JP2828343B2 - 天然アベルメクチンの沈殿方法 - Google Patents
天然アベルメクチンの沈殿方法Info
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- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
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- C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
- C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明が関係する技術分野は、アベルメクチン化合物
の単離および精製法、特にアベルメクチン化合物を発酵
ブロスから抽出する方法である。
の単離および精製法、特にアベルメクチン化合物を発酵
ブロスから抽出する方法である。
アベルメクチンは一群の広域マクロライド系駆虫薬で
ある。それらは微生物ストレプトミセス・アベルミチリ
ス（Streptmyces avermitilis）の菌株（たとえばATCC
31267、31271もしくは31272またはその変異株）を好
気性条件下で、無機塩類ならびに同化しうる炭素源およ
び窒素源を含有する水性栄養培地中において発酵させる
ことにより産生される。一般にアベルメクチンは、個々
の置換基を示すために種々の文字および数字を用いる命
名システムで表示されている。
ある。それらは微生物ストレプトミセス・アベルミチリ
ス（Streptmyces avermitilis）の菌株（たとえばATCC
31267、31271もしくは31272またはその変異株）を好
気性条件下で、無機塩類ならびに同化しうる炭素源およ
び窒素源を含有する水性栄養培地中において発酵させる
ことにより産生される。一般にアベルメクチンは、個々
の置換基を示すために種々の文字および数字を用いる命
名システムで表示されている。
天然アベルメクチンであるアベルメクチンの副分類に
は、下記の化合物が含まれる:C5位がメトキシで置換さ
れたもの（Ａで表される）またはヒドロキシで置換され
たもの（Ｂで表される）;C25位がsec−ブチルで置換さ
れたもの（ａで表される）またはイソプロピルで置換さ
れたもの（ｂで表される）；およびC23位がヒドロキシ
で置換されるか（２で表される）またはC22位に二重結
合により結合したもの（１で表される）。従って８種類
の天然アベルメクチンが存在する可能生があり、個々の
化合物はBlaまたはB2bのように記号の組み合わせを用い
て示される。さらに副分類の天然アベルメクチンは、た
とえばＢ天然アベルメクチンという用語を用いて示すこ
とができる。Ｂ天然アベルメクチンは、C5位がヒドロキ
シで置換され、C25位がイソプロピルまたはsec−ブチル
のいずれかで置換され、かつC23位がヒドロキシで置換
されるか、またはC22位に二重結合により結合した４種
類の天然アベルメクチンを示す。これら８種類の天然ア
ベルメクチン化合物（時にはＣ−076化合物と呼ばれ
る）の単離および化学構造は英国特許第1573955号明細
書に詳述されている。
は、下記の化合物が含まれる:C5位がメトキシで置換さ
れたもの（Ａで表される）またはヒドロキシで置換され
たもの（Ｂで表される）;C25位がsec−ブチルで置換さ
れたもの（ａで表される）またはイソプロピルで置換さ
れたもの（ｂで表される）；およびC23位がヒドロキシ
で置換されるか（２で表される）またはC22位に二重結
合により結合したもの（１で表される）。従って８種類
の天然アベルメクチンが存在する可能生があり、個々の
化合物はBlaまたはB2bのように記号の組み合わせを用い
て示される。さらに副分類の天然アベルメクチンは、た
とえばＢ天然アベルメクチンという用語を用いて示すこ
とができる。Ｂ天然アベルメクチンは、C5位がヒドロキ
シで置換され、C25位がイソプロピルまたはsec−ブチル
のいずれかで置換され、かつC23位がヒドロキシで置換
されるか、またはC22位に二重結合により結合した４種
類の天然アベルメクチンを示す。これら８種類の天然ア
ベルメクチン化合物（時にはＣ−076化合物と呼ばれ
る）の単離および化学構造は英国特許第1573955号明細
書に詳述されている。
アベルメクチンを増殖培地から単離するためには、ま
た増殖培地から特定のアベルメクチンを単離するために
は、多様な方法がある。たとえば米国特許第4,423,211
号明細書には、発酵ブロスのpHを鉱酸、たとえば硫酸、
塩酸または硝酸で1.5−６の範囲内に調整する方法が記
載されている。次いでブロスを抽出剤、たとえばトルエ
ンと接触させ、それと共に撹拌し、アベルメクチン化合
物を抽出剤中へ溶解し、採取する。次いでアベルメクチ
ンおよび抽出剤からなる溶液を分離器に導通して抽出剤
をストリッピングし、残存アベルメクチンをたとえば結
晶化により単離する。
た増殖培地から特定のアベルメクチンを単離するために
は、多様な方法がある。たとえば米国特許第4,423,211
号明細書には、発酵ブロスのpHを鉱酸、たとえば硫酸、
塩酸または硝酸で1.5−６の範囲内に調整する方法が記
載されている。次いでブロスを抽出剤、たとえばトルエ
ンと接触させ、それと共に撹拌し、アベルメクチン化合
物を抽出剤中へ溶解し、採取する。次いでアベルメクチ
ンおよび抽出剤からなる溶液を分離器に導通して抽出剤
をストリッピングし、残存アベルメクチンをたとえば結
晶化により単離する。
さらに米国特許第5,077,398号明細書には、アベルメ
クチン副有ブロスの水−非混和性溶剤抽出液濃縮物から
アルコールまたは炭化水素／アルコール混合物を用いて
B1成分を結晶化させる２工程法が記載されている。B2成
分は残留抽出物（B1結晶化後に残存するもの）から、そ
の過飽和（たとえば温度低下による）後にB2種結晶を用
いて結晶化される。
クチン副有ブロスの水−非混和性溶剤抽出液濃縮物から
アルコールまたは炭化水素／アルコール混合物を用いて
B1成分を結晶化させる２工程法が記載されている。B2成
分は残留抽出物（B1結晶化後に残存するもの）から、そ
の過飽和（たとえば温度低下による）後にB2種結晶を用
いて結晶化される。
前記の方法は技術を進歩させたが、これらの方法はな
お非水性溶剤の使用に依存しており、環境問題のため可
能な限り溶剤の使用を少なくすることが指示される。従
ってアベルメクチンを単離するための新規方法の探索が
依然として続けられている。
お非水性溶剤の使用に依存しており、環境問題のため可
能な限り溶剤の使用を少なくすることが指示される。従
ってアベルメクチンを単離するための新規方法の探索が
依然として続けられている。
発明の概要 本発明は、天然アベルメクチンを含有する発酵ブロス
から水性沈殿法により天然Ｂアベルメクチンを分離する
方法を目的とする。本方法は、天然アベルメクチンを発
酵ブロスから水混和性溶剤で抽出し、そして天然Ｂアベ
ルメクチンを沈殿させるのに十分な水を添加することを
含む。好ましくは水混和性溶剤はC1−C3アルコール、ア
セトンまたはアセトニトリルである。さらに酸、塩基、
塩類または界面活性剤を添加して沈殿を促進することが
できる。好ましくは酸、塩基または塩類は、ナトリウ
ム、カリウム、カルシウム、アンモニウムまたは水素カ
チオン、およびクロリド、ホスフェート、スルフェー
ト、ニトレート、バイカーボネート、カーボネートまた
はヒドロキシドアニオンを有する。界面活性剤は好まし
くはラウリル硫酸ナトリウムである。
から水性沈殿法により天然Ｂアベルメクチンを分離する
方法を目的とする。本方法は、天然アベルメクチンを発
酵ブロスから水混和性溶剤で抽出し、そして天然Ｂアベ
ルメクチンを沈殿させるのに十分な水を添加することを
含む。好ましくは水混和性溶剤はC1−C3アルコール、ア
セトンまたはアセトニトリルである。さらに酸、塩基、
塩類または界面活性剤を添加して沈殿を促進することが
できる。好ましくは酸、塩基または塩類は、ナトリウ
ム、カリウム、カルシウム、アンモニウムまたは水素カ
チオン、およびクロリド、ホスフェート、スルフェー
ト、ニトレート、バイカーボネート、カーボネートまた
はヒドロキシドアニオンを有する。界面活性剤は好まし
くはラウリル硫酸ナトリウムである。
本発明は、非水性溶剤による沈殿法に代わりに水性沈
殿法を用いる方法を提供することによりアベルメクチン
単離の分野に著しい貢献をなす。非水性溶剤の使用を減
らすことは、経済、環境および安全上の利益をもたら
す。沈殿の選択性−これは生成物の精製に寄与する−−
は水混和性有機溶剤中の水分量に対するアベルメクチン
の溶解度の依存性が強いことを利用している。本方法は
種々の化合物種（たとえば酸、塩基、塩類、界面活性
剤）を添加して、沈殿性を変化させ（たとえば油状沈殿
ではなく、顆粒状沈殿）、かつ優先成分の選択性を高め
る（たとえばB2成分よりB1成分を）ことにより変更しう
る。
殿法を用いる方法を提供することによりアベルメクチン
単離の分野に著しい貢献をなす。非水性溶剤の使用を減
らすことは、経済、環境および安全上の利益をもたら
す。沈殿の選択性−これは生成物の精製に寄与する−−
は水混和性有機溶剤中の水分量に対するアベルメクチン
の溶解度の依存性が強いことを利用している。本方法は
種々の化合物種（たとえば酸、塩基、塩類、界面活性
剤）を添加して、沈殿性を変化させ（たとえば油状沈殿
ではなく、顆粒状沈殿）、かつ優先成分の選択性を高め
る（たとえばB2成分よりB1成分を）ことにより変更しう
る。
本発明の他の目的および利点は以下の詳細な記述およ
び請求の範囲からより明らかになるであろう。
び請求の範囲からより明らかになるであろう。
発明の詳細な記述 本発明方法には、目的生成物である天然Ｂアベルメク
チンまたはそれらのアベルメクチンの混合物を、好まし
くは約0.2g/1より高い濃度で含有する任意のアベルメク
チンブロスを使用しうる。アベルメクチンブロスとは、
適宜な培養物、一般にストレプトミセス・アベルミチリ
スの菌株の発酵の結果であるアベルメクチン含有培地を
意味する。ただしそれは、その発酵により得られる固体
または固体懸濁液（大部分のアベルメクチンを含有す
る）をも包含するものとする。それらの固体は発酵物か
ら遠心分離または濾過などの方法で濃縮することができ
る。本方法の効率の程度は、水性溶剤混合物中における
アベルメクチン溶解度特性およびブロスからの不純物の
溶解度特性に起因する、ブロス中におれる目的アベルメ
クチンの濃度に依存する。これらの特性のため、目的ア
ベルメクチンの収率および本方法により回収される生成
物の品質は、ブロス中の目的アベルメクチンの濃度が上
昇するのに伴って向上する。目的アベルメクチンのブロ
ス濃度は約0.2g/1より高いことが好ましい。これによっ
てより高い収率および向上した生成物品質から得られる
からである。
チンまたはそれらのアベルメクチンの混合物を、好まし
くは約0.2g/1より高い濃度で含有する任意のアベルメク
チンブロスを使用しうる。アベルメクチンブロスとは、
適宜な培養物、一般にストレプトミセス・アベルミチリ
スの菌株の発酵の結果であるアベルメクチン含有培地を
意味する。ただしそれは、その発酵により得られる固体
または固体懸濁液（大部分のアベルメクチンを含有す
る）をも包含するものとする。それらの固体は発酵物か
ら遠心分離または濾過などの方法で濃縮することができ
る。本方法の効率の程度は、水性溶剤混合物中における
アベルメクチン溶解度特性およびブロスからの不純物の
溶解度特性に起因する、ブロス中におれる目的アベルメ
クチンの濃度に依存する。これらの特性のため、目的ア
ベルメクチンの収率および本方法により回収される生成
物の品質は、ブロス中の目的アベルメクチンの濃度が上
昇するのに伴って向上する。目的アベルメクチンのブロ
ス濃度は約0.2g/1より高いことが好ましい。これによっ
てより高い収率および向上した生成物品質から得られる
からである。
前記アベルメクチンブロスから天然アベルメクチンを
抽出するためには、天然アベルメクチンを抽出すること
ができ、かつ目的とする最終生成物に有害な作用を及ぼ
さない任意の水混和性溶剤を使用しうる。一般に水混和
性溶剤はC1−C3アルコール、アセトンまたはアセトニト
リルである。好ましくは溶剤はC1−C3アルコールであ
り、溶剤がメタノールであることが特に好ましい。目的
とする天然アベルメクチンを抽出することができる任意
の量の溶剤を使用しうる。一般にブロスまたは濃縮ブロ
スに対して約150−約300重量％の溶剤が使用される。約
150％未満では目的とする天然アベルメクチンの有意量
がブロススラリーの固相と結合したまま残され、約300
％より多量では目的外の発酵副生物が抽出される可能性
があり、かつ不必要に溶剤が浪費されるからである。固
体は抽出物から標準法、たとえば濾過または遠心分離に
より除去される。
抽出するためには、天然アベルメクチンを抽出すること
ができ、かつ目的とする最終生成物に有害な作用を及ぼ
さない任意の水混和性溶剤を使用しうる。一般に水混和
性溶剤はC1−C3アルコール、アセトンまたはアセトニト
リルである。好ましくは溶剤はC1−C3アルコールであ
り、溶剤がメタノールであることが特に好ましい。目的
とする天然アベルメクチンを抽出することができる任意
の量の溶剤を使用しうる。一般にブロスまたは濃縮ブロ
スに対して約150−約300重量％の溶剤が使用される。約
150％未満では目的とする天然アベルメクチンの有意量
がブロススラリーの固相と結合したまま残され、約300
％より多量では目的外の発酵副生物が抽出される可能性
があり、かつ不必要に溶剤が浪費されるからである。固
体は抽出物から標準法、たとえば濾過または遠心分離に
より除去される。
目的とする天然Ｂアベルメクチンを選択的に沈殿させ
るためにアベルメクチンの水混和性溶剤抽出物に水のみ
を添加してもよいが、沈殿を促進するために一般に酸、
塩基、塩類または界面活性剤（沈殿促進剤）を水と共に
添加する。好ましくは酸、塩基または塩類は、ナトリウ
ム、カリウム、カルシウム、アンモニウムまたは水素カ
チオン、およびクロリド、ホスフェート、スルフェー
ト、ニトレート、バイカーボネート、カーボネートまた
はヒドロキシドアニオンを有する。酸、塩基または塩類
が、塩化ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸、炭酸水素
ナトリウム、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムで
あることが特に好ましい。塩化ナトリウムまたは炭酸水
素ナトリウムの添加は沈殿の取り扱い性を向上させるの
で、特に有利である。沈殿を促進する（たとえば向上し
た沈殿性を付与する）任意の界面活性剤を使用しうる
が、界面活性剤はアニオン性またはカチオン性であるこ
とが好ましく、特に好ましくは界面活性剤はスルホン酸
アルキル、たとえばラウリル硫酸ナトリウムである。さ
らに、沈殿を促進する上記の酸、塩基、塩類または界面
活性剤の組み合わせも使用しうる。たとえば塩類と界面
活性剤の組み合わせ、たとえば塩化ナトリウムとラウリ
ル硫酸ナトリウムの組み合わせは、良好な純度および望
ましい取り扱い性を備えた沈殿を与えるので、特に有利
である。
るためにアベルメクチンの水混和性溶剤抽出物に水のみ
を添加してもよいが、沈殿を促進するために一般に酸、
塩基、塩類または界面活性剤（沈殿促進剤）を水と共に
添加する。好ましくは酸、塩基または塩類は、ナトリウ
ム、カリウム、カルシウム、アンモニウムまたは水素カ
チオン、およびクロリド、ホスフェート、スルフェー
ト、ニトレート、バイカーボネート、カーボネートまた
はヒドロキシドアニオンを有する。酸、塩基または塩類
が、塩化ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸、炭酸水素
ナトリウム、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムで
あることが特に好ましい。塩化ナトリウムまたは炭酸水
素ナトリウムの添加は沈殿の取り扱い性を向上させるの
で、特に有利である。沈殿を促進する（たとえば向上し
た沈殿性を付与する）任意の界面活性剤を使用しうる
が、界面活性剤はアニオン性またはカチオン性であるこ
とが好ましく、特に好ましくは界面活性剤はスルホン酸
アルキル、たとえばラウリル硫酸ナトリウムである。さ
らに、沈殿を促進する上記の酸、塩基、塩類または界面
活性剤の組み合わせも使用しうる。たとえば塩類と界面
活性剤の組み合わせ、たとえば塩化ナトリウムとラウリ
ル硫酸ナトリウムの組み合わせは、良好な純度および望
ましい取り扱い性を備えた沈殿を与えるので、特に有利
である。
天然Ｂアベルメクチンを水混和性溶剤によるブロス抽
出物から選択的に沈殿させるのに有効な任意量の水を使
用しうる。一般に目的生成物を沈殿させるために添加す
る水の量は抽出物の最初の水分および目的アベルメクチ
ンの濃度に依存する。水を添加したのちの混合物の望ま
しい水濃度は、最終混合物の約45−約75重量％である。
好ましくは水の添加により約50−約65重量％の水濃度と
なる。好ましい水の量は添加される酸、塩基、塩類また
は界面活性剤の種類および量に従って異なる可能性があ
る。たとえば前記の添加物を使用しない場合は一般に、
より多量の水を使用することが好ましい。さらに特定の
天然Ｂアベルメクチンの選択的沈殿を達成するために、
水の量を有利に変更することができる。たとえば水の添
加量が少ないほど、一般にB2成分よりB1成分の選択的沈
殿が促進されるであろう。
出物から選択的に沈殿させるのに有効な任意量の水を使
用しうる。一般に目的生成物を沈殿させるために添加す
る水の量は抽出物の最初の水分および目的アベルメクチ
ンの濃度に依存する。水を添加したのちの混合物の望ま
しい水濃度は、最終混合物の約45−約75重量％である。
好ましくは水の添加により約50−約65重量％の水濃度と
なる。好ましい水の量は添加される酸、塩基、塩類また
は界面活性剤の種類および量に従って異なる可能性があ
る。たとえば前記の添加物を使用しない場合は一般に、
より多量の水を使用することが好ましい。さらに特定の
天然Ｂアベルメクチンの選択的沈殿を達成するために、
水の量を有利に変更することができる。たとえば水の添
加量が少ないほど、一般にB2成分よりB1成分の選択的沈
殿が促進されるであろう。
一般に天然Ｂアベルメクチンを水混和性溶剤によるブ
ロス抽出物から選択的に沈殿させるのに有効な任意量の
沈殿促進剤を、水と共に使用しうる。一般に最終混合物
の約０−約８重量％の塩類が使用され、好ましくは最終
混合物の約３−約５重量％の塩類が使用される。一般に
最終混合物の約０−約２重量％の界面活性剤が使用さ
れ、好ましくは最終混合物の約0.1−約１重量％の界面
活性剤が使用される。一般に約２−約７のpHを付与する
のに十分な量の酸が使用され、好ましくは約2.5−約４
のpHを付与するのに十分な量の酸が使用される。一般に
約８−約11のpHを付与するのに十分な量の塩基が使用さ
れ、好ましくは約8.5−約10のpHを付与するのに十分な
量の塩基が使用される。
ロス抽出物から選択的に沈殿させるのに有効な任意量の
沈殿促進剤を、水と共に使用しうる。一般に最終混合物
の約０−約８重量％の塩類が使用され、好ましくは最終
混合物の約３−約５重量％の塩類が使用される。一般に
最終混合物の約０−約２重量％の界面活性剤が使用さ
れ、好ましくは最終混合物の約0.1−約１重量％の界面
活性剤が使用される。一般に約２−約７のpHを付与する
のに十分な量の酸が使用され、好ましくは約2.5−約４
のpHを付与するのに十分な量の酸が使用される。一般に
約８−約11のpHを付与するのに十分な量の塩基が使用さ
れ、好ましくは約8.5−約10のpHを付与するのに十分な
量の塩基が使用される。
一般に本発明方法は、天然アベルメクチンを発酵ブロ
スから水混和性溶剤により抽出し、そして天然Ｂアベル
メクチンを沈殿させるのに十分な水（および希望する任
意の沈殿促進剤）を添加することにより実施される。好
ましくは発酵ブロスバイオマスを、たとえば遠心分離、
濾過または限外濾過によりその最初の濃度の約４−12倍
に濃縮し、得られた湿潤固体に適量の水混和性溶剤を添
加する。得られたスラリーを目的アベルメクチンの溶解
を保証するのに十分な強度でそれに十分な時間（一般に
約１−約８時間）混合する。残留する懸濁固体（バイオ
マス、発酵副生物、脂質、リポ蛋白質など）遠心分離、
濾過または限外濾過により除去する。一般にこれらの処
理工程は周囲温度で実施されるが、目的生成物の収率に
有意に有害な影響を及ぼさない任意の温度（たとえば約
15−約40℃）を採用しうる。
スから水混和性溶剤により抽出し、そして天然Ｂアベル
メクチンを沈殿させるのに十分な水（および希望する任
意の沈殿促進剤）を添加することにより実施される。好
ましくは発酵ブロスバイオマスを、たとえば遠心分離、
濾過または限外濾過によりその最初の濃度の約４−12倍
に濃縮し、得られた湿潤固体に適量の水混和性溶剤を添
加する。得られたスラリーを目的アベルメクチンの溶解
を保証するのに十分な強度でそれに十分な時間（一般に
約１−約８時間）混合する。残留する懸濁固体（バイオ
マス、発酵副生物、脂質、リポ蛋白質など）遠心分離、
濾過または限外濾過により除去する。一般にこれらの処
理工程は周囲温度で実施されるが、目的生成物の収率に
有意に有害な影響を及ぼさない任意の温度（たとえば約
15−約40℃）を採用しうる。
目的量の水および希望する任意の沈殿促進剤を、得ら
れた水混和性溶剤による発酵ブロス抽出物に添加する。
この添加は一般に撹拌しながらバッチ添加することによ
り実施される。この溶液を、目的とする天然Ｂアベルメ
クチン沈殿を達成するのに十分な時間（たとえば12−48
時間）撹拌する。この沈殿も周囲温度で実施するのが好
都合であるが、目的生成物の収率に有意に有害な影響を
及ぼさない任意の温度（たとえば約15−約40℃）を採用
しうる。
れた水混和性溶剤による発酵ブロス抽出物に添加する。
この添加は一般に撹拌しながらバッチ添加することによ
り実施される。この溶液を、目的とする天然Ｂアベルメ
クチン沈殿を達成するのに十分な時間（たとえば12−48
時間）撹拌する。この沈殿も周囲温度で実施するのが好
都合であるが、目的生成物の収率に有意に有害な影響を
及ぼさない任意の温度（たとえば約15−約40℃）を採用
しうる。
得られた沈殿をたとえば濾過により採取し、さらに精
製する。これ以上の精製は当業者に知られている任意の
手段（たとえばクロマトグラフィー法または溶剤系再結
晶が含まれる、たとえば米国特許第5,077,398号明細書
に記載）で行うことができるが、水および最初の抽出に
使用した水混和性溶剤を用いる再結晶を採用することが
好ましい。たとえば沈殿を水混和性溶剤に溶解し、目的
生成物を選択的に結晶化させるのに十分な水ならびに所
望により塩類および／または界面活性剤を添加すること
によって目的生成物をより高純度で回収する。この処理
を目的純度の生成物が得られるまで反復することができ
る。この方法の利点は、回収および精製の全工程のため
に単一溶剤を使用することであり、これは溶剤の再利用
を簡単にし、これに付随して経済および環境上の利益が
得られる。
製する。これ以上の精製は当業者に知られている任意の
手段（たとえばクロマトグラフィー法または溶剤系再結
晶が含まれる、たとえば米国特許第5,077,398号明細書
に記載）で行うことができるが、水および最初の抽出に
使用した水混和性溶剤を用いる再結晶を採用することが
好ましい。たとえば沈殿を水混和性溶剤に溶解し、目的
生成物を選択的に結晶化させるのに十分な水ならびに所
望により塩類および／または界面活性剤を添加すること
によって目的生成物をより高純度で回収する。この処理
を目的純度の生成物が得られるまで反復することができ
る。この方法の利点は、回収および精製の全工程のため
に単一溶剤を使用することであり、これは溶剤の再利用
を簡単にし、これに付随して経済および環境上の利益が
得られる。
本発明方法は天然Ｂアベルメクチン全体を選択的に沈
殿させるために利用することができ、または副分類Ｂの
天然アベルメクチン、たとえば天然B1アベルメクチン
（すなわちB1a、B1b）を順次選択的に沈殿させ、次いで
残存する天然B2アベルメクチンを沈殿させるために利用
することができる。
殿させるために利用することができ、または副分類Ｂの
天然アベルメクチン、たとえば天然B1アベルメクチン
（すなわちB1a、B1b）を順次選択的に沈殿させ、次いで
残存する天然B2アベルメクチンを沈殿させるために利用
することができる。
“天然”アベルメクチンを回収するための上記方法を
他の種飯のアベルメクチンの回収に容易に利用しうるこ
とは当業者には自明であろう。英国特許第1573955号明
細書に記載される“天然”のもの以外のアベルメクチン
には、たとえば米国特許第5,089,480号明細書に記載の
ものが含まれる。たとえばＣ−25位にシクロヘキシルま
たはシクロペンチル置換基を有するアベルメクチンを、
それらを含有する発酵ブロスから本発明の適用により回
収することができる。
他の種飯のアベルメクチンの回収に容易に利用しうるこ
とは当業者には自明であろう。英国特許第1573955号明
細書に記載される“天然”のもの以外のアベルメクチン
には、たとえば米国特許第5,089,480号明細書に記載の
ものが含まれる。たとえばＣ−25位にシクロヘキシルま
たはシクロペンチル置換基を有するアベルメクチンを、
それらを含有する発酵ブロスから本発明の適用により回
収することができる。
本発明方法は、トルエンまたは塩素化溶剤などそれら
のセイフティハザードおよび環境問題が認識されている
溶剤の使用を避け、溶剤の再循環または再利用を容易に
する単一の溶剤回収および精製処理が可能なアベルメク
チン回収方法を提供する。また本発明方法は、発酵ブロ
スからのアベルメクチン濃縮とアベルメクチン全般およ
び特により望まれる成分の有意の精製とを、１工程に結
合する。最後に、本発明方法はブロス抽出物の予備濃縮
を必要とせず、その結果、本方法を実施する装置の経費
節約が可能となる。
のセイフティハザードおよび環境問題が認識されている
溶剤の使用を避け、溶剤の再循環または再利用を容易に
する単一の溶剤回収および精製処理が可能なアベルメク
チン回収方法を提供する。また本発明方法は、発酵ブロ
スからのアベルメクチン濃縮とアベルメクチン全般およ
び特により望まれる成分の有意の精製とを、１工程に結
合する。最後に、本発明方法はブロス抽出物の予備濃縮
を必要とせず、その結果、本方法を実施する装置の経費
節約が可能となる。
本発明は本明細書に記載する特定の態様に限定され
ず、後記の請求の範囲により定められるこの新規な概念
の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更およ
び修正をなしうると解すべきである。
ず、後記の請求の範囲により定められるこの新規な概念
の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更およ
び修正をなしうると解すべきである。
実施例１ 発酵 ストレプトミセス・アベルミチリスの突然変異株を発
酵させることによりアベルメクチンを調製した。R69−7
3と表示されるこの菌株は、ブタペスト条約の条件下で
米国20852マリーランドロックビルのアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションに受託番号ATCC 55453
で1993年７月20日に寄託された。この菌株は有利には、
それを派生させた寄託菌株（ATCC 31272）より少量の
Ａ（すなわち５−Ｏ−メチル）型アベルメクチンを産生
する。この特性は、Ａ型アベルメクチンより高い有効性
をもつことが知られているＢ型アベルメクチンの調製を
容易にする。
酵させることによりアベルメクチンを調製した。R69−7
3と表示されるこの菌株は、ブタペスト条約の条件下で
米国20852マリーランドロックビルのアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションに受託番号ATCC 55453
で1993年７月20日に寄託された。この菌株は有利には、
それを派生させた寄託菌株（ATCC 31272）より少量の
Ａ（すなわち５−Ｏ−メチル）型アベルメクチンを産生
する。この特性は、Ａ型アベルメクチンより高い有効性
をもつことが知られているＢ型アベルメクチンの調製を
容易にする。
接種物は、下記の培地500mlを入れたフェルンバッハ
フラスコ（2.8リットル容）内で培養物を増殖させるこ
とにより調製された： g/1 ファルマメディア（Pharmamedia）（綿実ミール） 15 アルダマイン（Ardamine）pH（酵母エキス） ５ デンプン（thinned starch） 20 炭酸カルシウム ２ 培地は水酸化ナトリウムでpH7.2に調製され、フラス
コを使用前に121℃で45分間加圧滅菌することにより殺
菌された。培養物を接種したのち、フラスコを29℃の温
度で72時間、速度200rpmの旋回振盪機上においてインキ
ュベートした。次いで２個のフラスコを、下記の培地10
リットルを入れた生産用発酵槽である14リットルの容器
の接種に使用した： g/1 グリコース１水和物 45 ペプトン化ミルク栄養素 24 アルダミンpH（酵母エキス） 2.5 Ｐ−2000消泡剤 2.5 培地は水酸化ナトリウムでpH7.0に調整され、フラス
コを121℃で75分間加圧滅菌することにより殺菌され
た。冷却後に発酵槽に空気を５標準リットル／分の量で
供給し、速度600rpmで撹拌した。前記フラスコを用いて
接種を行った。接種の５日後にグルコース溶液の連続供
給を開始し、グルコース50g/日を供給した。供給を接種
の13日後まで継続し、この時点で発酵槽を採取のために
収集した。収集時点でのアベルメクチンの濃度はHPLCに
より測定して下記のとおりであった： B1a−413、B1b−333、B2a−471、B2b−186mg/1 採取 発酵ブロス（７リットル）を遠心分離して、アベルメ
クチンを含有するバイオマスを濃縮した。合計1163g
（湿潤重量）の濃縮ブロス固体が得られた。581gの湿潤
固体に1200mlのメタノールを添加した。アベルメクチン
を溶解するために十分に混合したのち、この水性メタノ
ールスラリーを濾過して懸濁固体を除去した。得られた
メタノール抽出物は39重量％の水を含有し（カール・フ
ィッシャー滴定による）、下記の濃度のアベルメクチン
を含有していた： B1a−1146、B1b−822、B2a−1307、B2b−379mg/1 濾過した抽出物の不揮発性固体含量は17.1g/1であっ
た。不揮発性固体全体に対するB1aの比率（B1aの純度）
は6.7％であった。
フラスコ（2.8リットル容）内で培養物を増殖させるこ
とにより調製された： g/1 ファルマメディア（Pharmamedia）（綿実ミール） 15 アルダマイン（Ardamine）pH（酵母エキス） ５ デンプン（thinned starch） 20 炭酸カルシウム ２ 培地は水酸化ナトリウムでpH7.2に調製され、フラス
コを使用前に121℃で45分間加圧滅菌することにより殺
菌された。培養物を接種したのち、フラスコを29℃の温
度で72時間、速度200rpmの旋回振盪機上においてインキ
ュベートした。次いで２個のフラスコを、下記の培地10
リットルを入れた生産用発酵槽である14リットルの容器
の接種に使用した： g/1 グリコース１水和物 45 ペプトン化ミルク栄養素 24 アルダミンpH（酵母エキス） 2.5 Ｐ−2000消泡剤 2.5 培地は水酸化ナトリウムでpH7.0に調整され、フラス
コを121℃で75分間加圧滅菌することにより殺菌され
た。冷却後に発酵槽に空気を５標準リットル／分の量で
供給し、速度600rpmで撹拌した。前記フラスコを用いて
接種を行った。接種の５日後にグルコース溶液の連続供
給を開始し、グルコース50g/日を供給した。供給を接種
の13日後まで継続し、この時点で発酵槽を採取のために
収集した。収集時点でのアベルメクチンの濃度はHPLCに
より測定して下記のとおりであった： B1a−413、B1b−333、B2a−471、B2b−186mg/1 採取 発酵ブロス（７リットル）を遠心分離して、アベルメ
クチンを含有するバイオマスを濃縮した。合計1163g
（湿潤重量）の濃縮ブロス固体が得られた。581gの湿潤
固体に1200mlのメタノールを添加した。アベルメクチン
を溶解するために十分に混合したのち、この水性メタノ
ールスラリーを濾過して懸濁固体を除去した。得られた
メタノール抽出物は39重量％の水を含有し（カール・フ
ィッシャー滴定による）、下記の濃度のアベルメクチン
を含有していた： B1a−1146、B1b−822、B2a−1307、B2b−379mg/1 濾過した抽出物の不揮発性固体含量は17.1g/1であっ
た。不揮発性固体全体に対するB1aの比率（B1aの純度）
は6.7％であった。
表１に記載した採取物それぞれにおいて、前記メタノ
ール抽出液100mlを用いた。表１に挙げた添加物を添加
し、溶液を室温（23℃）で24時間撹拌した。生じた沈殿
を、紙上に3gの濾過助剤（すなわち焼成珪藻土）を乗せ
たフィルターに懸濁液を導通することにより採集した。
濾過の前および後に沈殿を観察することにより沈殿の性
質を調べ、結果を表１に挙げる。フィルターケークを、
濾過された懸濁液のものとほぼ同じ水分の水性メタノー
ル10mlで洗浄したのち、ケークをメタノールに懸濁して
アベルメクチン沈殿を再溶解した。得られた溶液をHPLC
によりアッセイして、それらのアベルメクチン含量を判
定した。溶液は試料を乾燥させて不揮発性物質の全含量
を測定した。表１中のB1a純度は、溶液の不揮発性固体
全含量に対する沈殿溶液のB1a含量の比率として計算さ
れた。
ール抽出液100mlを用いた。表１に挙げた添加物を添加
し、溶液を室温（23℃）で24時間撹拌した。生じた沈殿
を、紙上に3gの濾過助剤（すなわち焼成珪藻土）を乗せ
たフィルターに懸濁液を導通することにより採集した。
濾過の前および後に沈殿を観察することにより沈殿の性
質を調べ、結果を表１に挙げる。フィルターケークを、
濾過された懸濁液のものとほぼ同じ水分の水性メタノー
ル10mlで洗浄したのち、ケークをメタノールに懸濁して
アベルメクチン沈殿を再溶解した。得られた溶液をHPLC
によりアッセイして、それらのアベルメクチン含量を判
定した。溶液は試料を乾燥させて不揮発性物質の全含量
を測定した。表１中のB1a純度は、溶液の不揮発性固体
全含量に対する沈殿溶液のB1a含量の比率として計算さ
れた。
メタノール溶液から水の添加によりアベルメクチンを
水性再結晶し、目的の純度が得られるまでこの処理を反
復することによって、さらに精製を行った。たとえばこ
の場合、４％のNaCl、0.2％のNaLSおよび60％の水を沈
殿に使用し、２回の再結晶後に得られた生成物はアベル
メクチン95重量％であった（約75％のB1aおよび20％のB
1b）。
水性再結晶し、目的の純度が得られるまでこの処理を反
復することによって、さらに精製を行った。たとえばこ
の場合、４％のNaCl、0.2％のNaLSおよび60％の水を沈
殿に使用し、２回の再結晶後に得られた生成物はアベル
メクチン95重量％であった（約75％のB1aおよび20％のB
1b）。
実施例２ 実施例１からの濃縮湿潤ブロス固体582gを1200mlのア
セトンと混合してアベルメクチンを溶解した。この水性
アセトンスラリーを濾過して懸濁固体を除去した。得ら
れたアセトン抽出物は41.9％を水を含有し（カール・フ
ィッシャー滴定による）、下記濃度のアベルメクチンを
含有していた： B1a−1393、B1b−999、B2a−1539、B2b−460mg/1 抽出物の不揮発生固体含量は16.9g/1であり、抽出物
のB1a純度（前記により測定）は8.2％であった。
セトンと混合してアベルメクチンを溶解した。この水性
アセトンスラリーを濾過して懸濁固体を除去した。得ら
れたアセトン抽出物は41.9％を水を含有し（カール・フ
ィッシャー滴定による）、下記濃度のアベルメクチンを
含有していた： B1a−1393、B1b−999、B2a−1539、B2b−460mg/1 抽出物の不揮発生固体含量は16.9g/1であり、抽出物
のB1a純度（前記により測定）は8.2％であった。
表２に記載した採取に際して、上記のアセトン抽出液
100mlを使用した。表２に挙げた添加物を添加し、溶液
を室温（23℃）で24時間撹拌した。生じた沈殿を、紙上
に3gの濾過助剤（すなわち焼成珪藻土）を乗せたフィル
ターに懸濁液に導通することにより採集した。フィルタ
ーケークを、濾過された懸濁液のものとほぼ同じ水分の
水性アセトン10mlで洗浄したのち、ケークをメタノール
に懸濁してアベルメクチン沈殿を再溶解した。得られた
溶液を実施例１の表１につき記載したと同様に分析し
た。
100mlを使用した。表２に挙げた添加物を添加し、溶液
を室温（23℃）で24時間撹拌した。生じた沈殿を、紙上
に3gの濾過助剤（すなわち焼成珪藻土）を乗せたフィル
ターに懸濁液に導通することにより採集した。フィルタ
ーケークを、濾過された懸濁液のものとほぼ同じ水分の
水性アセトン10mlで洗浄したのち、ケークをメタノール
に懸濁してアベルメクチン沈殿を再溶解した。得られた
溶液を実施例１の表１につき記載したと同様に分析し
た。
実施例１の場合と同様に、水を添加してメタノールか
らの再結晶を反復することにより、アベルメクチン純度
95％の生成物が得られた。
らの再結晶を反復することにより、アベルメクチン純度
95％の生成物が得られた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (18)
- 【請求項１】天然アベルメクチンを含有する発酵ブロス
から天然Ｂアベルメクチンを分離する方法であって： a.天然アベルメクチンを含有する発酵ブロスからC1−C3
アルコール、アセトンまたはアセトニトリルによりアベ
ルメクチンを抽出して、天然Ｂアベルメクチンを含有す
る抽出物を調製し； b.天然Ｂアベルメクチンを含有する抽出物に、天然Ｂア
ベルメクチンを沈殿させるのに十分な水を添加し；そし
て c.沈殿を採集する ことを含む方法。 - 【請求項２】天然アベルメクチンを含有する発酵ブロス
が天然Ｂアベルメクチンを0.2g/1より高い濃度で含有
し；かつ天然Ｂアベルメクチンを含有する抽出物に酸、
塩基または塩類を添加し、それらの酸、塩基または塩類
がナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウムま
たは水素カチオン、およびクロリド、ホスフェート、ス
ルフェート、ニトレート、バイカーボネート、カーボネ
ートまたはヒドロキシドアニオンを有する、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】水の添加量は、水分が混合物の約45−約75
重量％となるのに十分なものである、請求項２に記載の
方法。 - 【請求項４】酸、塩基または塩類が、塩化ナトリウム、
リン酸カリウム、硫酸、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナ
トリウムまたは水酸化カリウムである、請求項３に記載
の方法。 - 【請求項５】酸、塩基または塩類が、塩化ナトリウムま
たは炭酸水素ナトリウムである、請求項４に記載の方
法。 - 【請求項６】天然アベルメクチンをC1−C3アルコールで
抽出する、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】C1−C3アルコールがメタノールである、請
求項６に記載の方法。 - 【請求項８】水の添加量は、水分が混合物の約55−約65
重量％となるのに十分なものである、請求項７に記載の
方法。 - 【請求項９】さらに、天然Ｂアベルメクチンを含有する
抽出物に、最初の沈殿を分離したのち、天然Ｂアベルメ
クチンを含有する２回目の沈殿を生じさせるのに十分な
水を添加することを含む、請求項２に記載の方法。 - 【請求項１０】天然Ｂアベルメクチンを含有する抽出物
に界面活性剤を添加することを含む、請求項３に記載の
方法。 - 【請求項１１】酸、塩基または塩類が、塩化ナトリウ
ム、リン酸カリウム、硫酸、炭酸水素ナトリウム、水酸
化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、請求項10に
記載の方法。 - 【請求項１２】酸、塩基または塩類が、塩化ナトリウム
または炭酸水素ナトリウムである、請求項11に記載の方
法。 - 【請求項１３】天然アベルメクチンをC1−C3アルコール
で抽出する、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１４】C1−C3アルコールがメタノールである、
請求項13に記載の方法。 - 【請求項１５】水の添加量は、水分が混合物の約55−約
65重量％となるのに十分なものである、請求項14に記載
の方法。 - 【請求項１６】界面活性剤がラウリル硫酸ナトリウムで
ある、請求項15に記載の方法。 - 【請求項１７】さらに、天然Ｂアベルメクチンを含有す
る抽出物に、最初の沈殿を分離したのち、天然Ｂアベル
メクチンを含有する２回目の沈殿を生じさせるのに十分
な水を添加することを含む、請求項16に記載の方法。 - 【請求項１８】ストレプトミセス・アベルミチリスATCC
55453の生物学的に純粋な培養物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9674593A | 1993-07-23 | 1993-07-23 | |
| US08/096,745 | 1993-07-23 | ||
| US96,745 | 1993-07-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08506966A JPH08506966A (ja) | 1996-07-30 |
| JP2828343B2 true JP2828343B2 (ja) | 1998-11-25 |
Family
ID=22258886
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6520399A Expired - Fee Related JP2828343B2 (ja) | 1993-07-23 | 1994-04-26 | 天然アベルメクチンの沈殿方法 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5686274A (ja) |
| EP (1) | EP0710290B1 (ja) |
| JP (1) | JP2828343B2 (ja) |
| AT (1) | ATE175240T1 (ja) |
| AU (1) | AU674743B2 (ja) |
| BR (1) | BR9407141A (ja) |
| CA (1) | CA2167186C (ja) |
| CO (1) | CO4230201A1 (ja) |
| DE (1) | DE69415675T2 (ja) |
| DK (1) | DK0710290T3 (ja) |
| ES (1) | ES2125446T3 (ja) |
| FI (2) | FI112092B (ja) |
| GR (1) | GR3029285T3 (ja) |
| NZ (1) | NZ263615A (ja) |
| WO (1) | WO1995003419A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA945415B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO1998056939A1 (fr) * | 1997-06-09 | 1998-12-17 | Vladimir Alexandrovich Mosin | Souche de streptomyces avermitilis, procede de separation de complexes d'avermectine et preparations destinees a la protection d'animaux et de vegetaux |
| KR100419554B1 (ko) * | 1999-10-29 | 2004-02-19 | 주식회사유한양행 | 아버멕틴의 정제방법 |
| US6872708B2 (en) * | 2001-09-10 | 2005-03-29 | Mitsukazu Matsumoto | Local injection prescription |
| JP4373080B2 (ja) * | 2002-12-24 | 2009-11-25 | 三井化学アグロ株式会社 | ミルベマイシン類の精製法 |
| CN101084300B (zh) * | 2004-12-23 | 2010-09-22 | Jp实验室有限公司 | 制备洗涤剂的方法 |
| CN103333214B (zh) * | 2013-07-03 | 2015-08-12 | 大庆志飞生物化工有限公司 | 一种阿维菌素B2a精粉的制备方法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI56187C (fi) * | 1970-07-02 | 1979-12-10 | Takeda Chemical Industries Ltd | Foerfarande foer framstaellning av antibiotiskt aktiva estrar av makrolidglykosiderna b-5050 eller tetrahydro b-5050 |
| US4017516A (en) * | 1972-11-15 | 1977-04-12 | Schering Corporation | Novel monoesters of rosamicin |
| SE434277B (sv) * | 1976-04-19 | 1984-07-16 | Merck & Co Inc | Sett att framstella nya antihelmintiskt verkande foreningar genom odling av streptomyces avermitilis |
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| US4703009A (en) * | 1983-03-08 | 1987-10-27 | Merck & Co., Inc. | RDNA cloning vector pVE1, deletion and hybrid mutants and recombinant derivatives thereof products and processes |
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| US5077348A (en) * | 1986-10-31 | 1991-12-31 | Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd. | Aqueous coating composition, process for the production thereof and aqueous coating |
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| JP2888586B2 (ja) * | 1990-03-05 | 1999-05-10 | 社団法人北里研究所 | エバーメクチンの特定成分を選択生産するための微生物およびその選択的製造法 |
-
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