KR920008384B1 - 스피쿨리스포린산의 분리 및 정제방법 - Google Patents

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Description

스피쿨리스포린산의 분리 및 정제방법

제1도는 25℃에서 유기용매와 물의 부피 혼합비율에 따른 락톤형 스피쿨리스포린산의 용해도를 나타낸 그래프이다.

제2도는 25℃에서 유기용매와 물의 부피 혼합비율에 따른 사슬형 스피쿨리스포린산의 용해도를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 스피쿨리스포린산(Spiculisporic acid)의 분리 및 정제방법에 관한 것으로서, 특히 스피쿨리스포린산을 분비하는 미생물 배양액으로부터 유기용매를 이용하여 스피쿨리스포린산을 분리, 정제하는 방법에 관한 것이다.

스피쿨리스포린산은 다쯔요시 고바야시 등(미국특허 제3,625,820호)에 의해 페니실리움 스피쿨리스포리움(Penicillumspiculisporium, ATCC 16071)등의 곰팡이가 분비하는 유기산의 일종으로서, 알카리 무기염류, 예를들면 수산화나트륨, 또는 수산화칼륨과 반응하여 1Na염, 2Na염, 3Na염을 형성하여 수용액의 계면활성을 갖고 있기 때문에 생물 계면활성제로서, 안정제(일본특개소 60-31821호), 분산제(일본특개소 60-255840호), 화장품 소제(일본특개소 62-30546호), 리포좀 형성제(일본특개소 63-10644호)등에 널리 사용되고 있다.

종래에는 배양액중에 생성된 사슬형 스피쿨리스포린산(3-Hydroxy-3, 4-dicarboxy pentadecanoic acid)을 분리 및 정제하기 위하여, 우선 배양액을 가열한 후 여과시켜 균체를 제거하거나, 알칼리성분을 투여하여 중화시킨 후 여과하여 균체를 제거하고 그 여과액을 1시간 이상 70℃-100℃로 가열하여 여과액중에 들어 있는 사슬형 스피쿨리스포린산을 락톤형(Lacton Type)으로 전환하고 냉각시킴으로써, 용해도 차이를 이용하여 스피쿨리스포린산을 분리 및 정제하였다(미국특허 제 3,625,826호).

그러나, 이러한 종래의 방법에서는 가온 후 균체를 제거할 때 스피쿨리스포린산이 다량 소실되거나, 사슬형에서 락톤형으로 전환하기 위하여 가열할 때 색소나 불용성 단백질등의 제거하기 어려운 불순물이 생기게 되는 문제점이 있었다.

에 본 발명에서는 종래기술의 이러한 문제점을 해결하기 위하여 유기용매를 이용하여 미생물 발효배양액으로부터 스피쿨리스포린산을 추출하므로써 보다 간단한 공정으로 고순도 및 고수율의 스피쿨리스포린산을 분리 정제해낼 수 있는 새로운 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 스피쿨리스포린산을 분비하는 미생물의 발효배양액으로부터 스피쿨리스포린산을 분리, 정제해 내는 방법에 있어서, 우선 발효배양액을 농축시키고, 그 농축물에 유기용매를 투입하여 스피쿨리스포린산을 추출해낸 다음 여과하여 균체와 불순물을 제거하고, 이렇게 하여 얻어진 스피쿨리스포린산 추출액을 감압 농축기를 이용, 유기용매를 증발시켜 유기용매에 대한 수분의 비율(유기용매 : 수분)이 1대 4 이하의 부피비가 되도록 농축시키므로서 사슬형의 스키쿨리스포린산의 용해도가 급격히 하락하여 결정이 석출되도록 하는 것을 특징으로 하는 스피쿨리스포린산의 정제방법인 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 친균주 페니실리움 스피쿨리스포리움(P. Spiculisporium, 기탁번호 : ATCC 16071)의 포자를 분리하여 생산성이 양호한 균주를 선별하고 이어서 포도당 15∼20%, 염화암모니움 0.1∼1%, 제1 인산칼륨 0.05∼0.5%, 제2인산칼륨 0.05∼0.5%, 함수황산마그네슘 0.01∼0.1% 옥수수 침지액 0.05∼0.5% 등을 증류수에 녹인 배지를 500ml 진탕 플라스크에 100ml씩 충진하고 여기에다 상기 선별된 균주를 접종하여 30℃, 회전수 180 RPM인 항은 진탕 배양기에서 7일 동안 배양한다. 배양액중의 스피쿨리스포린산의 함량은 가스크로마토그라피를 이용 다음과 같은 조건에서 정량하였다. 사용 기종은 휠레트 팩카드사의 HP-5890A이며, 컬럼은 OV-1, 오븐온도는 260℃, 기체유속은 7.0ml/분, 시료투여기 온도(Injectiontemp)300℃, 검출기 온도(Detection temp) 320℃로 하고 시료의 전처리는 시료 5ml와 에탄올 15ml를 시험관에 넣어 잘 흔들고, 무수황산나트륨 20g을 넣어 충분히 흔든 다음, 종이여과지(Watman No. 2)를 이용여과한 후 1㎕씩 취하여 가스크로마토그라피로 분석하였다.

이와 같이 하여 배양이 완료되면, 본 발명에 따라 배양액으로부터 용매추출에 의해 스피쿨리스포린산을 분리하게 되는데, 우선 종이여과지나 한외여과막을 이용하여 가능한한 수분이 적도록 배양액을 충분히 농축시킴으로서 필요한 유기용매의 양을 줄일 수 있으며, 농축된 배양액에다 본 발명에 따른 유기극성 용매중 특히 유기 그룹의 분자량이 적은 강한 극성 용매, 예를들면 아세톤, 메탄올 또는 에탄올을 투입, 서서히 교반하여 스피쿨리스포린산을 추출하고 한외여과막이나 여과지를 이용하여 균체와 불순불을 여과, 제거한다.

이때 유기용매의 투입량은 첨부한 도면 제1도 및 제2도에서 알 수 있는 바와 같이 농축배양액중의 수분함량 : 유기용매가 1대 9 내지 3대 7의 비율이 되도록한다. 즉 제1도 및 제2도는 각각 용매 사용량에 따른 락톤형 및 사슬형 스피쿨리스포린산의 용해도를 나타낸 것으로서, 이들 도면에서 보면 농축배양액중의 수분 : 유기용매가 상기 범위에서 함유될 경우 농축물중의 스피쿨리스포린산이 가장 많이 용해되어 있는 것을 알 수 있다. 여기서 유기용매는 스피쿨리스포린산 농축물중에서 불순물을 제외한 스피쿨리스포린산만 용해시켜 추출효율증대와 불순물제거에 효과적인 역할을 하는 데, 만일 1 : 9이상으로 유기용매의 비율을 높일 경우 스피쿨리스포린산의 용해도가 오히려 감소하여 추출 효과가 저하되며 3 : 7이하의 비율로 넣을 경우 균체와 균체들이 생성한 단백질의 침전형성이 곤란하여 불순물 제거율이 현저히 감소할 수 있다. 이렇게 하면 균체와 불순물이 제거된 스피쿨리스포린산 추출액이 얻어진다.

계속해서 감압농축기를 통하여 스피쿨리스포린산 추출액에서 아세톤이나 메탄올, 에탄올을 증발시킴으로 회수율을 향상시킬 수 있는데 이때 유기용매에 대한 수분비율(유기용매 : 수분)1 : 4이하가 되면 스피쿨리스포린산의 용해도가 급격히 감소하여 결정이 석출되어 침전이 생긴다. 이때 형성된 침전물인 스피쿨리스포린산은 사슬형으로서, 이를 회수한 후 냉각 증류수로 세척 건조하면 스피쿨리스포린산을 무정형의 백색분말형태로 얻을 수 있으며, 더욱 순도를 높이기 위하여 이를 다시 증류수에 넣고 100℃에서 1시간 동안 가열한 후 냉각시키면 락톤형으로 쉽게 전환되어 고순도의 편상의 결정인 스피쿨리스포린산을 백색분말로 얻을 수 있다.

이와 같이 본 발명에서는 배양중 생성된 스피쿨리스포린산이 배양액속에서 입상형의 결정(Needle like crystal)을 형성(0.5㎛×0.5㎛×2㎛이상)하기 때문에 여과지 또는 한외여과막을 이용하여 발효여액을 제거한 후, 균체와 함께 농축된 스피쿨리스포린산을 아세톤, 메탄올, 에탄올과 같은 유기용매로 추출한 다음 여과하여 균체와 불순물을 제거하고, 유기용매와 물의 비율을 적절히 변화시켜 용해도를 급격히 하락시킴으로서 결정을 석출시켜 침전물을 고순도, 고수율로 회수하므로써 간단한 방법으로 고순도, 고수율의 스피쿨리스포린산을 분리, 정제하는 방법인 것이다.

이하, 본 발명에 대한 실시예를 들어보면 다음과 같다.

[실시예 1]

포도당 18%, 염화암모니움 0.2%, 제1인산칼륨 0.1%, 제2인산칼륨 0.1%, 함수 황산마그네슘 0.06%, 옥수수 침지액 0.1% 등을 증류수에 녹인 배지 300ℓ를 450ℓ발효조에 넣은 다음 121℃에서 20분간 멸균한 후, 여기에다 생산성이 양호한 것으로 선별된 균주를 통기량 1VVM, 교반속도 200RPM, 배양온도 28℃로 하여 8일 동안 배양하였다. 배양이 종료되었을 때 배양액중의 스피쿨리스포린산의 농도는 65g/ℓ하였다. 배양이 완료된 배양액을 한외여과막(분자량 20000이하 통과시킴)을 이용, 가능한한 수분함량을 줄일 수 있도록 균체와 스피쿨리스포린산 결정을 농축시킨 다음, 농축물중의 수분함량과 아세톤의 부피가 1대 9가 되도록 아세톤을 투입하고 서서히 교반시켜 스피쿨리스포린산을 추출한 다음, 종이여과지(Watman No. 2)를 사용하여 균체와 불용성 단백질을 제거하였다. 이어서 감압농축기(Evaporater)로 농축하여 아세톤을 회수하고 농축액중 아세톤에 대한 수분의 비율(아세톤 : 수분)이 2대 8이하가 되도록 증발시킴으로써, 결정을 석출, 침전을 형성시킨 다음 이 결정을 증류수에 넣고 세척한 후 회수하였다.

[실시예 2]

실시예 1에서 농축물중의 수분함량대 아세톤의 사용량을 1 : 4의 부피비로 하는 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[실시예 3]

실시예 1에서 농축물중의 수부함량대 아세톤의 사용량을 3 : 7의 부피비로 하는 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[실시예 4]

실시예 2에서 아세톤 대신 에탄올을 넣어 주며 그외 과정은 실시예 2와 동일하게 실시하였다.

[실시예 5]

실시예 3에서 아세톤 대신 에탄올을 넣어 주며 그외 과정은 실시예 3과 동일하게 실시하였다.

[실시예 6]

실시예 2에서 아세톤 대신 메탄올을 넣어 주며 그외 과정은 실시예 2와 동일하게 실시하였다.

[실시예 7]

실시예 3에서 아세톤 대신 메탄올을 넣어 주며 그외 과정은 실시예 3와 동일하게 실시하였다.

[실시예 8]

락톤형의 스피쿨리스포린산을 얻기 위하여 실시예 1에서 얻은 침전물을 100℃에서 1시간 동안 가열한 후 냉각시키면 결정을 석출, 침전을 형성하게 된다.

[실시예 9]

락톤형의 스피쿨리스포린산을 얻기 위하여 실시예 1에서 농축액을 100℃에서 1시간 가열한 후 아세톤을 넣어 주는 이하 과정은 실시예 1과 동일하게 실시한다.

[실시예 10]

실시예 12에서 아세톤 대신 에탄올을 넣어 주며 그외 과정은 실시예 12와 동일하게 실시하였다.

[비교예 1]

실시예 1에서 농축물중의 수분함량대 무게와 아세톤의 사용량을 2 : 3의 부피비로 하는 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

[비교예 2]

실시예 4에서 아세톤 대신 에탄올을 넣어 주며 그외 과정은 실시예 4와 동일하게 실시하였다.

[비교예 3]

실시예 4에서 아세톤 대신 메탄올을 넣어 주며 그외 과정은 실시예 4와 동일하게 실시하였다.

[비교예 4]

공지의 방법(J. Ferm, Technol, 55(1)37-42 1977)을 응용한 정제방법으로 아래와 같은 순서로 실시하였다.

배양액을 90℃로 가열한 후 종이여과지(Watman No.2)를 이용하여 보온된 상태에서 여과를 실시하여 균체를 제거하고 그 여액을 100℃에서 1시간 동안 가열한 후 냉각시켜서 스피쿨리스포린산의 결정을 산출, 침전을 형성하도록 하였다. 형성된 침전을 증류수에 넣고 세척한 후 회수하였다.

[비교예 5]

공지의 방법(U.S. Pat 3625826)을 응용한 정제방법으로 아래와 같은 순서로 실시하였다. 배양액에 수산화나트륨이나 수산화칼륨을 넣어 pH가 9.6이 되도록 하고, 종이여과지(Watman No. 2)를 이용, 여과를 실시하여 균체를 제거한 후, 그 여액을 100℃에서 1시간 동안 가열하고 염산을 넣어 pH를 3.6으로 낮춘 다음, 스피쿨리스포린산의 침전을 형성하도록 하였다. 이 침전을 회수하여 증류수에 세척한 후 회수하였다.

상기 실시예와 비교예의 결과를 요약하면 다음 표 1과 같다.

[표 1]

상기 비교예 1,2,3의 경우는 유기용매의 사용량이 본 발명의 범위를 벗어나는 범위(수분함량 : 유기용매가 2 : 3인 경우)일 때, 또 비교예 4,5는 공지의 방법인 경우를 예시한 것인 바, 이때 회수율 및 순도가 실시예에 비하여 낮은 것을 알수 있다.

Claims (3)

1. 스피쿨리스포린산을 분비하는 미생물 페니실리움 스피쿨리스포리움(ATCC 16071)의 발효배양액으로부터 스피쿨리스포린산을 분리정제해내는 방법에 있어서, 상기 발효배양액을 농축시키고, 그 농축배양물에 유기용매를 투입하여 스피쿨리스포린산을 추출해낸 다음 여과하여 균체와 불순물을 제거하고, 이렇게 하여 얻어진 스피쿨리스포린 추출액에서 유기용매를 증발시켜 유기용매에 대한 수분량의 비율(유기용매 : 수분)이 1대 4이하가 되도록 농축시켜서 스피쿨리스포린산 결정을 석출하는 것을 특징으로 하는 스피쿨리스포린산의 분리정제 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 유기용매는 아세톤, 메탄올 또는 에탄올중에서 어느 하나를 사용함을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유기용매의 사용량은 농축배양물의 수분함량에 대하여 수분 : 유기 용매가 1대 9 내지 3대 7의 부피비로 되도록 투입 사용함을 특징으로 하는 방법.

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