JPS6121096A - リボフラビンの取得方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、醗酵法により生産されるリボフラビンを、
培養物から結晶として取１！７　する方法に関するもの
て゛ある。リボフラビンは医薬、飼１１添加剤１食品用
の札色剤などとして有用である。

従来技術 ＮｆＭ？法にＪ、るリボフラビンの製造法として、ニレ
七テシウム・アルｊビイ、アシュビア・ゴシツピイ、キ
ャンディダ・フラレリイ、Ｊ：たはクロス］・リジウム
・アセトブチリカム等を糖質培地中で培養して＋　ＩＢ
養液中にリボフラビンを生成・蓄積せしめる方法が知ら
れている。（プ１」ブレス・インダストリアル・ミクロ
バイオ−ロラー１巻１３９Ｆ：、ｌ、　１９５９） 飼料添加剤を［１的とげる場合は、リボフラビンを甲離
づる（−と＜；　＜　、培養物全体を乾燥させる方法が
（−ｊなわれ−Ｃいる。この場合、でさるだけリボフラ
ビン濶ＩＩ″Ｌを高めるために比小差を利用する方法ら
提案され−Ｃいる（特開昭５５−１５９８００）　。

医薬品賞にも用いることのできる純度の高い結晶リボフ
シビンを１Ｕるためには、培養物を加熱し゛Ｃリボフラ
ビ〕／を可溶化したのち菌体などの不溶物と分離した液
から、リボフラビンを一旦溶解性の低い物質に変化させ
る方法が用いられてきた（［ｃｏｎｏｍｉｃ　　Ｈｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　ｖｏｌ、２．ｐ、３１５．八ｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）　。

その具体例を特公昭５３−１０１５５に見ると、ハイド
ロサルツノ・イトを添加して溶解度の低い還元型リボフ
ラビンに変化したものを粗結晶どして沈澱させ、酸性の
懸回液中で酸化し、更に再結晶により精製する。この方
法によりリボフラどンの純品が得られるが１回収率は実
用的な水型てはなかった。

また特公昭５７−１３２７６の実施例１によると、３１
体を除去した加熱培養液を、濃縮後、三塩化チタンで還
元、沈澱させ、空気中で酸化し、塩酸溶解、アルカリ沈
澱法により精製するく精製収′￥７２９％）。

還元型（ロイコ）リボフラビンを処理する際にブタノー
ルなどの有機溶媒を用いて抽出する方法し知られている
（　ＵＳＰ２４６４２４３）　。

発明が解決しようとする問題点 リボフラビンが水から再結晶できることが知られていた
にもかかわらず、従来の精製法が、培養物中に酸化型と
し−Ｃ存在するリボフラビンを、わざわざ還元剤を用い
て還元型となし、しかるのらに再度酸化−りる方法をと
っていたのは、きれいな水からの晶析と異なり、培養物
から純度のよいリボフラビンを直接晶析ざゼることに困
難があったからである。リボフラビンの水中への溶解性
が。

心機窒素化合物など他の物質の存在により著しく影響さ
れることは知られており、醗酵法の基質として最も酋通
に用いられる糖蜜などに含まれる種々の物質の存在が、
純度の良いりボノラビン結晶の取得を妨げでいたものと
思われる。

本発明は、この様な困難を解決して、従来Ｔ業的規模で
は実現していなかった培養物水溶液からの単純な晶析に
よるリボフラビン結晶の取１↓１を可能にりるものであ
る。

問題点を解決ηるための手段 本発明は、リボフラビン生産能力を有する微生物を培地
中Ｃ′培養し、培養物中に生成・蓄積したリボフラビン
を採取する方法において、低級（Ｃ１〜Ｃ４）脂肪族化
合物を基質として用いて培養を行ない、培養物中のリボ
フラビンを熱水溶液状態で固形物と分離し、この熱水溶
液からリボフラビンを晶析せしめることを特徴とづ−る
リボフラどンの取得方法である。

本発明では、基質として低級脂肪酸、低級脂肪族アルコ
ール、低級アルデヒド、エステル、アレタール等の低級
脂肪族（Ｃ１〜Ｃ４）化合物を用いる。酢酸、メタノー
ル、エタノール、シタノール、グリセリンなどで代表さ
れるこれらの化合物を基質として用いて培養を行なった
場合、従来技術と異なり、培養物水溶液からの単Ｉ１１
！な晶析により、純度の良いリボフラビン結晶が容易に
得られる。低級脂肪族化合物は１分子量が小さく、構造
が簡単であり、蒸溜などの精製が容易で、晶析に悪影響
のある不純物を含まない形で使用するのに適している。

（使用する微生物） 低級脂肪族化合物を基質にして培養を行ない。

リボフラビンを生産するためには、もらろんイれに適し
た微生物を用いる必要がある。ぞの−例は９本発明老の
一部による。酢酸を炭素源どする醗酵法によるリボフラ
ビンの製造法に関づる文献（ＡＯｒ、Ｂｉｏｌ、ＣＩ＋
ｃｍ、、ｖｏｌ、２８．ｐ、５５９．ｐ、５６６、Ｄ、
７６５（１９６４））にｄ３いて開示された菌株である
。なお、上記文献に４３いては微生物の名称としてキャ
ンディダーロブスタ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｒｏｂｕｓｔａ
）が用いられているが、その後キＶンディダ・ロブスタ
の標準株（タイプストレイン）において胞子が見出され
ているため、［１ター君ザ・イースト１９７０４１−版
においては、　−１１１ンデイダ・ロブスタはザツノＪ
ロミレスーセレヒシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　
ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）に再分類され−（いる。

しかし上記文献で用いられた菌株については。

胞子形成は認められていないため、サッカ１」ミセス・
セレビシェの無胞子型であると考えられ１本明細書にお
いては、これをザッカロミセス・セレビシェ（キ（Ｉン
ディダ・ロブスタ）と記載する。

このほか９本発明で使用できる好適な菌株の具体例とし
ては、ザッカロミセス・セレビシェ（キ１７ンデイダ・
ロブスタＡＨＵ３４０５）から誘尋された変異株である
サツカロミセス・セレビシェＰ−１５４（微］二研菌寄
第７５６２号）、サツカロミセス・セレビシェＴＷ−５
７３（微コニ研菌寄Ｉｒ７５６３号）、サツカロミセス
・セレビシェＴＰ−１０１０（微二Ｉ−研菌寄第７５６
４号）が挙げられる。

本発明では、リボフラビンの晶析に悪影響のある物質が
培養物中に多量に存在づるのを避けるため、栄養要求性
が比較的少なく、成分が複雑な肉エキス、ポリペゾトン
、コーンスディープリカー等を添加しなくてもリボフラ
ビンを生産でさ、かつリボフラビン以外の副生物を著量
生産しないような微生物が望ましい、」−に例示した微
生物は。

これらの条件をも満足させるものである。

（分離法） 上記のような基質、培地成分とそれを利用できる微生物
を選んでリボフラビンを生産させた培養物は、培養液組
成の複雑さが、従来技術よりも軽減されており、その結
果、加熱された水溶液状態で菌体や炭酸カルシウムなど
の固形物と分離し。

冷ＩＪ１など慣用の１段によりこの水溶液を晶析せしめ
ることにＪζり純度のよいリボフラビン結晶が高い取得
率で得られる。

晶析分離のス・［＠となる培養物は、醗酵終了液（ゾロ
ス）での−ｂのでもよく、また醗酵終了液を冷１（Ｉｌ
後、浦過あるいは遠心分離して得られる。菌体とリボフ
ラビン結晶の混ざった固形物でも良い。

この様な培養物中で、リボフラビンの少なくとも一部は
、菌体中に入っていると考えられるので。

これを熱水で抽出し、菌体外にあった分と共に熱水溶液
とし−Ｃ菌イホ等の固形物と分離する。水抽出の条イ′
１はリボフラビンの安定性、溶解性を考１．）して定め
る０通１；３．酸性条ｆｔ下、５０°Ｃ以上好ましくは
６０℃以十の温度で抽出する。加圧下１例えば１２０’
Ｃの過熱水を用いることもでさる５水の吊は、熱水溶液
にする際の温度に応じて存在するリボフラビンを十分溶
解させるに足りる量を用いる。従って、固形物を用いる
場合はもちろん、培養液そのものを用いる場合も水を添
加するのが普通である。

得られた熱水溶液は、そのまま冷却りるだ１ノでもリボ
フラビン結晶が析出するが、場合によっては抽出液を濃
縮（炭酸カルシウム等が出れば分離）した後に晶析して
もよい。

所望により水、酢酸水溶液、塩酸水溶液等の溶媒を用い
て再結晶づれば、より高純度リボフラビン結晶が得られ
る。

（培養方法） 本発明で低級脂肪族化合物を炭素汎；としてリボフラビ
ンを生産する微生物を培養する方法を説明づる。　窒素
源としては種々の形態の窒素化合物が使用できるが２例
えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、炭酸アンモ
ニウムのごとき無機窒素化合物が好ましい、ポリペプト
ン等の有機窒素源を多量に用いると晶析に悪影響のある
恐れがある。

炭素源、窒素源の他にリン酸第１カリウム、Ｍ１酸マグ
ネシウム等の無機塩類を使用する。またプリン要求性の
菌株を用いる場合は、アデニン、アデニン鉱酸塩、アデ
ノシン、アデニル酸、リボ核酸等、更にヒポキサンヂン
、イノシン等のプリン化合物を添加づ−る。また、必要
に応じビオチン等のビタミン類、アミノ酸、核酸塩基な
どの微量栄養素を添加すれば、リボフラビンの蓄積量を
増マ゛揚合が多い。

培養には好気的条件が好ましい、培地のｐＨは２ないし
１０とするが、６ないし９に調節ずれば最し好ましい結
果が得られる。温度は、２０℃ないし３７℃の範囲のう
ら、使用菌株の生育Ｊ５よびリボフラビン生産性に適し
た温度を用いることができる。

発明の効果 本発明は基質として糖蜜等を用いる従来技術と異なり、
培養液中に複雑な組成の不純物がないので、簡単なプロ
レスによっても、高純度のりボフンビン結晶を採取する
ことが可能である。

以下実施例により説明する。

なお、使用した微生物は次の条件で前培養し。

醗酵培地に１２．６％の植菌量で接種した。

前培養条件ニゲコース２％、ポリペプトン０．５％、酵
酵母エキス０．鴇 含む前培養培地１　００ｍ　ｌに接種し，３０℃でご３
０時間振盪培養 液体培地で前培養した後にリボフラビンを生成せしめる
場合についてついては，直接接種の場合と異なり，亜鉛
を微量添加することにより，リボフラビンの生産性が著
しく向上し，しかも鉄イオンの阻害効果を防ことができ
る。

醗酵培地組成 酢酸カルシウム　　　　１０３ｏ／１ （ＮＨ４）２Ｓ０４　　　　３ｇ／Ｉ Ｋ　ｌ−１　２Ｐ　Ｏ　４２　ｇ／　ＩＭ　Ｇ　Ｓ　Ｏ
　　・７１−１　　０　　　　１ｑ／１ＺｎＳＯ　　−
７ｔｌ　　Ｏ　　　　２、２ｒｒＬｇ／　１アデニン　
　　　　　　　　１ｇ／ｌ ｐＨ　　　　　　　　　　　　７．０ 実施例１ 土に示した組成の醗酵培地３１を７１容ジャーファーメ
ンタ−に入れ，１２０℃で２０分間加熱滅菌した．これ
にサツカロミセス・セレビシェＰ−１５４を接種し３０
℃で６日間通気撹拌培養を行なった（　０　、　５　ｖ
．ｖ．ｎ＋．　、　４　０　０　ｒｐｍ）、　　培養終
了後培養液中にはリボフラビンが１．４５Ｃ］／１蓄積
していた。

この培養液の一部７００ｍ１を冷却，遠心分離すること
により，酵母菌体とリボフラビンの結晶どの混合物を沈
澱として得た．この沈澱に水１１を加え，８０℃℃１．
５時間抽出し，熱水抽出液を冷Ｎｊすることにより純ｌ
ｌ９５．３％のリボフラビン結晶５　１　３ｍｇが得ら
れた。

この結晶を希酢酸で再結晶すると９８％以上の糾瓜のリ
ボフラビン結晶が得られた。

実施例２ 実施例１における培養液の別の一部６７０ｍ１に水３０
０Ｑを添加し．更に塩酸ぐｐｔ−１６．０としだ後．８
０℃に１．５時間保ち熱時濾過することにより抽出液８
５０Ｇを得た．この抽出液を５１８濃縮した後冷却する
と，リボフラビンと炭酸カルシウムを含有Ｊる粗結晶２
．１８ｇが得られた。

この粗結晶４８０ｍｇに対し０．４４％酢酸水溶液９０
（Ｊを加え，９５℃，４時間の加熱を行ない不溶分を濾
別した後濾液を冷却して純度９９％以上のリボフラビン
結晶１　４　６ｍＯを得た。

実施例３ サツカロミセス・セレビシＩＴＶＩ−　５　７　３を。

実施例１と同様の方法で培養した．但し醗酵培地組成は
，実施例１で示したものからアデニンを除いた。

培養物（リボフラビン量１．４７ｇ／ｌ　）１。

２１を冷却，遠心分離することにより酵母菌体とリボフ
ラビン結晶との混合物を沈澱として得た。

この沈澱に水２１を加え８０℃で１．５時間抽出し，熱
水抽出液を１１に濃縮した後冷却することにより純度９
７．３％のリボフラビン結晶８９５ｍｇが得られた。

濾液の一部７４０ｍ１を再度３．３倍に濃縮づることに
より純度９６．０％のリボフラビン結晶３８８ｍＱを得
た。

特許出願人　ダイセル化学］二業株式会社手続補正書（
自発） 昭和５９年　９月ｉ口

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リボフラビン生産能力を有する微生物を培地中で培
   養し、培養物中に生成・蓄積したリボフラビンを採取す
   る方法において、低級（Ｃ１〜Ｃ４）脂肪族化合物を基
   質として用いて培養を行ない、培養物中のリボフラビン
   を熱水溶液状態で固形物と分離し、この熱水溶液からリ
   ボフラビンを晶析せしめることを特徴とするリボフラビ
   ンの取得方法 ２、酢酸を基質として用いることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の方法 ３、使用する微生物が、サッカロミセス属に属するリボ
   フラビン生産菌であることを特徴とする特許請求の範囲
   第２項記載の方法