JPS6398399A

JPS6398399A - リボフラビンの取得方法

Info

Publication number: JPS6398399A
Application number: JP24414786A
Authority: JP
Inventors: Shoichi Takao; 彰一高尾; Teruyuki Nikaido; 輝之二階堂; Akikazu Matsuyama; 彰収松山; Sadao Kageyama; 蔭山　貞夫; Kimitoshi Kawai; 河合　公利
Original assignee: Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 1986-10-16
Filing date: 1986-10-16
Publication date: 1988-04-28
Anticipated expiration: 2010-06-07
Also published as: JPH0753120B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は発酵法によシ生産されるリボフラビンを培養物
から結晶として取得する方法に関するものである。リボ
フラビンは医薬飼料添加剤、食品用の着色剤として有用
である。

（従来技術）発酵法によるリボフラビンの製造法として、エレモテー
シウム・アシュビイ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍａｓｈ
ｂｙｉｉ　）　、アシュビア・ゴッシピイ（Ａｓｈｂｙ
ａｇｏｓｓｙｐｉ　）　、キャンディダ・フラレリイ（
Ｃａｎｄ　ｊｄａｆｌａｒｅｒｉ　）またはクロリスト
リジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｊｕｍ
　ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）等を糖質培地中で培
養して、培養液中にリボフラビンを生成蓄積せしめる方
法が知られている（プログレス・インダストリアル・ミ
クロバイオワノー１巻１３９頁、１９５９　）飼料添加
物を目的とする場合は、リボフラビンの単離することな
く培養物全体を乾燥させる方法が行なわれているが、医
薬品等にも用いることのできる高純度のリボフラビンを
得るためには、培養物を加熱してリボフラビンを可溶化
したのち菌体などの不溶物と分離した後リボフラビンを
一旦溶解性の低い物質に変化させる方法が用いられてき
た。具体的にはリボフラビン溶液にハイドロサルファイ
ドあるいは三塩化チタンを加えて溶解度の低い還元型リ
ボフラビンとして沈殿させて分離した後、酸性懸濁液中
で酸化し、更に再結晶によシ精製する方法がとられてき
た。この方法によシ高純度のリボフラビンが得られるが
、回収率は実用的な水準ではなかった。寸だ本発明者ら
の一部は特開昭６１−２１０９６で培養物から熱水溶液
状態で分離し、この熱水溶液からリゾフラビンを晶析す
る方法を開示したが、リボフラビンの水に対する溶解度
が低いため水を多量前えなければならず、大量に処理す
る場合改善が望凍れていた。

（発明が解決しようとする問題）１）　、Ｉｆｆフラビンが酸に対して溶解度が高く、中
和、冷却、希釈、濃縮等により容易に晶析できることが
知られていながら、従来から精製の途中でしか酸溶解が
用いられなかったのは、発酵法の基質として用いられる
糖密、植物油、栄養物として用いラレルコーンスティー
ブリカー、肉エキスなどの天然物に含まれる種々の物質
、および中和に用いられるＣ　ａ　Ｃｏ　３等無機物の
存在が純度の高いＩＪ　、ｙフラビン結晶の取得を妨げ
てきたからと思われる。

本発明は、この様な困難を解決して、従来工業的規模で
行なわれていなかった培養物に直接酸を加えてリボフラ
ビンを溶解し、不溶物を除去した後晶析する単純な工程
で一挙に高純度のＩＪ　、ｙフラビン結晶を取得するこ
とを可能にするものである。

（問題点を解決するだめの手段）本発明はＩＪ　、ｐフラビン生産能力を有する微生物を
培地中で培養し、培養物中に生成・蓄積したリボフラビ
ンを採取する方法において培養物中のりデフラビンを酸
に溶解させ酸性溶液状態で固形物と分離し、酸溶液から
リボフラビンを晶析せしめることを特徴とするリボフラ
ビンの取得方法である。

本発明に於て晶析分離の対象となる培養物は、発酵終了
液（ブロス）そのものでもよく、また発酵終了液を濾過
あるいは遠心分離して得られる菌体とりｇフラビン結晶
の混ざった固形物でも良い。

このような培養物中で、リボフラビンの少なくとも一部
は菌体中に存在するので、これを酸で抽出し、菌体外の
リボフラビンと共に酸溶液として菌体等の固形物と分離
する。

本発明に使用する酸としては塩酸、硝酸、硫酸、リン酸
、ギ酸、酢酸のリボフラビン溶解度の高い酸であれば単
独でも混合液でも用いることができる。酸抽出の条件は
、リボフラビンの安定性、溶解性、菌体等の分解を考慮
して定める。通常２０〜１００℃、好ましくは５０°Ｃ
以上１００°Ｃ以下の温度で抽出する。酸の濃度、量は
酸溶液にする際の温度に応じて存在するリボフラビンを
十分溶解させるに足シる量を用いるが塩酸の場合通常リ
ボフラビン１ｙ−に対し５〜２０チの塩酸２０〜２００
ｍ１となるように加える。抽出時間は通常１５分〜４時
間、好ましくは３０分〜２時間がよい。またリボフラビ
ンが完全に溶解した後、そのまま、あるいは固形物と分
離後の酸溶液をさらに３０分〜２時間保温し、タンパク
質、多糖等の高分子の不純物を分解してもよい。

得られた酸溶液は、カセイソーダ、カセイカリ、アンモ
ニア水等での中和、冷却、水による希釈、あるいは酢酸
の場合濃縮等の方法により晶析する。

所望によシ水、酢酸、塩酸等の溶媒を用いて再結晶を行
うか、活性炭処理することにより、よシ高純度のＩＪ　
、ｙフラビン結晶が得られる。

（培養方法）本発明に於けるリボフラビンを生産する微生物を培養す
る方法を説明する。炭素源としては酢酸・グルコン酸等
の有機酸、グルコース、シュークロース、キシロース等
の糖質、エタノール、グリセリン等のアルコールなどを
使用できる。窒素源としては種々の形態の窒素化合物が
使用できる。例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム等無機窒素化合物が好ましいが、
酢酸アンモニウムでもよい。ポリペプトン等の有機窒素
源を多量に用いると晶析に悪影響を与える恐れがある。

炭素源、窒素源の他にリン酸第１カリウム、硫酸マグネ
シウム等の無機塩類を使用する。またプリン要求性の菌
株を用いる場合はアデニン、アゾ二ン鉱酸塩、アデノシ
ン、アデニル酸、リボ核酸やピポキサンチン、イノシン
等のプリン化合物を添加する。また必要に応じビオチン
等のビタミン類、アミノ酸、核酸塩基などの微量栄養素
を添加すればリボフラビンの蓄積量を増す場合が多い。

本発明に於てはコーンステイープリカー、植物油、糖蜜
、肉エキス等の複雑な天然物を用いず簡単な培地を用い
ることがよい。培養には好気的条件が望ましい。培地の
ＰＨは２ないし１０が好ましいが、６ないし９に調節す
れば最も好ましい結果が得られる。温度は２０℃ないし
３７℃の範囲のうち、使用菌株の生育およびリボフラビ
ン生産性に適した温度を用いることができる。

さらに、培養途中から炭素源および窒素源を連続的又は
間欠的に添加していく方法をとれば、リゾフラビン蓄積
量を著しく高めることができる。

（発明の効果）本発明によシ培養物に直接酸を加えてリボフラビンを酸
に溶解させ固形物よシ分離することが可能となり、大量
処理が容易で高純度のリボフラビンが高収率で得られる
。

（実施例）以下実施例により説明する。

実施例１サツカロマイセス・セレビシェＮＨ−２６８（ＦＥＲＭ
ＢＰ−９６５）をグルコース２係、ポリペプトン０．５
チ、酵母エキス０．３　％　、麦芽エキス０．３チを含
む液体培地１００　ｍ、ｌ！に接種し、３０℃で４３時
間振盪培養する。この前培養液を酢酸アンモニウム０．
５８％、酢酸カルシウム０．１３チ、ＫＨ２ＰＯ４０，
２係、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，１％、ＺｎＳＯ４４Ｈ
２０１１ｐｐｍを含む発酵培地に１５チの接種量で接種
し、７１容ジャーファーメンタ−を用いて通気量０．５
　ｖ、ｖ、ｍ攪拌翼の回転数６０　Ｏｒｐｍ、３０℃で
培養を開始した。培養開始直後からＰＨを７．０±０，
５に維持するように設定したＰＨコントローラによ９５
０％酢酸、１％酢酸アンモニウム混合液を流加し培養を
２８０時間続けた。ＩＪ　、］？フラビン蓄積量は４．
７シ！であった。

この培養液を濾過し、菌体とリボフラビンの固形物Ｃリ
ボフラビン４６　ｍｙ／？　［：湿重〕を含む）を得だ
。この固形物４１．２ｙ−に１０．３係塩酸９６７ｆを
加えて室温で３時間攪拌後、濾過助剤スタンダード昏ス
ーパセル（ジョンズマンヴイール社製）６ｙ−を加えて
濾過した。濾液に３０　％　ＮａＯＨ３９５ノを加えて
中和後−夜装置し、析出したリボフラビン結晶を濾別し
た。結晶を２Ｑｒｎｌの蒸留水、次いで４０ｍ１のメタ
ノールで洗浄後乾燥し、リボフラビン結晶１．２６　ｙ
−を得だ。純度９９．８％、収率６６．３％であった。

実施例２実施例１で用いた菌体とリボフラビンの固形物４２、３
　？に４０チ酢酸、２５ｆ）ｍ／を加え、９２〜９５℃
で２時間攪拌した後スタンダードスーパセル６ｙ−を加
えて熱時濾過した。濾液を５℃で２日間冷却し、晶析を
行い、結晶を濾別した。次いで実施例１と同様に水洗浄
、メタノール洗浄を行い乾燥し、リボフラビンの結晶１
．４６　ｙ−が得られた。

純度８８．７％、収量６６．７％、これを希酢酸で再結
晶すると、純度９６１係のリボフラビン結晶が得られた
。

実施例３実施例１と同様の方法で培養した培養液（リゾフラビン
２．３　ｆ？／１１　）　７０５　ｍｌ！を遠心分離し
、菌体とリゾフラビンの固形物４５．４ｙ−（リゾフラ
ビン１、５１　、Ｐを含む）を得た。この固形物に１０
％塩酸２５０ｍ１を加え６０℃で２時間かくはん後、ス
タンダードスーパーセル６ノを加え濾過した。濾液を２
７％ＮａＯＨ１１５９−で中和、−夜放置後濾別し、実
施例１と同様に水洗浄、メタノール洗浄し乾燥した。リ
ボフラビン結晶１．２４　？を得た。純度９７．４係、
収率８０．０俤であった。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）リボフラビン生産能力を有する微生物を培地中で
培養し、培養物中に生成・蓄積したリボフラビンを採取
する方法において、培養物中のリボフラビンを酸に溶解
させ酸性溶液状態で固形物と分離し、酸溶液からリボフ
ラビンを晶析せしめることを特徴とするリボフラビンの
取得方法。
（２）リボフラビンを溶解させる酸が塩酸、硝酸、硫酸
、リン酸、酢酸、ギ酸のうちから選ばれた一種あるいは
二種以上の酸の混液であることを特徴とする特許請求範
囲第１項記載の方法。
（３）使用する微生物が、サッカロマイセス属に属する
リボフラビン生産菌であることを特徴とする特許請求範
囲第１項記載の方法。