JPH0753120B2 - リボフラビンの取得方法 - Google Patents

リボフラビンの取得方法

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JPH0753120B2
JPH0753120B2 JP24414786A JP24414786A JPH0753120B2 JP H0753120 B2 JPH0753120 B2 JP H0753120B2 JP 24414786 A JP24414786 A JP 24414786A JP 24414786 A JP24414786 A JP 24414786A JP H0753120 B2 JPH0753120 B2 JP H0753120B2
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riboflavin
acid
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彰一 高尾
輝之 二階堂
彰収 松山
貞夫 蔭山
公利 河合
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Daicel Corp
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Daicel Chemical Industries Ltd
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Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は発酵法により生産されるリボフラビンを培養物
から結晶として取得する方法に関するものである。リボ
フラビンは医薬飼料添加剤、食品用の着色剤として有用
である。
(従来技術) 発酵法によるリボフラビンの製造法として、エレモテー
シウム・アシュビイ(Eremothecium ashbyii)、アシ
ュビア・ゴッシピィ(Ashbya gossypi)、キャンディ
ダ・フラレリイ(Candida flareri)またはクロリスト
ジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutyli
cum)等を糖質倍地中で培養して、培養液中にリボフラ
ビンを生成蓄積せしめる方法が知られている(プログレ
イス・インダストリアル・ミクロバイオロジー1巻139
頁、1959)飼料添加物を目的とする場合は、リボフラビ
ンを単離することなく培養物全体を乾燥させる方法が行
なわれているが、医薬品等にも用いることのできる高純
度のリボフラビンを得るためには、培養物を加熱してリ
ボフラビンを可溶化したのち菌体などの不溶物と分離し
た後リボフラビンを一旦溶解性の低い物質に変化させる
方法が用いられてきた。具体的にはリボフラビン溶液に
ハイドロサルファイトあるいは三塩化チタンを加えて溶
解度の低い還元型リボフラビンとして沈殿させて分離し
た後、酸性懸濁液中で酸化し、更に再結晶により精製す
る方法がとられてきた。この方法により高純度のリボフ
ラビンが得られるが、回収率は実用的な水準ではなかっ
た。また本発明者らの飯部は特開昭61−21096で培養物
から熱水溶液状態で分離し、この熱水溶液からリボフラ
ビンを晶析する方法を開示したが、リボフラビンの水に
対する溶解度が低いため水を多量加えなければならず、
大量に処理する場合改善が望まれていた。
(発明が解決しようとする問題) リボフラビンが酸に対して溶解度が高く、中和、冷却、
希釈、濃縮等により容易に晶析できることが知られてい
ながら、従来から精製の途中でしか酸溶解が用いられな
かったのは、発酵法の基質として用いられる糖蜜、植物
油、栄養物として用いられるコーンスティーブリカー、
肉エキスなどの天然物に含まれる種々の物質、および中
和に用いられるCaCO3等無機物の存在が純度の高いリボ
フラビン結晶の取得を妨げてきたからと思われる。本発
明は、この様な困難を解決して、従来工業的規模で行な
われていなかった培養物に直接酸を加えてリボフラビン
を溶解し、不溶物を除去した後晶析する単純な工程で一
挙に高純度のリボフラビン結晶を取得することを可能に
するものである。
(問題点を解決するための手段) 本発明はリボフラビン生産能力を有する微生物を倍地中
で培養し、培養物中に生成・蓄積したリボフラビンを採
取する方法において培養物中のリボフラビンを酸に溶解
させ酸性溶液状態で固形物と分離し、酸溶液からリボフ
ラビンを晶析せしめることを特徴とするリボフラビンの
取得方法である。
本発明に於て晶析分離の対象となる培養物は、発酵終了
液(ブロス)そのものでもよく、また発酵終了液を濾過
あるいは遠心分離して得られる菌体とリボフラビン結晶
の混ざった固形物でも良い。このような培養物中で、リ
ボフラビンの少なくとも一部は菌体中に存在するので、
これを酸で抽出し、菌体外のリボフラビンと共に酸溶液
として菌体等の固形物と分離する。
本発明に使用する酸としては塩酸、硝酸、硫酸、リン
酸、ギ酸、酢酸のリボフラビン溶解度の高い酸であれば
単独でも混合液でも用いることができる。酸抽出の条件
は、リボフラビンの安定性、溶解性、菌体等の分解を考
慮して定める。通常20〜100℃、好ましくは50℃以上100
℃以下の温度で抽出する。酸の濃度、量は酸溶液にする
際の温度に応じて存在するリボフラビンを十分溶解させ
るに足りる量を用いるが塩酸の場合通常リボフラビン1g
に対し5〜20%の塩酸20〜200mlとなるように加える。
抽出時間は通常15分〜4時間、好ましくは30分〜2時間
がよい。またリボフラビンが完全に溶解した後、そのま
ま、あるいは固形物と分離後の酸溶液をさらに30分〜2
時間保温し、タンパク質、多糖等の高分子の不純物を分
解してもよい。
得られた酸溶液は、カセイソーダ、カセイカリ、アンモ
ニア水等での中和、冷却、水による希釈、あるいは酢酸
の場合濃縮等の方法により晶析する。所望により水、酢
酸、塩酸等の溶媒を用いて再結晶を行うか、活性炭処理
することにより、より高純度のリボフラビン結晶が得ら
れる。
(培養方法) 本発明に於けるリボフラビンを生産する微生物を培養す
る方法を説明する。炭素源としては酢酸・グルコン酸等
の有機酸、グルコース、シュークロース、キシロース等
の糖質、エタノール、グリセリン等のアルコールなどを
使用できる。窒素源としては種々の形態の窒素化合物が
使用できる。例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム等無機窒素化合物が好ましいが、
酢酸アンモニウムでもよい。ポリペプトン等の有機窒素
源を多量に溶いると晶析に悪影響を与える恐れがある。
炭素源、窒素源の他にリン酸第1カリウム、硫酸マグネ
シウム等の無機塩類を使用する。またプリン要求性の菌
株を用いる場合はアデニン、アデニン鉱酸塩、アデノシ
ン、アデニル酸、リボ核酸やヒポキサンチン、イノシン
等のプリン化合物を添加する。また必要に応じビオチン
等のビタミン類、アミノ酸、核酸塩基などの微量栄養素
を添加すればリボフラビンの蓄積量を増す場合が多い。
本発明に於てはコーンスティープリカー、植物油、糖
蜜、肉エキス等の複雑な天然物を用いず簡単な培地を用
いることがよい。培養には好気的条件が望ましい。培地
のpHは2ないし10が好ましいが、6ないし9に調節すれ
ば最も好ましい結果が得られる。温度は20℃ないし37℃
の範囲のうち使用菌株の生育およびリボフラビン生産性
に適した温度を用いることができる。
さらに、培養途中から炭素源および窒素源を連続的又は
間欠的に添加していく方法をとれば、リボフラビン蓄積
量を著しく高めることができる。
(発明の効果) 本発明により培養物に直接酸を加えてリボフラビンを酸
に溶解させ固形物より分離することが可能となり、大量
処理が容易で高純度のリボフラビンが高収率で得られ
る。
(実施例) 以下実施例により説明する。
実施例1 サッカロマイセス・セレビジェNH−268(FERMBP−965)
をグルコース2%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.3
%、麦芽エキス0.3%を含む液体倍地100mlに接種し、30
℃で43時間振盪培養する。この前培養液を酢酸アンモニ
ウム0.58%、酢酸カルシウム0.13%、KH2PO4 0.2%、M
gSO4・7H2O 0.1%、ZnSO4・7H2O 11ppmを含む発酵培
地に15%の接種量で接種し、7容ジャーファーメンタ
ーを用いて通気量0.5 v.v.m 撹拌翼の回転数600rpm、
30℃で培養を開始した。培養開始直後からpHを7.0±0.5
に維持するように設定したpHコントローラにより50%酢
酸、1%酢酸アンモニウム混合液を流加し培養を280時
間続けた。リボフラビン蓄積量は4.7g/であった。
この培養液を濾過し、菌体とリボフラビンの固形物(リ
ボフラビン46mg/g〔湿重〕を含む)を得た。この固形物
41.2gに10.3%塩酸967gを加えて室温で3時間撹拌後、
濾過助剤スタンダード・スーパセル(ジョンズマンヴィ
ール社製)6gを加えて濾過した。濾液に30%NaOH 395g
を加えて中和後一夜放置し、析出したリボフラビン結晶
を濾別した。結晶を20mlの蒸留水、次いで4mlのメタノ
ールで洗浄後乾燥し、リボフラビン結晶1.26gを得た。
純度99.8%、収率66.3%であった。
実施例2 実施例1で用いた菌体とリボフラビンの固形物42.3gに4
0%酢酸、250mlを加え、92〜95℃で2時間撹拌した後ス
タンダードスーパセル6gを加えて熱時濾過した。濾液を
5℃で2日間冷却し、晶析を行い、結晶を濾別した。次
いで実施例1と同様に水洗浄、メタノール洗浄を行い乾
燥し、リボフラビンの結晶1.46gが得られた。純度88.7
%、収量66.7%、これを希酢酸で再結晶すると、純度9
6.1%のリボフラビン結晶が得られた。
実施例3 実施例1と同様の方法で培養した培養液(リボフラビン
2.3g/)705mlを遠心分離し、菌体とリボフラビンの固
形物45.4g(リボフラビン1.51gを含む)を得た。この固
形物に10%塩酸250mlを加え60℃で2時間かくはん後、
スタンダードスーパーセル6gを加え濾過した。濾液を27
%NaOH115gで中和、一夜放置後濾別し、実施例1と同様
に水洗浄、メタノール洗浄し乾燥した、リボフラビン結
晶1.24gを得た。純度97.4%、収率80.0%であった。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】リボフラビン生産能力を有する微生物を倍
    地中で培養し、培養物中に生成・蓄積したリボフラビン
    を採取する方法において、培養物中のリボフラビンを酸
    に溶解させ酸性溶液状態で固形物と分離し、酸溶液から
    リボフラビンを晶析せしめることを特徴とするリボフラ
    ビンの取得方法。
  2. 【請求項2】リボフラビンを溶解させる酸が塩酸、硝
    酸、硫酸、リン酸、酢酸、ギ酸のうちから選ばれた一種
    あるいは二種以上の酸の混液であることを特徴とする特
    許請求範囲第1項記載の方法。
  3. 【請求項3】使用する微生物が、サッカロマイセス属に
    属するリボフラビン生産菌であることを特徴とする特許
    請求の範囲第1項記載の方法。
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