KR950007224B1 - 리보플라빈의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

리보플라빈의 제조방법

본 발명은 미생물에 의해 생산된 리보플라빈을 추출, 정제하는 것에 관한 것이다. 상세하게는 미생물 발효에 의해 얻어진 배양물(Broth)로부터 추출, 정제하여 고순도의 리보플라빈 결정을 고수율로 얻는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 배양에 사용되는 기질을 개선함으로써 추후의 공정이 간단한 추출, 정제만으로도 고순도의 리보플라빈을 얻는 방법에 관한 것이다.

발효법에 의해 리보플라빈을 제조하는 방법은 가장 대표적인 것이 에레모데시윰아쉬비(Eremotheciumashbii), 아쉬비아 고쉬피(Ashbya gossypii), 칸디다 플라레리 (Candida flareri), 클로로스트리듐 아세토부티리컴(Clostridium acetobutryicum), 시카로마이세스세레비재(Saccharomyces cerevisae)등의 미생물을 당질배지에서 배양하여, 배양액중에 리보플라빈을 생성축적시키어 생산하는 것이다.

이렇게 얻어진 리보플라빈은 용도에 따라 분리, 혹은 추출방법이 다른데 시료첨가제의 목적으로 쓰일것은 리보플라빈을 달리하지 않고 배양물 전체를 건조시켜 사용하는 방법으로 배양물을 농축시키고, 리보플라빈의 농도를 높여 비중차를 이용하여 분리하는 것이다(일본공개특허 80-159800). 의약품, 식품등에 사용되는 리보플라빈은 순도가 높아야하기 때문에 추출정제하여 순도가 높은 결정을 얻는 추출, 정제법이 사용되고 있다.

추출, 정제하는 종래의 방법은 크게 두단계로 나뉘어 진행이 된다. 그 기본은 배양물(Broth)을 가열하여 리보플라빈을 가용화하고 균체 및 불용물을 분리한 다음 상등액에 있는 리보플라빈을 환원하여 용해성을 떨어뜨려 결정으로 석출시키는 환원반응을 한후, 다시 이를 산화시켜 결정을 얻는 산화반응이 요체이다(Economic Microbiology vol. 2.p 315, Academic Press). 그 구체적인 예로는 일본공개특허 78-10155에 나타나 있는데, 배양액에 하이드로설파이드를 첨가하여 용해도가 낮은 환원형 리보플라빈으로 변화시켜 조결정으로 침전시키고, 이 조결정을 산성의 현탁액중에서 산화시키고 다시 재결정하여 정제하여 리보플라빈 결정을 얻는다.

이러한 방법으로 고순도의 리보플라빈을 얻을 수는 있으나 회수율이 낮아 실용적이지 못한 단점이 있다. 또한 일본공고특허 82-13276호는 우선 균체를 제거하고 가열배양액을 농출을 한후 삼염화티탄으로 환원하여 첨진시키고, 공기중에서 산화한 후 알칼리침전법을 써서 정제하는 방법을 기술하고 있으나 이 경우도 정제수율이 낮은 단점이 있다(정제수율 29%).

즉, 종래기술의 문제점을 두가지로 요약할 수 있다.

첫째는 배양을 할때 기질을 당질(주로 당밀)로 써서, 당질에 함유되어 있는 유기질소 화합물의 영향을 받아 고순도의 리보플라빈을 얻을 수 없다는 단점 및 둘째는 배양액에 존재하여 리보플라빈을 정제할때 환원→산화→재결정의 여러단계를 거침으로 하여 정제수율이 떨어지는 단점을 가진다.

그리하여 본 발명자들은 이러한 관점에서 배양조건의 개선을 통하여 정제가 간편한 배양액(리보플라빈 함유)을 얻고 이를 이용하여 정제법을 간편화시키는 방법을 연구하여 상기의 두문제를 해결할 수 있는 방법을 찾아 본 발명의 완성하게 되었다. 리보플라빈은 수용성 비타민인데, 이의 용해성에 가장 큰 요인을 미치는 것은 유기질소 화합물에 영향을 받아 순수한 침전이 형성되지 않는다는 점이다. 이것은 발효시킬때 기질로 쓰이는 것이 당밀 및 이를 함유한 것이기 때문에 이의 대체가 필요하다. 그리하여 본 발명자들은 기질로써 저급 지방산, 저급 지방산알콜, 저급 지방산알레히드에스터르 등의 저급 지방족(C₁∼C₄)화합물을 이용하여 배양물중에 불순물의 함유량을 줄여 추후 추출, 정제시 순수결정을 얻는 방법을 개발하였다. 저급 지방족화합물은 분자량이 작고, 구조가 간단하여 종류 및 정제가 쉬우며 결정화에 악영향을 미치는 불순물이 적은 장점이 있다.

그리하여 본 발명은 리보플라빈 생산능력을 가진 미생물을 배지중에서 배양하며, 배양물중에 생성축적시킨 리보플라빈을 채취하는 방법에 있어서, 초산, 메타놀, 에타놀, 부타놀, 글리세린 등의 저급지방족 화합물(C₁∼C₄)을 기질로 사용하여 배양을 행하고, 배양물(Broth)중에 있는 리보플라빈을 추출함에 있어서는 우선 배양물을 열로 가하여 리보플라빈을 완전용해시킨 후, 고액분리를 하여 고형물을 제거하고 배양액으로부터 리보플라빈을 직접 결정화하는 방법이다.

이러한 방법을 개발함으로서 이제까지 문제가 되었던 두가지의 큰 물제를 해결함으로서 고순도의 리보플라빈을 고수율로 얻을 수 있었다. 문제점으로 대두되었던 불순물의 제거는 저급지방족화합물을 기질로 사용함으로써 해결이 가능하였고, 추출, 정제공정에서도 기존의 환원→산화→재결정의 복잡성도 추출→재결정으로 단순화가 가능하게 되었으며 또한 고순도의 리보플라빈을 고수율로 얻을 수가 있었다.

본 발명은 위에서 보듯이 종래 많은 문제점을 보였던 사항을 개선함으로서 다대한 효과를 가져온다. 첫째 발효에 쓰이는 기질로써 당밀등을 쓰는 종래기술과는 달리, 배양액중에 복잡한 조성을 갖는 불순물이 없음으로 하여 간단한 프로세스로 고순도의 리보플라빈을 얻을 수 있다는 점이다.

종래의 기술로서는 순도를 95% 이상을 올리기 위해서는 다단계의 정제가 필요하나(추출→환원→산화→재결정), 본 발명자등이 기질을 저급지방산으로 대체하므로써 불순물이 배양액중에 매우 미약하므로 단순한 열수추출→재결정법 만으로도 95.3% 내지 99%의 고순도를가진 리보플라빈을 얻을 수 있는 효과를 가져온다. 둘째 정제방법도 단순화되는 관계로 종래의 기술을 사용한 일본공고특허 82-13276에서는 최종정제수율이 29.1%에 불과하였으나, 본 발명에 의한 정제수율은 50.5% 내지 68.3%로 상승된다. 이러한 효과는 전체적으로 보면 고순도의 리보플라빈을 단순한 프로세스로 높은 수율로 얻을 수가 있는 것이다. 이렇게 얻어진 고순도의 리보플라빈은 의약용, 수의약품용, 식품용등에 쓰일 수 있는 충분한 순도를 가진다.

이하 실시예로서 본 발명을 다시 상세히 설명하면 다음과 같다.

이 발명에 사용된 미생물은 Saccharomyces Cerevisiae로서 다음의 조건에서 배양을 행하였다. 전배양배지로는 글루코스 2%, 폴리펩톤 0.5%, 효모엑기스 0.3%, 맥아엑기스 0.3%를 사용하였으며 상기 균주 슬랜트 액 10%를 접종한 후 30℃에서 30시간 회전진탕배양(rpm 190회)하였다. 본 배양배지의 초성은 초산칼슘 10.3%, (NH₄)₂SO₄0.3%, KH₂PO₄0.2%, MgSO₄7H₂O 0.1%, ZnSO₄7H₂O 2.2ppm, 아데닌 0.1%이었고 pH는 7.0이었다.

[실시예 1]

위의 본 배양배지 3ℓ을 7ℓ의 Jar-Fermentor에 넣고 120℃에서 20분간 가열멸균하고 전배양에서 얻은 Saccharmoyces Cerevisae Seed를 10%를 접종한 후 30℃에서 6일간 통기교반배양을 행하였다(0.5V.V.m, 40rpm). 배양을 종료후 배양액중에는 리보플라빈이 1.45g/ℓ 축적되어 있다. 위의 배양액 1ℓ을 냉각원심분리하여, 효모균체와 리보플라빈의 결정이 혼합된 침전물을 얻는다. 이 침전물에 물 1ℓ을 가하고, 80℃에서 1.5시간 추출을 하고, 열수추출액을 냉가시키면 순도 95.3%의 리보플라빈 결정 733mg을 얻을 수 있었다(정제 수율 50.6%). 이 결정을 0.44% 초산액에서 재결정하여 98% 이상의 순도를 가진 리보플라빈을 얻을 수 있었다.

[실시예 2]

실시예 1베서 배양된 1ℓ에 450ml의 물을 가하고, 다시 염산으로 pH 6.0으로 조정하고, 80℃에서 1.5시간 열수추출을 한후 여과된 추출액 1,270ml을 얻는다. 이 추출액을 5배 농축시킨 후 냉각을 하면, 리보플라빈과 탄산칼슘을 함유한 조결정 3.25g을 얻는다. 이 조결정에 0.44%의 초산수용액 610ml을 가하여 95℃, 4시간 가열을 하고 불용분을 여과한 후, 여과액을 냉각시키면 순도 99%의 리보플라빈 결정 0.99g을 얻을 수 있었다(정제 수율 : 68.3%).

[비교예 1]

실시예 1에서 효모를 배양함에 있어서 탄소원을 초산칼슘 대신에 당밀로 대체하고 실시예 1과 같이 배양한후 얻어진 배양액은 1.37g/l의 리보플라빈을 함유하고 있다. 이 배양액에서 리보플라빈을 추출하는 방법을 일본공고특허 82-13276과 같은 방법으로써 삼염화티탄을 첨가하여 환원한 후 공기중에서 산화시킨 다음 알카리 침전법을 써서 재결정 정제하면 순도 95%의 리보플라빈 0.42g을 얻을 수 있었다(정제 수율 : 29.1%).

[비교예 2]

비교예 1에서 얻어진 배양액 1ℓ(리보플라빈 1.37g 함유)을 실시예 1과 같이 단순한 열수추출을 한후 결정을 얻으면 순도 72% 이상을 얻을 수가 없었다. 이것을 배양액중에 당밀에서 유래된 불순물이 많이 혼합되어 있기 때문이다. 이하 표로서 비교하면 아래와 같다.

[표 1]

Claims (4)

1. 리보플라빈을 생산하는 미생물로써 사카로마이세스 속 효모를 이용하고, 그 배양에 있어서 탄소원으로서 저급(C₁∼C₄)의 지방족화합물을 기질로 사용하고 배양액중에 불순물의 함유량은 낮춤과 동시에 열수추출법으로 얻어진 열수용액에서 리보플라빈을 정제하는 것을 포함하는 리보플라빈의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 사용된 탄소원은 초산과 그 유도체인 리보플라빈의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 열수추출액으로부터 얻어진 조결정을 초산수용액으로 재결정하는 리보플라빈의 제조방법.
4. 제3항에 있어서, 초산수용액의 농도는 0.1 내지 0.5%인 리보플라빈의 제조방법.