JPS60241896A - リボフラビンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、醗酵法によるリボフラビンの製造法に関す
るものである。更に詳しくは、サツカロミセス属に属し
３−アミノ−１，２，４−１−リアゾール耐性を右する
リボフラビン生産菌を培地中で培養して、生成・蓄積し
たりボフラピンを採取する製造法に関するものである。

この方法により、酢酸を炭素源とした醗酵法でリボフラ
ビンを効率良く製造することができる。

リボフラビンは医薬、飼料添加剤１食品用の着色剤など
として有用な物質である。

（従来技術） ｌＩ８醇法によるリボフシビンの製造法どして、ルモテ
−シウム・アシュビイ、７シ７ビア・ゴシッピイ、キＰ
ンディダ・フラレリイ、またはクロストリジウム・アｔ
？ｔ−ブチリカム等を糖質培地中で培養して、培養液中
にリボフラビンを生成・蓄積せしめる１ノ法が知られて
いる。（ブ【］グブレスインゲストリアル・ミクロバイ
オロジー１巻１３９負、　１９５９） 本発明者の一部は酢酸を腹水源とづる醗酵法によるリボ
フラビンの製造法を報告している　（ＡｇｒＢｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、、ｖｏｌ、　２８．ｐ、５５９．ｐ、５６６
、ｐ、７６５（Ｈ１６４））なお、上記文献においては
微生物の名称として−１１＞ディｙ−ｏブスタ（Ｃａｎ
ｄｉｄａ　ｒｏｂｕｓｔａ）が用いられているが、その
後キャンディダ・ロブスフの標準株（タイプストレイン
）において胞子が見出されているため、ロダー著ザ・イ
ースｈ　１９７０年版においては、キャンディダ・［１
ブスタはり一ッカロミセス・セレビシェ（ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ１ｓｉａｅ）に再分類され
ている。

しかし」上記文献で用いられた菌株については。

胞子形成は認められていないため、サツカロミセス・セ
レビシェの無胞子型であると考えられ１本明細用におい
ては、これをサツカロミセス・セレピシ−Ｔ、（Ｙ□ｒ
ンディダ・ロブスタ）と記載する、（発明の目的） 上記のような菌が知られているものの、醗酵法によるリ
ボフラビンの製造を工業的に実施するために解決すべき
課題はまだ多く、中でもリボフラビンの蓄積濃度および
生産速度の高い菌を得ることは重要である。

本発明はこのような視点のもとに、リボフラどン生産性
の＾い菌株を得て、これを用いたりボフラビンの新製造
林を提供することを目的と覆る。

（発明の構成） 本発明者は、上記サツカロミセス・セレビシェ（キャン
ディダ・ロブスタ）の改良につき鋭意研究した結果、３
−アミノ−１，２，４−ｔ−リアゾール耐性が付与され
た変異株の中にリボフラビン生産菌の八い菌株が（９ら
れることを見出し１本発明を完成した。

すなわち１本発明（まサツカロミセス属に属し３−アミ
ノ−１，２，４−１−リアゾール耐性株竹をｉするリボ
フラビン生産菌産菌を培地中で培養して、リボフラビン
を生成・蓄積せしめ、これを採取りることを特徴とする
リボフラごンの製造法である。

（使用する微生物） 本発明で使用する微生物は、サツカロミセス属に属し３
−アミノ−１，２，４〜］・リアゾール耐性を有するリ
ボフラビン生産菌であればいずれも用いることができ、
３−アミノ−１，２，４ｉ−リアゾール耐性を持つ点で
先行技術で用いられた菌と区別できる。好適な菌株の具
体例としてサツカロミセス・セレビシェ（キャンデイダ
・［１ブスタΔトＩＬＪ３４０５）および１ナツ力Ｄミ
セス・セレビシＴ、Ｐ−１５４（微Ｔ研菌寄第７５６２
月）からそれぞれ誘導された３〜アミノ−１，２，４−
トリアゾール耐性変異株である１ノツノＪ　「ｌミヒス
・ヒレビシＩＴＷ−５７３（微■研菌寄第７５６３号）
およびサツカロミセス・セレビシェＴ　Ｐ　−１０１０
（微工研菌奇第７５６４号）が挙げられる。

（菌株の取冑払） 本発明で使用する菌株は、サツカロミセス属に属するリ
ボフラビン生産菌を親株として１通常の変異誘導処理法
を適用することによって比較的容易に取得できる。

例えば親株としてサツカロミセス・セレビシェ（キｔ’
ンディダ・ロブスタＡＨＵ３４０５）（この菌は北ｍＢ
人学農学部のリストに載っている保存菌である）を用い
、紫外線照射あるいはＮ−メヂルーＮ′−二トローＮ−
二トロソグアニジン等の薬剤で処理後、第１表に示す組
成に加えて親株が生青し得ないような母の３−アミノ−
１，２゜４−１−リアゾールを含む寒天培地に塗抹し、
生育したコロニーを３−アミノ−１，２，４−１−リア
ゾール耐性変ｉ１１！株として連携する。

用いる親株が栄Ｗ！要求性を示す場合には第１表に示す
培地組成に東京性成分を添加し同様の方法で３−アミノ
−１，２，４〜トリアゾ一ルＭ竹変　５− 貨株を選択することができる。

族１表　培地組成 得られた変異株の３−アミノ−１，２，４−１〜リアゾ
ール耐性を確認するため、３−アミノ−１゜２．４〜ト
リアゾールに対Ｊる生育度実験を以下のごとく行なった
。すなわち親株と、これから誘導した３−アミノ−１，
２，４−１−リアゾール耐性株を生理食ｊ！水で洗浄し
、その懸濁液を第２表に記した吊の３−アミノ−１，２
，／１１〜リアゾールを添加した第１表記載の１８地５
ｍｌにそれぞれ接種し、３０℃にて２０間培養し、この
時点に　６　− おける生育度を６１０％ｍの吸光度により測定した。３
−アミノ−１，２，４−トリアゾールを添加しない場合
の１育磨を１００としたときの相対生育度を第２表に示
した。なおサツカロミセス・ヒレビシエＰ−１５４およ
びそれから誘導された÷ノッカロミセス・セレビシェＴ
Ｐ−１０１０について番よ、第１表にアデニン０．００
５％を加えた組成の培地を用いた。

第２表から、ＩＪ′ツカロミセス・セレビシェＴＷ−５
７３ｄ３よびリーツｈロミセス・セレビシＴ　Ｔ　Ｐ−
１０１０は明らかに３−アミン−１，２，１トリアゾー
ル耐性が付与されていることが確認される。

第２表　相対生育度 （培養方法） 本発明で使用する微生物を培養する方法を説明する。炭
素源としては酢酸、グルコン酸等の有機酸、グルコース
、シュクＯ−ス、キシロース等の糖質、エタノール、グ
リセリン等のアル」−ル類ぞの他が使用できる。

窒素源としては種々の形態の窒素化合物が使用でき１例
えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、炭酸アンモ
ニウム、尿素、アミノ酸、ポリペプトン等を用いること
ができる。

炭素源、窒素源の他にリン酸第１カリウム、ＦＡ酸マグ
ネシウム等の無機塩類を使用する。また３−アミノ−１
，２，４−トリアゾール耐性以外の性質１例えば栄養要
求性をも合せ持つような変異株では当然のことながら栄
養要求性物質を加える必要がある。

また、必要に応じビオチン等のビタミン類、アミノ酸、
核酸塩基などの微量栄養素を添加すれば。

リボフラビンの蓄積量を増す場合が多い。

寒天培地上に保存された酵母をリボフラビン生　９− 産培地に直接接種する場合、ｉＩＴ！鉛添加はりボフラ
ビンの生産について特に効果がないことが知られている
。しかし、寒天培地上の酵母を一度液体培地で前培養し
た後にリボフラビンを生成せしめる場合についてついて
は、直接接（÷の場合と異くＴす。

亜鉛を微量添加づることにＪ、す、リボフラビンの生産
性が著しく向上し、しかも鉄イオンの剛害効果を防こと
ができる。この改良製法（特願昭５８−１６５２４５）
を適用することも出来る。

前培養液のリボフラビン生産培地への植菌ωは３〜２５
％であることが好ましい０曲鉛イＡン添加但は０．１〜
１００ａ＋ａ／ｌを用いるが、最適ｎｍは培地中の鉄イ
オン濃度によりＩｌｉ！なり１例えば鉄イオンがＱ、１
ｍｇ／Ｉ以下の場合はＱ、５１１（］／ｌ程度の亜鉛イ
オンで十分であるが、鉄イオンが５０１！＋／１存在す
る場合には、１０〜３Ｑｍｇ／ｌ稈瓜添加づる必要があ
る。

培養には好気内果ｆ１がＱ（ましい、培地の１’）１１
は２ないし１０とするが、６ないし９に１！１節づれば
最も好ましい結宋が得られる。温度は、２０℃な−１〇
　− いし３７℃の範囲のうち、使用菌株のり育およびリボフ
ラビン生産性に適した温度を用いることができる。

このようにして１ｑられる培養液からのりボフラビンの
採取には公知の手法が適用できる９すなわち、培１！液
を６０℃〜１２０℃に加熱しりボフラピンを溶解させた
のち、遠心分離により酵母菌体と濾液に分離し、濾液を
必要に応じ濃縮したのち。

ハイドロサルファイドあるいは三塩化チタンにより還元
し、リボフラビンを沈降させる２このようにして得られ
たりボフラビンを空気中で酸化させたのち、水、耐酸水
溶液等の溶媒を用いて再結晶をおこない、精製すること
が可能である。

本発明は基質として糖蜜を用いる場合と異なり。

培養液中に複雑な組成の不純物がないので１次のような
簡単なプロセスによっても、高純度のりボフラビン結晶
を採取することかり能である。すなわち培養液、あるい
は培養液の冷却・遠心分離により（ｑられる菌体とリボ
フラビン結晶の混合物に。

水を加えて６０℃〜１２０℃に加熱し、リボフラ　１１
− ビンを溶解させたのち、熱部濾過により菌体と濾液に分
１ｌｌｌＩする。溶液を必要に応じ濃縮したのり！’］
冷却する事により菌体から分離された結晶リボフラビン
を（９ることができる。この結晶を水、Ｆｒ１Ｍ水溶液
、塩酸水溶液等の溶媒を用いて再結晶（れば高純瓜リボ
フラビン結晶が（ワられる。

以下実施例により説明Ｊる。

実施例１ 勺ツ力ロミセス・セレビシＩＴＶ１５７３を。

グル］−ス２％、ボリペブｌ〜ン０．５％、Ａ？Ｉｎ、
−ｒキス０．３％、麦芽エキス０．３％を含む前１ｒＸ
葺培地１００ｍ１に接種し、３０℃で３０８５間１＆１
培養した。この前培養液を下記のＩｔ！ｌ醇培地に１２
゜６％の植菌鑓で接種し、３０℃で６日間振掃ｊ８差し
た。培養液中に蓄積したリボフラビンのｆｆ１１ま１゜
４７Ｆ／Ｉであった。

比較のためサツカロミセス・セレビシＪ４Ｗ−５７３に
代えて、イの親株であるリーツカロミセス・セレビシェ
（キャンデイダ・［１ブスタ△１１Ｕ３４０５）を用い
た場合、培養液中に蓄積したリボ　１２− フラビンの岳は０．８５ａ／Ｉであった。

醗酵培地組成 醋酸カルシウム　１０３Ｇ／１ （Ｎ　ト（４）　２　Ｓ　０４　３　ｇ　／　ＩＫ　Ｌ
ｌ　２　Ｐ　Ｏ４２（１）　／　ＩＭｑＳｏ　・７１−
１２０　１ａ／Ｉ Ｚｎ５Ｏ−７１−１２０２，２ｍｑ／Ｉｐｔ−１７，０ このようにして１ｑられた培養液１．２１を冷却。

遠心分離することにより酵母菌体とリボフラビン結晶と
の混合物を沈澱として得た。この沈澱に水２１を加え８
０℃で１．５時間抽出し、熱水抽出液を１１に濃縮した
後冷却することにより純度９７．３％のリボフラビン結
晶８９５ｍＱが得られた。

実施例２ 実施例１と同様にして液体前培養した勺ツカロミヒス・
セレビシェＴＷ−５７３を３０℃で９日間１［１ｉ培養
しリボフラビンを生産させた。ＦｉＪＭ培地組成は硫酸
アンモニウムを３．８（１／ｌとし。

−１３− 亜鉛温石を変えた他実施例１と同様である。結果は第３
表の通りであった。

実施例３ リツ力ロミレス・セレビシＪ、Ｔｒ）−１０１０を用い
実施例１と同様の方法で培養を行なった。醗酵培地には
実施例１の組成にアデニン０．１％を加えである。その
結果ＴＰ−１０１０は培養液中に２．５００／ｌのリボ
フラビンを蓄積した５実施例４ １４− 実施例１と同様にして液体前培養したリーツカロミヒス
・しレビをシＴＴＰ−１０１０を３０℃で１０１間培養
しりボフラピンを生産させた。ＩＩ！１酊培地組成は硫
酸アンモニウムを３．８ｏ／Ｉとし。

亜鉛濃度を疫えた他実論例３と同様である。結果は第４
表の通りであった。

第４表 　１５− 手続補正内（自発） 昭和５９年　９月　乙［１ 特許庁長官　志賀　学　殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第　９９０９７号 ２、発明の名称 リボフラビンの製造り法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　大阪府堺市鉄砲町１番地 氏名　（２９０）ダイセル化学Ｔ業株式会拐５、補正の
対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 明細書８頁第２表の最上段中欄［３−アミノ−１，２，
４−１−リアシー）ｌｉ濃Ｕ　ヲｒ３−７ミ／　−１，
２，４−トＩＪ／’ゾール８１１１　（ｍＭ）　Ｊと補
正 °パ・パ・、“ン　１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｒ＊ｙｃｅＳ）　ｆ
   ｄ、に属し３−アミノ−１，２，４−１−リアゾール耐
   性を有するリボフラビン生産菌を培地中で培養して、リ
   ボフラビンを生成・蓄積せしめ、これを採取することを
   特徴とするりボフラビンの製造方法