生する、ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール（polysaccharide negative erythritol) 産生菌株を微生物として使用し、
ｂ）醗酵培地を調製し、
ｃ）上記微生物を醗酵培地に添加し、
ｄ）少なくとも５０ｇ／Ｌのエリスリトールが醗酵培地中に得られるまで微生物を増殖させ、
ｅ）醗酵培地から微生物を除去し、
ｆ）未精製の微生物不含醗酵培地を８０％ｗ／ｗより高い乾燥物質に濃縮し、
ｇ）エリスリトールを結晶化し、そして
ｈ）エリスリトール結晶を集める
ことから成ることを特徴とする、上記方法を開示する。
【００１６】
本発明は、未精製の微生物醗酵培地を少なくとも８５％ｗ／ｗ、更に好ましくは９０％ｗ／ｗより高い乾燥物質に濃縮させる方法に関する。
【００１７】
更に、本発明に、エリスリトール結晶を少なくとも８５％の回収率で集める方法を開示する。
【００１８】
本発明は、エリスリトール結晶が少なくとも９８％ｗ／ｗ、好ましくは９９％ｗ／ｗの純度を有する方法に関する。
【００１９】
本発明は、微生物を１０日未満で増殖させる方法に関する。
【００２０】
本発明は、醗酵培地を発泡されたカラムリアクター又はエアーリフト中で調製する方法に関する。
【００２１】
更に、本発明は、工程ａ）で、モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４を使用する方法を開示する。
【００２２】
また本発明は、エリスリトール含有量に対して１％より少ないポリサッカライド、好ましくは０．１％より少ないポリサッカライドを産生する、ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール産生モニリエラ株に関する。
【００２３】
更に、本発明は、モニリエラトメントサ株、好ましくはブタペスト条約に基づきＢＣＣＭ／ＭＵＣＬ
【００２４】
【外１】
【００２５】
したがって、本発明は、微生物を用いる醗酵によるエリスリトールの製造及びこのエリスリトール結晶の回収方法であって、これが次の工程：
ａ）エリスリトール含有量に対して１％より少ないポリサッカライド、好ましくは０．１％より少ないポリサッカライドを産生する、ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール産生菌株を微生物として使用し、
ｂ）醗酵培地を調製し、
ｃ）上記微生物を醗酵培地に添加し、
ｄ）少なくとも５０ｇ／Ｌ、好ましくは１００ｇ／Ｌより多いエリスリトールが醗酵培地中に得られるまで微生物を増殖させ、
ｅ）醗酵培地から微生物を除去し、
ｆ）未精製の微生物不含醗酵培地を８０％ｗ／ｗより高い乾燥物質に濃縮し、
ｇ）エリスリトールを結晶化し、そして
ｈ）エリスリトール結晶を集める
ことから成ることを特徴とする、上記方法を開示する。
【００２６】
通常、かなりの量のポリサッカライドの存在のために、結晶化前に未精製の微生物不含醗酵培地を濃縮することは、急速に増加する培地の粘度をもたらす。結果として、結晶化速度は著しく低下して、それによって高純度の結晶を得るのは極めて困難になる。というのは母液からの結晶塊の分離が徐々に進行するからである。
【００２７】
エリスリトール含有量に対して２％より多いポリサッカライドの存在はあまりに多いので、８０％より高い乾燥物質への直接濃縮を行うことができない。
【００２８】
更に、これらのポリサッカライドはエリスリトールの結晶化の間に沈殿し、この様にして得られたエリスリトール結晶がこのポリサッカライドによって汚染される。これらの不純な結晶の再溶解は、溶液を混濁させる。
【００２９】
したがって結局、ポリサッカライドの沈殿を防止するためにある程度培地を濃縮することは避けられないが、これによってエリスリトールの結晶化収率は著しく低下する。エリスリトールの結晶化収率は、乾燥物質との相関関係で決まる。あまりにも低い乾燥物質は低い結晶収率を生じ、そして高度に粘性の母液の再循環はポリサッカライドの存在によって行われない。
【００３０】
ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール産生菌株は、モニリエラ属、トリコノスポロイデス属及びトリコノスポロン属から選ばれる。
【００３１】
ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール産生菌株は、エリスリトール含有量に対して１％より少ないポリサッカライド、好ましくは０．１％より少ないポリサッカライドを産生する。野生型株（ＣＢＳ４６１．６７）の存在下に、エリスリトール含有量に対して１０．５ｇ／Ｌのポリサッカライド又は３３％のポリサッカライドが集められる。
【００３２】
ポリサッカライドの含有量は高性能液体クロマトグラフィー（カチオン交換樹脂ＳｈｏｄｅｘＫＣ−８１１Ｈ+ - 型、０．０１％硫酸溶液で溶離及び溶離ピークの面積百分率を測定）によって測定する。ポリサッカライド分画は培地に添加される塩及びキサンタンガムで共溶離されるので、生じたポリサッカライドの実際の含有量は醗酵の終了時に、すなわちバイオマスの除去後に測定される最終レベルからゼロレベル（＝醗酵の出発時点で測定された塩及びキサンタンガム基本量（background）) を減じることによって決定される。
【００３３】
醗酵培地を調製するのに使用される原料は、炭素源として９０％より多いグルコースを含有するデンプン加水分解物、及びコーンスティープリカー（corn steep liquor)、酵母抽出物及び（又は）窒素源として硫酸アンモニウムである。キサンタンガム及び（又は）シリコーン油を添加して発泡を抑制することができる。
【００３４】
本発明は、未精製の微生物不含醗酵培地を少なくとも８５％ｗ／ｗ、更に好ましくは９０％ｗ／ｗより高い乾燥物質に濃縮して、集められたエリスリトール結晶が少なくとも９８％ｗ／ｗ、更に好ましくは９９％ｗ／ｗの純度を有する方法に関する。
【００３５】
未精製の微生物不含醗酵培地を、８０％ｗ／ｗ以上の乾燥物質に、好ましくは少なくとも８５％ｗ／ｗ、更に好ましくは９０％ｗ／ｗ以上の乾燥物質に直ちに濃縮し、２０℃に徐々に冷却することによって９８−９９％ｗ／ｗの純度を有するエリスリトール結晶が得られる。高い乾燥物質量での直接結晶化は高い結晶収率を生じ、一方母液をポリサッカライドの不在のために晶析装置の正面に再循環することができる。ポリサッカライドを実質上含有しない未精製の微生物不含醗酵ブロスは高い乾燥物質量への濃縮の間、粘度の増加を受けることがなく、そして醗酵の副生成物であるグリセロールの存在は９０％以上のこの様に高い乾燥物質量への濃縮に有利に働くことができる。
【００３６】
濃縮及び結晶化の前に、バイオマス（微生物）を通常公知の濾過法、たとえば遠心分離、プレコートされた（pre-coated) 減圧濾過又はマイクロ濾過（microfilitration) によって除去する。得られた未精製の微生物不含醗酵ブロスをたとえばエリスリトール結晶への濃縮及び結晶化のために使用する。残存不純物を除去するための精製工程、たとえば活性炭又はイオン交換樹脂を用いる処理はこの方法に含まれない。
【００３７】
本発明は、微生物を１０日未満で増殖させることができ、それにもかかわらず高いエリスリトール濃度が得られる方法に関する。
【００３８】
本発明は、醗酵培地を発泡されたカラムリアクター又はエアーリフト中で調製する方法に関する。培地は粘性ではなく、エリスリトールを産生するための醗酵は低いエネルギー供給でこの様に簡単な醗酵リアクター中で行うことができる。典型的には、本発明の方法はモニリエラ属、トリコノスポロイデス属及びトリコノスポロン属から選ばれた菌株を用いて好気性条件下で行われる。好ましくはモニリエラトメントサバルポリニス、及びトリコノスポロイデスメガチリエンシスの突然変異株、さらに好ましくは突然変異株モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４が適用される。突然変異株は、古典的な突然変異誘発、たとえばＵＶ照射、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、硫酸ジエチル、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、アクリジン処理等々によって得ることができる。エリスリトール含有量に対して１％より少ないポリサッカライドを産生する、ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール産生菌株は、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）の存在下での突然変異誘発によって得られるのが好ましい。単離されたコロニーを５日間培養し、細胞不含上澄みをイソプロパノールと混合し、生じた沈殿を乾燥させて、秤量する。最少量の沈殿を生じるコロニーを選択する。
【００３９】
モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４を用いる醗酵は、エリスリトール含有量に対して１ｇ／Ｌより低いか又は１％より少ないポリサッカライド、好ましくは０．１％より少ないポリサッカライドを有するポリサッカライド含有量をもたらす。
【００４０】
本発明はエリスリトール含有量に対して１％より少ないポリサッカライド、好ましくは０．１％より少ないポリサッカライドを産生する、ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール産生モニリエラ株に関する。
【００４１】
本発明は、モニリエラトメントサ株、好ましくはブタペスト条約に基づきＢＣＣＭ／ＭＵＣＬ
【００４２】
【外２】
【００４３】
ポリサッカライドの不在は醗酵に、微生物の除去に及び結晶化に実質的利点を生じる：
１．培地は粘性ではなく、エリスリトールを産生する醗酵は低いエネルギー供給の簡単な醗酵リアクターで、たとえばエアーリフト又は発泡されたカラムリアクター、好ましくは発泡されたカラムリアクター中で行うことができる。
２．適用される突然変異菌株は、復帰突然変異に対して極めて安定である。
３．比較的低い粘度のために、より良好な酸素移行が得られ、より低いエタノール産生及び増加されたエリスリトール収率がもたらされる。２５０ｇ／Ｌ又は３００ｇ／Ｌより高いエリスリトール濃度を達成することができる。これらの高いエリスリトール濃度が、１０日未満の醗酵時間で得られる。
４．生じるポリサッカライドの不在は、細胞内でより良好な拡散を可能にし、それによって醗酵がより高い濃度の窒素源の存在下で行うことができる。これはまた醗酵時間をかなり減少させる。
５．比較的低い粘度は改良されかつより速いバイオマス濾過をもたらし、未精製の微生物不含醗酵ブロスは活性炭及びイオン交換樹脂での前処理をすることなく高い乾燥物質への濃縮、エリスリトールの結晶化及び収集に直接委ねられる。
６．未精製の微生物不含醗酵ブロスを８０％ｗ／ｗ以上の乾燥物質に直接濃縮し、エリスリトールの高い結晶収率を生じる。
７．少なくとも８５％の高いエリスリトール回収が得られ、そしてより少量の希釈された廃水（waste stream) を生じる。
８．９８〜９９％ｗ／ｗ純度を有するエリスリトール結晶が得られる。
【００４４】
得られたエリスリトール結晶を常法にしたがって、たとえば流動床型乾燥機を用いて乾燥することができる。
【００４５】
純度を９９．５％ｗ／ｗ以上に増加させるために、９８〜９９％ｗ／ｗ純度であるエリスリトール結晶（高性能液体クロマトグラフィーによる測定（カチオン交換樹脂ＳｈｐｄｅｘＫＣ−８１１Ｈ+ - 型、０．０１％硫酸溶液で溶離及び溶離ピークの面積百分率を測定）を、第二濃縮及び結晶化の前に再溶解させ、活性炭及び（又は）イオン交換樹脂で脱色し、脱塩することができる。母液を最初の結晶化工程に再循環することができる。
【００４６】
本発明を次の例にしたがって説明する。
【００４７】
例１に、突然変異株モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４を得るための突然変異誘発法を示す。
【００４８】
例２に、天然菌株ＣＢＳ４６１．６７を用いる植菌及び醗酵を示し、そしてエリスリトールの収率及びポリサッカライドの含有量を突然変異株モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４を用いた醗酵と比較する（例４）。
【００４９】
例３に、欧州特許第０１３６９０５号明細書に記載された多量に胞子形成する亜株を用いる植菌及び醗酵を示し、そして微生物不含醗酵ブロスの粘度を突然変異株モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４を用いて得らた微生物醗酵ブロスの粘度と比較する（例４）。
【００５０】
醗酵ブロスの粘度は、醗酵ブロス中に存在するポリサッカライドの含有量と共に増加する。
【００５１】
例５に、モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４のパイロット規模での醗酵、ついでエリスリトール結晶の回収（下流処理（downstream processing)）を示す。
【００５２】
【実施例】
本発明を以下の例によって詳細に説明する。
例１−モニリエラ トメントサ バル ポリニス ＴＣＶ ３６４を得るための突然変異誘発
モニリエラポリニスを、振盪フラスコ中で３０％グルコース及び１％酵母抽出物を含有する培地上で３０℃で培養する。２日後に飽和Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）溶液１ｍＬをこの培養液に添加し、攪拌下に１時間インキュベートする。細胞を遠心分離し、新たな培地で２回洗浄する。細胞を滅菌水中で希釈し、２０％グルコース、１％酵母抽出物及び２％寒天を含有する固形培地上に塗り、１週間３０℃でインキュベートする。
【００５３】
単離されたコロニーを５日間液体培地中で培養する。
【００５４】
細胞を遠心分離によって分離し、細胞不含上澄みをイソプロパノール２部と混合する。沈殿を乾燥させて、秤量する。
【００５５】
最少量の沈殿を生じるコロニーを選ぶ。
比較例２−ポリサッカライド醗酵−天然株ＣＢＳ４６１．６７
１．植菌−エルレンマイヤー
結晶性デキストロース（Ｃ☆Ｄｅｘ０２００１）を３０％ｗ／ｖの濃度が達成されるまで水５０ｍＬに溶解する。酵母抽出物（Ｏｈｌｙ）１％ｗ／ｖを添加する。培地にペトリ皿の数個のコロニーを植菌する。温度は３０℃であり、そして培地全体を１００振盪／分で３日間振盪する。
２．醗酵
総処理容量は１．２Ｌであり、結晶性デキストロース（Ｃ☆Ｄｅｘ０２００１）を３０％ｗ／ｖの濃度が達成されるまで水に添加する。水２００ｍＬ中で別個に滅菌されたコーンスティープリカー（Ｃ☆Ｐｌｕｓ１５８５５、５％）５％ｗ／ｖを添加し、ついでエルレンマイヤー中で調製された植菌物、シルコーン油（ＳＡＧ）５００ｐｐｍ及びキサンタン５００ｐｐｍを添加する。温度は３５℃であり、ブロスを６００〜１１０００ｒｐｍで攪拌する。総醗酵時間は１２０時間である。
【００５６】
ポリサッカライド及びエリスリトールの含有量をＨＰＬＣによって測定し、その結果を表１に示す。
比較例３−欧州特許第０１３６８０５号明細書に記載された多量に胞子形成する亜株を用いる醗酵ブロスの粘度
植菌物を例２に記載したのと同一の反応条件を適用して調製する。天然株の代わりに、欧州特許第０１３６８０５号明細書に記載された多量に胞子形成する亜株のコロニーを植菌する。醗酵条件は例２記載したのと類似する。
【００５７】
微生物不含醗酵ブロスの粘度を、突然変異株モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４を用いて得られた微生物不含醗酵ブロスの粘度と比較する。
【００５８】
その結果を表２に示す。
例４−ポリサッカライド生成−突然変異株ＴＣＶ３６４
植菌物を例２に記載したのと同一の反応条件を適用して調製する。天然株の代わりに、突然変異株モニリエラトメントサバルポリニスＴＣＶ３６４のコロニーを植菌する。醗酵条件は例２記載したのと類似する。
【００５９】
ポリサッカライド及びエリスリトールの含有量をＨＰＬＣによって測定し、その結果を表１に示す。
醗酵
６０００Ｌのバブルカラムリアクターを１２１℃で３０分間滅菌する。滅菌水を添加し、植菌後の最終濃度（３６００Ｌを基礎として算出）が２２０〜２５０ｇ／Ｌになるまで、デンプン加水分解物（Ｃ☆Ｐｌｕｓ０２６６８、９５％デキストロース、７０％ｄ．ｓ．）を添加する。
【００６０】
ブロスの温度を３５℃で一定に保つ。滅菌空気をリアクターに注入して、５〜１５ｃｍ／秒のみかけのガス速度が得られる。この容量に３日目の予備培養液（その量は５００Ｌ〜１０００Ｌである。）で植菌する。
【００６１】
コーンスティープリカー（Ｃ☆Ｐｌｕｓ１５８５５、５０％ｄ．ｓ．）４．５〜５％ｗ／ｖ、シリコーン油（ＳＡＧ４７１）４００〜５００ｐｐｍ及びキサンタン４００〜５００ｐｐｍを１２１℃で３０分間滅菌し（濃度を最終容量３６００Ｌを基礎として算出）、醗酵ブロスに添加する。
【００６２】
更に３０〜４０時間後、低温滅菌されたデンプン加水分解物（Ｃ☆Ｐｌｕｓ０２６６８、９５％デキストロース、７０％ｄ．ｓ．）の添加を開始して、デキトロースレベルを２０〜１００ｇ／Ｌに維持する。ブロスの最終容量が４８００Ｌになるまでこの添加を続ける。ブロス中のデキトロースレベルが２ｇ／Ｌ未満、すなわち１０日未満でこの値になるまで醗酵を続ける。
【００６３】
エリスリトールの最終濃度は２５０〜３００ｇ／Ｌである。０．４２％のポリサッカライド（エリスリトール含有量に対して）が生じる。
結晶化
プレコートされた回転減圧フィルター上での濾過によって、バイオマスを醗酵ブロスから除去する。清澄化された醗酵ブロスをバッチ減圧蒸発器中で９０℃で９０％ｗ／ｗの総乾燥固体含有量に濃縮する。
【００６４】
この清澄化された醗酵ブロスを攪拌されるバッチ冷却結晶化器に移す。冷却は６時間かかって９０℃から２０℃に直線的に進行する。エリスリトール結晶をバッチ遠心分離によって回収する。結晶を遠心分離機中で冷水を用いて洗浄する（水と結晶の割合は１５／１００である。）。エリスリトール回収率は８５％であり、結晶の純度は９９．１％ｗ／ｗである。
Claims (8)
- 微生物を用いる醗酵によるエリスリトールの産生及びこのエリスリトール結晶の回収方法であって、これが次の工程：
ａ）エリスリトール含有量に対して１％以下のポリサッカライドを産生する、ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール産生菌株のモニリエラトメントサバルポリニス（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ ｖａｒ ｐｏｌｌｉｎｉｓ）ＴＣＶ３６４［寄託番号ＭＵＣＬ４０３８５］を微生物として使用し、
ｂ）醗酵培地を調製し、
ｃ）上記微生物を醗酵培地に添加し、
ｄ）少なくとも５０ｇ／Ｌのエリスリトールが醗酵培地中に得られるまで微生物を増殖させ、
ｅ）醗酵培地から微生物を除去し、
ｆ）未精製の微生物不含醗酵培地を８０％ｗ／ｗより高い乾燥物質に濃縮し、
ｇ）エリスリトールを結晶化し、ついで
ｈ）エリスリトール結晶を集める
ことから成ることを特徴とする、上記方法。 - 未精製の微生物醗酵培地を、少なくとも８５％ｗ／ｗの乾燥物質に濃縮する、請求項１記載の方法。
- 未精製の微生物醗酵培地を、９０％ｗ／ｗより高い乾燥物質に濃縮する、請求項２記載の方法。
- エリスリトール結晶を少なくとも８５％の回収率で集め、その結晶は少なくとも９８％ｗ／ｗの純度を有する、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
- エリスリトール結晶を少なくとも８５％の回収率で集め、その結晶は少なくとも９９％ｗ／ｗの純度を有する、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
- 微生物を１０日未満で増殖させる、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
- 醗酵培地を発泡されたカラムリアクター又はエアーリフト中で調製する、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
- エリスリトール含有量に対して１％以下のポリサッカライドを産生することを特徴とする、ポリサッカライドを実質上含有しないエリスリトール産生菌株のモニリエラトメントサバルポリニス（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ ｖａｒ ｐｏｌｌｉｎｉｓ）ＴＣＶ３６４［寄託番号ＭＵＣＬ４０３８５］。
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