JPS60241895A - リボフラビンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、醗酵法によるりボフラビンの製造法に関す
るものである。更に♂Ｔしくは、サツカロミセス属に属
しプリン要求性を右するりボフラピン生産菌を培地中で
培養して、生成・蓄積したりボフラピンを採取ゴる製造
法に関するしのである。

この方法により、酢酸を炭素源どした！ｇ！１醇法でリ
ボフラビンを効率良く製３ｉＳ−ｊることかできる。

リボフラビンは医桑、Ｎ判添加剤２食品用のる色剤など
どして有用ｔｒ動物質ある。

（従来技術） 醗酵法によるリボフラビンの製ｊ告２人として、ルモテ
シウム・アシコビイ、アシ］ビア・イシツビイ、キャン
ディダ・フラレリイ、またはり［１ストリジウム・アセ
ｉ・ブチリカム等を糖質１８地中で゛培養して、培養液
中にリボフラビンを生成・蓄積せしめる方法が知られて
いる。（プログレス・インダストリアル・ミクロバイオ
ロジー１を１３９頁、　１９５９） 本発明者の一部は酢酸を炭素源とするＦｅＦｒｔ法によ
るリボフラビンの製造法を報告している（ＡｇｒＢｔＯ
ｌ、Ｃ１１ｅ１１．、ＶＯｌ、２８．＋１．５５９，９
．５６（ｉ、１１．７６４１（１９Ｇ４１１なお、上記
文献においては微生物の名称としてキャンディダーロブ
スタ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｒＯｌｌｌｌＳＬａ）が用いら
れているが、イの後キャンディダ・日ｆスクの標準株（
タイプストレイン）にＪ３いて胞イが見出されているた
め、ログー茗ザ・イースト１９７０年版においては、キ
ャンデイダ・［］ブスタは１ノツカロミセス・セレビシ
ェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓ　ｃｅｒｅｖｉｃｉａ
８）に再分類されている。　しかし上記文献で用いられ
ｌこ菌殊については、胞子形成は認められていないため
　ＩＪ−ツノノ【」ミセス・しレビシＴの無胞子型であ
ると考えｌ）れ９本明細店にＪ３いては。

これを罎Ｊ・ソノノ１］ミ廿ス・ＬレビシＪ（１髪７ン
デイダ・［］ブスタ）ど記載Ｊる。

（発明の目的） １妃の」、う＜Ｋ菌が知られているｂのの、Ｆｉｌ酵法
によるりボフラビンの１１！′Ｉ造をＦ葉内に実施する
ために解決りべさ課題はまだ多く、中でもリボフラビン
の蓄（Ｉ〜濃１復ＪりＪ、び牛産連厄の高い菌を１りる
こと（まｉｆ＋要である。

本発明【まこのＪ、う’；　？Ｊｌ！ｒ：１の６とに、
リボフラビン’４ｆＬＰ＋の高い菌株を１７で、これを
用いたりボフラじンの新製造法を提供することを目的と
するものである。

（発明の（＾１成） 木升明者は、１記すツカ【１ミセス・セレビシェ（ｌ：
＋・ンディグ・ロブスタ）の改良につき鋭意ｆＩ！＋究
した結束、プリン要求ｖ１が６１与された変異株の中に
リボノラビン′ｔｆｒ性の高い菌株が得られることを児
出し３本発明を完成した。

すなわち１本発明ｔま１ナツカ１］ミし・ス属に属しゾ
リン要求性を右ηるリボフラじン’Ｉ　ｋ菌を１８地中
で培養して、リボフラビンを／１成・蓄積せしめ。

これを採取づることを特徴とでるリボフラビンの製造法
である。

（使用する微生物） 本発明で使用する微イｌ物は、リス力［−１ミレス属に
属しプリン要求性を右づるリボフラビン生産菌であれば
いずれも用いることができ、プリン要求性を持つ点で先
行技術で用いられた菌と［メ別ぐさる。好適な菌株の具
体例としてリツＪＪロミｅス・セレビシェ（キャンディ
ダ・ロブスタＡｌ１Ｕ３／１０５）から誘導されたゾリ
ン要求性ゆ巽株であるサツカロミセス・セレビシＩＰ−
１５／Ｉ（ｇｌＩｒｔｌｌ菌奇第７５６２月）が挙げら
れる。

（菌株の取得法） 本発明で使用づる菌株は、リス））ｎミセス底に属する
リボフラビン生産菌を親株どして２通常の変異誘導処理
法を適用することに」、って、比較的容易に取ｉりでさ
る。

例えば親株として（ノッカ［１ミセス・セレビシェ（：
ｌ：ｔｌンディダ・ロブスタＡ　ｉｔ　Ｕ　３　／Ｉ　
Ｏ５）　（この菌は北海過人学問学部のリストに載って
いる保存菌である）を用い、紫外線型用あるいはＮ〜メ
ブル−Ｎ′−二１〜ｌ１−Ｎ−ニド［１ソグアニジン等
の桑削ぐ処理１す、イース１へ工Ｖス・マルｉ〜寒天培
地に塗抹し、／１台した］「に−ｈ日ら次の７Ｊ　ｄ：
で選択づる。りなわＩ）第１表に示す組成の最少培地と
。

ぞれに加えて７デニン等のプリン化合物を０．００５％
含む培地に上記コロニーのレプリカを行ない、最少培地
では生育できないが、プリン化合物を含む培地では生育
できるコロニーを、ゾリン要求性変異株として選択する
。

　５− 第１表　最少培地組成 得られた変異株のプリン要求性を確認するため。

プリン化合物に対する生育度実験を以下のごとく行なっ
た。つまり親株のサッカ１１ミしス・ヒレビシエ（キャ
ンディダ・ロブスタ△ｌ−Ｉ　Ｕ　３４０５　）と、こ
れから誘導したプリン要求ｔ’１株を、第２表に示す栄
養液体培地で２４助間１８差し、生理食塩水で洗浄し、
その懸濁液を第３表に記載した晒のプリンを添加した最
少培ｌｌ！１５ｍ１に（れぞれ接種し、３０℃にて３日
間培養し、この時魚におＧ」る生を度を６１０ｎｍの吸
光度により測定しＩこ、親株の生育度を１００としたと
きの相対イ１育１ｎを。

−６− 第３表に示した。／、ｉお第３表に記載した母のプリン
化合物を添加した最少１８地は、第１表の組成がら寒天
とビＡブンを除す−、グルー１−スの代りに酢酸））ル
シウ！ｘ　１０３　ｇ　、′ｌを添加したちのである。

第３表から、リツカＩＩミセス・ＰレビシＩ　ｐ　−１
り４は明らかにプリン要求性が付与されていることが確
認される。

第２人　栄た液体培地 第３表　相対−Ｆ台麿 （培養方法） 本弁明で使用するｒｌｌＺＩ物をＩＲｉ　７するｊＪ法
を説明す゛る。炭素源としては酢酸、グル丁」ン酸等の
イｊＶｓ酸、グル」−ス、シ１り［１−ス、１シ１１−
ス等の糖質、Ｔタノール、クリしリン等のノノルｌ−ル
類その他が使用できる。

窒素源として１１種々の形態の窒素化合物が使用でき１
例えば＠酸アンｔニウム、塩化アンし一つム、炭酸アン
七ニウム、尿素、アミノ酸、ボリベプｉ・ン等を用いる
ことがて゛きる。

腹素源、窒素源の他にリン酸第１カリウム、ｌ１１１Ｍ
ングンシウム等の無機塩類を使用する。また栄Ｍ要求物
質としてのプリン化合物は、アデニン。

アデニン紐、酸塩、アデノシン、アデニル酸、リボ核Ｍ
　ｍ　＋史にヒポ：１１Ｊンチン、イノシン等のいずれ
し使用可能である。また、必要に応じビオチン等のビタ
ミン類、アミノ酸、核酸塩基などの微量栄養素を添加４
れば、リボフラビンの蓄積量を増づ場合が多い。

寒天培地上に保存された酵母をリボフラビン生産培地に
直接接種づる場合、　ｉＩｌ！鉛添加はりボフラビンの
生産について特に効宋がないことが知られている。しか
し、寒天１８地−Ｆの酵母を−ａ液体培地で前Ｊ８養し
た後にリボフラビンを生成せしめる場合についてついて
は、直接接種の場合ど貸なり。

引Ｉ鉛をｒｌＩ情添加することにより、リボフラビンの
生産性が著しく向トシ、シかも鉄イオンの阻害効宋を防
ことができる。この改良製法（特願昭５８−１６５２４
５　）を適用することも出来る。

前１ｇｌ液のリボフラビン生産培地への植菌１は　９− ３〜２５％であることがりｒましい、１ｌｆｉＳ介イＡ
ン添加苗はｏ、ｉ〜１００ｕ／ｌを用いるが、最適濃庶
は培地中の鉄イオン濃醇にＪ、り異なり１例え１３０フ
、イオンが０．１ｍｏ／ｌ以下の場合１．ｔ　０　、５
１１０／ｌ稈ａの亜鉛イオンで一１分であるが、鉄イΔ
ンが５１１（１／１存在する場合には、１０〜３０ｕ／
ｌ程度添加りる必要がある。

培養には好気内果ｆ１が好ましい、　１８地の「）１１
は２ないし１０とづるが、６ないし９に調節ｉＪれば最
も好ましい結束が得られる。−痘は、２０”Ｃ’ｊいし
３７℃の範囲のうら、使用菌株の’ｌ　ｆｒおＪ、σリ
ボフラビン生ＩｒＬ性に適した瀉爪を用いることができ
る。

このようにして得られる培養液からのリボフラビンの採
取には公知の手法が適用できる。　ｊＪなゎも、培養液
を６０℃〜１２０℃に加熱しりボフシビンを溶解さＵだ
のち、遠心分離により酵母菌体と濾液に分離し、濾液を
必要に応じ濃縮したのら。

ハイドロサルファイドあるいは正塩化チタンにより還元
し、リボフラビンを沈４１さぜる。このよう　１０− にしく１！７られたリボフラビンを空気中で酸化させた
のら、水、酢酸水溶液等の溶媒を用いて再結晶をおこな
い、粕製りることが可能である。

本発明は４　’ｉ’ｉどしく糖蜜を用いる場合と巽なり
。

［８養液中に複雑（２組成の不純物がないので２次のＪ
、）な曲中なプ１］ｔ？スにＪ、〕でも、高純庶のリボ
フラビンも１１品を採取Ｊることが可能である。すなわ
”’■ｉ、あるい（１培養液の冷月１・遠心分離にＪ、
す（；Ｉらねる１￥１休とリボフラビン結晶の混合物に
。

水を加え（６０°Ｃ〜１２０°Ｃに加熱し、リボフラビ
ンを溶解させたのｔ）、熱１Ｆ、％　ｌ過により菌体と
濾液に分離する。濾液を必要に応じ濃縮したのち再び冷
Ｊｕｌりる事にＪ、り菌体から分離１された結晶リボフ
ッビンを１９にとがぐさる。この結晶を水、酢酸水溶液
、１ム酸水溶液等の溶媒を用いて再結晶Ｊれば＋：１１
ｔ’、　Ｉｕリボフンビン結晶が１！１られる。

双手実施例にＪ、り説明ηる。

実施例１ リツ力［１ミヒス・ししじシＩ　Ｐ　−１５４を、ダニ
１−ス２％、ポリペブ１−ン０．５％、酵母エキス　１
１− ０．３％、麦芽エキス０．３％を含む前培養１８地１０
０ｍ１に接種し、３０℃で３０１１Ｊｉ間振ｉ！ｉ　１
８　香した。この前培養液をＦ記の醗酵培地に１２．６
％の稙菌昂（・接秤し、３０℃で６１］間１ｈぷｌｊ；
　Ｍ　ｌ。

た、培養液中に蓄積したりボフシビンのｈｌは１゜５５
０／ｌであった。

醗酵培地組成 Ｉ’ｌｌ酸カルシウム　１０３ｏ／１ （ＮＨ４）２Ｓｏ４　３Ω／Ｉ Ｋ　ト１　２　Ｐ　Ｏ４２Ω　／　ｌ Ｍｏ５Ｏ・７１１２０　１ｏ／１ ７ｎＳＯ−７Ｎ２０　２．２ｍｏ／１ アデニン　１０／１ ｐｔｌ　７．０ 比較のため、＋１ツカロミセス・廿しビシｆ［）−１５
４に代えて、イの親株であるリツ力［］ミしス・セレビ
シェ（キャンデイダ・［］ブスタΔ１１Ｕ３４０５）を
用いた場合、培養液中に蓄積したりボフラビンは０．８
５０／ｌであった。

　１２　一 実施例２ 実施例１の醗Ｍ？　Ｊ８地相成中、アデニンに代えで同
岱のヒボキサンチンを用いたばかは実施例１とｂ’ｉ１
様の培養を行４Ｔつだ、その結果４ノツカロミセス・廿
しビシＴ、　Ｐ−１５／ｌは、培養液中に１．４８（］
／１のリボフシピンを蓄積した。

実施例３ 実施例１で示した組成の！ＩＩ？酵培地３１を７１容シ
ト−ファーメンタ−に入れ、１２０℃で２０分間加熱滅
菌した。これにサツ力ロミレス・セレビシＴＰ−１５４
を接秤し３０℃′Ｃ−６０間通気撹拌培養を行なった（
０．５ｖ、ｖ、＋ｎ、、　４００ｒ１１ＩＩ）。

１８蓄終了後培養液中にはリボフラビンが１．４５Ｑ／
１蓄積していた。

この培養液７ＱＱｍｌを冷却、遠心分離（ることにＪ：
す、酵母菌体とりボフラビンの結晶との混合物を沈澱と
しで１７だ、この沈澱に水１１を加え。

８０℃で１．５時間抽出し、熱水抽出液を冷却すること
により純度９５．３％のりボフラビン結晶５１３ｍＱが
１りらねた。

　１３− この結晶を希１１ｉ！酸で再結晶すると９８％以−１の
純度のリボフラビン結晶が腎られた。

実施例４ 実施例１と同様にして液体前培養したリツ７Ｊ　ｒｌミ
セス・セレビをシエＰ−１５４を３０℃で６０間振盪培
養しリボフラビンを生産させた。醗酵培地組成は硫酸ア
ン七ニウムを３．８ｏ／＋とし。

亜鉛濃度を変えた。他の条（’Ｉは実施例１と同様であ
る。結果は第４−ｉｌ、ｉの通りであった。

第４表 　１４− 手続補１山（自発） 昭和５９年　９ｎ６口 ｑｂＦｆ庁長官　志賀　学　殿 １、事ｆ′１の表示 昭和５９８Ｔ特晶１願第　９９０９６月２、発明の名称 リボフラビンの製造法 ３、補１ＦをＪる者 事イりどの関係　特許出願人 １１所　大阪府堺市鉄砲町１番地 氏名　（２９０）ダイセル化学Ｔ業株式会召１）、補１
の対象 明細用の発明の詳細な説明の欄 ６、補ｌの内容 明細ｍ２Ｅ’３１＜Ｂｉ　〜２０行１ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｃ　ｉａｅ　Ｊをｉｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＪと補１１
−６２１−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ナソカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に
   属しプリン要求性を右するりボフラビン生産菌を培地中
   で培養して、リボフラビンを生成・？ｒｒ積けしめ、こ
   れを採取することを特徴とするりボフラビンの製造法