JPH05504469A

JPH05504469A - Ａ８３５４３回収方法

Info

Publication number: JPH05504469A
Application number: JP51566990A
Authority: JP
Inventors: ベイカー，パトリック　ジェイムズ
Original assignee: ダウエランコ
Priority date: 1989-10-30
Filing date: 1990-10-26
Publication date: 1993-07-15
Also published as: EP0454820A1; EP0454820A4; WO1991006552A1; AU6641490A; AU631693B2; BR9006982A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ａ３３５４３回収方法見所Ω塁！本発明は、発酵生成物Ａ３３５４３を回収するための改良方法に関する。Ａ３３５４３は成分Ａ３３５４３Ａ、　Ａ３３５４３Ｂ、　Ａ３３５４３Ｃ，Ａ３３５４３Ｄ。

Ａ３３５４３Ｅ、　Ａ３３５４３Ｆ、　Ａ３３５４３Ｇ、　Ａ３３５４３Ｈ１及びＡ３３５４３Ｊからなり、シ三（ト）コｌ江■匹■且力庶屁とし匹の菌株により製造される有効な殺虫剤である。

本発明の改良方法は、（１）ブロスにほぼ等体積の水溶性溶剤、例えばアセトン又はアセトニトリルを加えること；（２）バイオマスから液相を分離すること；（３）約１０〜約１１のｐＨにおいて不混和性溶剤、例えば酢酸エチル又はジクロロメタンにより液相を抽出すること；（４）水相から有機相を分離し、そして有機相を濃縮し残っている水混和性溶剤を除去すること；（５）有機相からデカンタすることによりかなり着色した不混和性水相を除去すること；（６）酒石酸のような酸の希釈溶液により有機相を逆抽出すること；（７）（ｉ）（ａ）例えば真空により水性酸検相より有機溶剤の混和性部分を除去し、（ｂ）逆浸透を用いて水相を約２０倍に濃縮し、そして（ｃ）水酸化ナトリウムのような塩基を十分量加えＡ３３５４３を沈殿させ、濾過によりＡ３３５４３を分離すること又は輸りアセトン又はメタノールを２０％以下含む、水酸化ナトリウムのような塩基を十分量加えＡ３３５４３を沈殿させること；及び（８）濾過によりＡ３３５４３を分離することを含む。

この方法の利点は、より良い形状でＡ３３５４３を高収率で速く回収できることである。

又ユ皇圧豊星脱■ 本発明は、ｒ　Ａ３３５４３　Ｊと命名された発酵生成物を回収するための改良方法に関する。Ａ３３５４３は成分＾８３５４３Ａ、　Ａ３３５４３Ｂ。

Ａ３３５４３Ｃ，Ａ３３５４３Ｄ、　Ａ３３５４３Ｅ、　Ａ３３５４３Ｆ、　Ａ３３５４３Ｇ、　Ａ３３５４３Ｈ及びＡ３３５４３Ｊからなり、式１に示す構造を有する。

式中Ｒは以下のものである。

（為）（ｂ）（Ｃ）（ｄ）成分　ＲＲ’　Ｒ’　Ｒ’　Ｒ５Ｒ’ Ａ　（ａ）　Ｍｅ　ＨＥｔ　Ｍｅ　ＭｅＢ　（ｂ）　Ｍｅ　ＨＥｔ　Ｍｅ　ＭｅＣ（ｃ）　Ｍｅ　ＨＥｔ　Ｍｅ　Ｍｅｌ）　（ａ）　Ｍｅ　Ｍｅ　Ｅｔ　Ｍｅ　ＭｅＥ　（ａ）　Ｍｅ　ＨＭｅ　Ｍｅ　ＭｅＦ　（ａ）　ＨＨＥｔ　Ｍｅ　ＭｅＧ　（ｄ）　Ｍｅ　ＨＥｔ　Ｍｅ　ＭｅＨ（ａ）　Ｍｅ　ＨＥｔ　ＨＭｅＪ　（ａ）　Ｍｅ　ＨＥｔ　Ｍｅ　ＨＡ８３５４３Ａ中のアミノ垢はβ−Ｄ−ホロスアミンであることが示され、Ａ３３５４３Ａ中の天然糖はａ−２，３，４−１リ−〇−メチルラムノースである。

Ａ３３５４３及び個々のへ８３５４３成分は昆虫、特に鱗翅目種、例えば５ｏｕｔｈｅｒｎ　ａｒｍｗｏｒｍ、双翅目種、例えばクロハエ（ｂｌｏｗ　ｆｌｙ）、サシバエ（ｓｔａｂｌｅ　ｆｌｙ）及び蚊、並びに同翅類種、例えばアリマキ及びヨコバイの抑制に有効である。

Ａ３３５４３は、Ｂｏｅｃｋ、　Ｃｂｉｏ、　Ｅａｔｏｎ、　Ｇｏｄｆｒｅｙ、　Ｍｉｃｈｅｌ。

Ｎａｋａ　ｔｓｕｋａｓａ及びＹａｏらの同時係属米国特許出願、１９８９年１０月３０日出願に０７１．４２９．４４１に開示された方法により回収可能な量のＡ３３５４３が産出されるまで好適な培地内で液内好気性条件下５ａｃｃｈａｒｏ　ｏｌ　ｓ　ｏｒａ　且頂遼胆チシｎｏｖ、のＡ３３５４３産生株を培養することにより調製される。

４つのへ８３５４３産生５ａｃｃｈａｒｏ　ｏｌ　ｓ　ｏｒａ　胚力巴組カルチャー、ＮＲＲＬ１８３９５．　ＮＲＲＬ１８５３７．　ＮＲＲＬ１８５３８又はＮＲＲＬ１８５３９を寄託し、Ｍｉｄｗｅｓｔ　Ａｒｅａ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ。

Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃｅ、　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　１８１５　Ｎｏｒｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｔｒｅｅｔ、　Ｐｅｏｒｉａ。

１１１ｉｎｏｉｓ、　６１６０４のストックカルチャーコレクションの一部とした。これより特定のＮＩ？ＲＬ受諾番号のもとに一般に入手可能である。

ｎ５り：ｌ江■匣Ｕ肛道型組カルチャーの生育に用いられる培地は多くの培地のいずれかであってよい。

大スケール発酵における好ましい炭素源はゲルコール及びマルトースであるが、リボース、キシロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、マンニトール、可溶性スターチ、ポテトデキストリン、オレイン酸メチル、油、例えば大豆油等も用いてよい。

好ましい窒素源は綿実粉、ペプトン化ミルク及び消化大豆ミールであるが、魚ミール、コーン浸漬液、イースト抽出物、酵素加水分解カゼイン、ビーフ抽出物、等も用いてよい。

培地に混入してよい栄養素無機塩は、亜鉛、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、塩化物、カーボネート、スルフェート、ニトレート等のイオンを与えることのできる通例の可溶性塩である。

生物の成長に必要な必須微少元素も培地に含まれるべきである。そのような微少元素は通常生物の成長の必要にみあう十分な量、培地中に不純物として存在する。

通常、発泡が問題である場合、大スケール発酵培地にポリプロピレングリコールのような消泡剤を少量（すなわち０．２胃Ｌ／Ｌ）加えてよい。しかし、Ａ３３５４３産生カルチヤーの場合、従来の脱泡剤はＡ３３５４３の形成を妨げる。発泡は培地に大豆油又はプルロニックＬ　−Ｌｏｔ（ＢＡＳＦ）を含むことにより抑制される。添加油は発泡がおこった際に加えてよい。

Ａ３３５４３中の成分の比は用いられる発酵条件によって異なる。

通常、Ａ３３５４３は約８５〜９０％Ａ３３５４３Ａ、約１０〜１５％Ａ３３５４３Ｄ、及び少量のＡ３３５４３Ｂ、　Ｃ，Ｄ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｇ、　Ｈ及びＪを含む。

特定のＡ３３５４３成分の割合は培地の変化により異なる。例えば、バリン又はイソブチル酸もしくはプロピオン酸の添加は形成されるＡ３３５４３Ｄの割合を高める。

多量のＡ３３５４３を調製するため、撹拌バイオリアクター中浸漬した好気性発酵が好ましい。少量のＡ３３５４３は振盪フラスコカルチャーにより得られる。

胞子形状の生物による大きなバイオリアクターの接種に伴なう調製のタイムラグのため増殖性接種物を用いることが好ましい。増殖性接種物は、少量の培地に生物の胞子形状又は菌糸フラグメントを接種し、生物の新鮮な、活性成長カルチャーを得ることにより調製される。

次いで増殖性接種物は大きなバイオリアクターに移される。

増殖性接種物培地は大発酵に用いたものと同しであってよいが、他の培地も好適である。

Ａ３３５４３はＡ３３５４３産生生物により、約２４°Ｃ〜約３３°Ｃで成育させた際に得られる。Ａ３３５４３調製の至適温度は約２８〜３０°Ｃであると考えられる。

浸漬した好気性培養法において通例であるように、培地を従来のタービンインペラーで撹拌しながら底から容器へ滅菌した空気を吹き込む。通常、通気速度及び撹拌速度は、０．３４大気圧の内部容器圧で空気飽和の３５％以上、好ましくは５０％以上に溶解した酸素のレベルを保つに十分であるべきである。

Ａ３３５４３成分の調製は、ブロスのテスト抽出物による発酵後に行なわれる０例１に記載したようなシステムを用いるＨＰＬＣはこの目的に対し有効なアッセイ法である。

本発明はＡ３３５４３が形成される発酵培地からＡ３３５４３を回収するための改良方法に関する。Ａ８３５４３産生生物の発酵の間形成されるＡ３３５４３は菌糸体（バイオマス）及びブロスの両者に生ずる。Ａ３３５４３は親油性であると考えられる。さらに、従来の消泡剤はＡ３３５４３形成を阻害する。Ａ３３５４３をバイオリアクター内で調製する場合、発泡は問題であり、それを抑制するため多量の油が用いなければならない。その後の培地からの親油性Ａ３３５４３の分離は同時に油の分離を含んでいた。従って、Ａ３３５４３の完全な回収はさらなる油の分離除去が必要であった。

従って、本発明以前は、Ａ３３５４３は（１）ブロス全体を濾過しバイオマスを分離すること；（２）メタノールでバイオマスを抽出すること；（３）メタノール抽出液を１縮すること；（４）このＶａ縮液を）ＩＰ２０のような非官能性樹脂に加えること；（５）水／メタノール溶液により樹脂から不純物を洗浄すること；（６）非官能性樹脂より生成物を溶離すること；（７）溶出液を濃縮し粗油として生成物を与えること；（８）ＬＨ−２０のようなイオン性セファデックスの多くのカラムを通し生成物を精製し油を除去すること；（９）溶出溶削を濃縮し生成物を与えること；そして（１０）生成物を結晶化することにより単離された。

不幸にもこの回収法は約３週間の時間がかかり、多くの精製を必要とするため損失が大きくなる。ＬＨ−２０のようなイオン性セフアゾ、クスはローディング容量が低（、従って工程８を行なうためには多くのカラムが必要であり、損失が大きくなる。

本発明は、Ａ３３５４３及び油をエチルアセテートのような不混和性溶剤で抽出し、次いで酒石酸のような酸の希釈溶液を用いてＡ３３５４３を水相に逆抽出することにより厄介な油を除去できた発見に関する。酸性？８液を４縮し有機溶剤の混和性部分を除去した後、約１０〜１１のｐＨまで水酸化ナトリウムのような塩基を加えることによりＡ３３５４３を塩基として沈殿させる。この方法は工程８で必要な多くのカラムを用いず精製したＡ３３５４３の回収を可能にする。

さらに、本発明の他の態様は、この方法が濾過しないブロス全体について用い、それにより工程２〜７にみられるような生成物の損失を避けることができる発見である。

従って、本発明の改良方法は、（１）ブロス全体にほぼ等量の水混和性溶剤を加えること；（２）バイオマスから液相を分離すること；（３）約１０〜約１１のｐＨにおいて不混和性溶剤により液相を抽出すること；（４）水相から有機相を分離し、そして有機相を濃縮し残っている水混和性溶剤を除去すること；（５）有機相からかなり着色した不混和性水相を除去すること；（６）酸の希釈溶液により有機相を逆抽出すること；（７）（ｉ）（ａ）水性酸検相より有機溶剤の混和性部分を除去し、（ｂ）逆浸透を用いて水相を濃縮し、そして（ｃ）塩基を十分量加えＡ３３５４３を沈殿させること又は（ｉ）アセトン又はメタノールを２０％以下含む塩基を十分量加えＡ３３５４３を沈殿させること；そして（８）濾過によりＡ３３５４３を分離することを含む。

工程２は好ましくは濾過助剤を用い濾過により達成される。

工程３用の好ましい溶削はエチルアセテート又はジクロロメタンである。

工程５において、水相はデカントすることにより最も艮（分離される。工程６用の好ましい助剤は酒石酸である。工程７（１）において、分ｊｉＩ（ａ）は真空下において最も容易に達成される。工程７（ｉ）（ｃ）又は７（ｉｉ）用の好ましい塩基は水酸化ナトリウムである。

この方法はかなり短時間、例えば約３日で完了し、一方従来の方法は約３週間かかるので、この方法はより実用的である。さらに、この方法は高収率のＡ３３５４３を与え、生成物の沈殿が容易であり、高純度の生成物を与える。

こうして回収されたＡ３３５４３はクロマトグラフにより個々の成分Ａ３３５４３Ａ、　Ａ３３５４３Ｂ、　Ａ３３５４３Ｃ，Ａ３３５４３Ｄ、　Ａ３３５４３Ｅ、　Ａ３３５４３Ｆ。

Ａ３３５４３Ｇ、　Ａ３３５４３Ｈ１及びＡ３３５４３Ｊに分離される。

好ましい分離法は逆相シリカゲル（Ｃ，、又はＣｓ）クロマトグラフィーを含む。

本発明をより詳細に説明するため以下に実施例を示す。

以下のＨＰＬＣ法は、Ａ３３５４３の調製のための発酵をモニターするため有効である。

ブロス全体のサンプルを遠心し、上澄をデカントしそして分離する。バイオマスに十分なメタノールを加え、サンプルを最初の体積にもどし、混合し、混合物を最小１５分間放置する。遠心し上澄を０．４５ｍフィルターを通し濾過する。

この他に、ブロス全体をアセトニトリル（１：４　ブロス：溶剤）又はアセトンで抽出してもよい。

ＨＰＬＣシステムカラム担体：　８　Ｘ　１００ｍカラム、シリカゲル４−球状ＣＩＩ（Ｎｏｖａ　Ｃ＋＋＋　、　Ｗａｔｅｒｓ）移動相　：０．０５％酢酸アンモニウムを含むＣＨｓＣＮ／　ＭｅＯＨ／　ＨｚＯ流　速：４ｍＬ／ｓｉｎ検　出＝２５ｏｎＩｌのＵＶ保持時間：　Ａ３３５４３Ａ−３，６〜３．７分Ａ３３５４３Ｄ　−４，４〜４．５分液体窒素中に保った懸濁液又は凍結乾燥したベレットのいスレカッカルチャー錘匹畑二ｌ状註註匣肚おユ組ＮＲＲＬ１８３９５を用い組成Ａ又はＢを有する植物培地に接種する（培地Ｂが大スケール製造には好ましい）。

埴土団し１八一基一一二別−−にじＪトリブチケース（Ｔｒｙｐ　ｔ　１ｃａｓｅ）大豆ブロス゛　３．０イースト抽出物　０．３ＭｇＳＯ４・７Ｈ，ＯＯ，２脱イオン水　１１に十分量ｐＨ調節せず ”　Ｂａ１ｔｉｓ＋ｏｒｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ亘嵜暗廼旦一底−−立一　−１」笈Ｙ− 酵素加水分解したカゼイン゛　３．０イースト抽出物　０．３Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，ＯＯ，２グルコース　１・０脱イオン水　１２に十分量ｐＨ６，２、ＮａＯＨで６．５に調節 ′″ＮＺ　Ａｍ１ｎｅ　Ａ、　５ｈｅｆｆｉｅｌｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｐ、０．Ｂｏｘ　６３８　Ｎｏｒｗｉｃｈ。

ＮＹ　１３８１５植物種培地Ａ又はＢｉ、：２．５％アガーを加えることによりスラント又はプレートが製造される。接種したスラントを３０゛Ｃで約１０〜１４日闇インキユヘヒトする。成長したスラントカルチャーを滅菌機具で取り、菌糸体を浸す。こうして得た胞糸約１１５０及びカルチャーグロスを用い第１段階植物種培地５０ｄに接種する。又は第１段階培地に液体窒素アンプルから接種してもよい。

カルチャーを液体窒素中に保つ場合、等量の植物カルチャー（４８〜７２時間インキュベーション、３０°Ｃ）及び懸濁媒体を用いてアンプルが製造される。懸濁媒体はラクトース（１００ｇ）、グリセロール（２００ｍ）及び脱イオン水（ＩＩ！、まで）を含む。

液体窒素アンプルは５００ａｆの三角フラスコ中に１００ｄの植物培地（又は２５０ｍフラスコ中に５０ｄ培地）を接種するため用いられる。カルチャーは２５０ｒｐ＋＊で２インチ（５，０８Ｃ１１）楕円をえかくシェーカー上で３０°Ｃで４８時間インキュベートされる。

インキュベートされたカルチャー（５％Ｖ　／　Ｖ　）は以下の組成を有する製造培地１００ｊＩｌｌ！に接種される。

植物蛋白、一部酵素的に加水分解°１．５〜３綿子粉”　１．０ＣａＣＯｓ（試薬又は工業グレード）０．３大豆油　１．０生水　１２に十分量ＮａＯＨでｐＨ７，０に調節 ”　５ｈｅｆｔｏｎｅ　Ｈ，５ｈｅｆｆｉｅｌｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”Ｐｒｏｆｌｏ、Ｔｒａｄｅｒｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　８４０７．　Ｍｅｓ＋ｐｈｉｓ、Ｔ！１接種した製造培地を２５Ｏｒｐｍで２インチ楕円形をえかくシェーカー上で２８〜３０″Ｃで６〜８日間５００　ｍの三角フラスコ内でインキュベートする。

且、腹　バイオリアクター多量の接種菌を与えるため、Ａに記載したようにして製造した１０１１のインキュベートした第１段階培地を用い、第１段階植物培地と同し組成を有する第２段階植物培地４００−に接種した。この第２段階培地を２５０ｒｐ−で２インチ楕円形をえが（シェーカー上で３０°Ｃで約４８時間２１！、の広口三角フラスコ内でインキュベートする。

こうして製造したインキュベートした第２段階植物培地（２ｆ２）を用い、Ａに記載のようにして製造した８０〜１１５尼の滅菌製造培地に接種する。必要により発泡を抑えるため追加大豆油を加える。

接種した製造培地を１６５２の撹拌バイオリアクター内で２８゛Ｃの温度で５〜８日間発酵させる。撹拌容器内の撹拌速度及び通風は、空気飽和の５０％以上のレヘルに溶解酸素レヘルを保つためコンピューター制御されている。

斑−ユＡ３３５４３Ａ　びＤの　の　１　法１、）２００ｄの製造培地を１２フラスコ内で用い、２）製造培地から大豆油を省く、そして３）３０°Ｃで４〜６日間インキュベートすることを除き、例２のＡに記載したようにして発酵ブロス（１０β）を製造した。ブロスは濾過した。

４　ｍｃｇのＡ３３５４３Ａ／ｄを含み、そして検出可能な量（７）Ａ３３４３Ｂ、　Ｃ，Ｄ。

又はＤ／ｄを含まない濾液を捨てた。

バイオマスを水洗し、メタノールで１時間抽出した。抽出！　（７ｊ２）は７２ｍｃｇのＡ３３５４３Ａ／ｉｄ及び７　ｍｃｇのＡ３３５４３Ａ／紙を含んでいた。

メタノール抽出液を５１に４縮し、そして水（２１）中の）ＩＰ−２０樹脂（１５０ｄ　、門１ｔｓｕｂｉｓｈｉ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　Ｌｔｄ、、）に加えた。この混合物を１時間撹拌した。

次いでｌ（Ｐ　−２０混合物をガラスカラムに入れた。最初の流出液及びメタノール：水（１：１．１１）を用いる溶出液は活性ではなかった。メタノール：水（７：３．１２）を用いる第２の溶出液はＡ３３５４３Ａを少量含んでいた。メタノール（１１）を用いるその後の溶出液はＡ３３５４３Ａ及びＡ３３５４３Ｄを含んでいた。

メタノール溶出液をｍ′ＩｔＭシ、他からの２つの同様の両分と合わせ、そして濃縮乾固した。残留物を７５ｄのメタノール：ＴＨＦ　（４：　１）に溶解し、１０体積のアセトニトリルへの添加によって沈殿させた。この混合物を濾過し、濾液を濃縮乾固した。

残留物をメタノール（２５ｄ）に溶解し、メタノール中で製造した５、　５　Ｘ９０ＣＩのＬＨ−２０セフアデツクスのカラムに入れ、例１に記載のＨＰＬＣ法により　１２５個の２５ＷＩｌｉ！ｉ分を分析した。

所望の化合物を含む百分をあわせ濃縮した。残留物をメタノール（１０ｄ）に溶解し、８ａ＋Ｃ−１８逆相シリカゲル（ＲａｉｎｉｎＤｙｎａｍａｘ）を充填した４１．１１１１１Ｘ２５Ｃ１１のカラムに入れた。

カラムをメタノール：アセトニトリル：　水（３７，５：　３７．５　：２５）中で状態調節した。サンプル添加後、以下の溶剤の１８０分直線勾配を用いてカラムを展開した。

溶剤系量（ｄ）溶　荊　Ａ　ＢＣＨｆｆＯ）１　３７．５　４５ＣＨ，ＣＮ　３７．５　４５１（，０２５１０勾配は１００％から１００％Ｂまで行ない、２５Ｍ１画分を集めた。

Ａ３３５４３Ａを含む両分を貯め、濃縮乾燥し、ｔ　−ＢｕＯＨ（５Ｈｌ）に溶解し、凍結乾燥し純粋なＡ３３５４３Ａを７７８ｍｇ得た。

Ａ３３５４３Ｄを含む両分を６つの同様の操作からのＤ含有画分とあわせ、濃縮し、同じカラムを用いるが異なる溶剤を用いてクロマトグラフした。カラムはメタノール：アセトニトリル：水（４０：　４０　：　２０）中で状Ｕ調節した。

１８０分直線勾配操作においてカラムの展開に用いた溶剤系は以下のものであった。

量（ｄ）溶　剤　Ａ　ＢＣＬＯ）ｌ　４０　９５ＣＨ３ＣＮ　４０　９５・Ｈｚｏ　２０　１０Ａ８３５４３Ｄを含む両分をあわせ濃縮した。残留物をｔ　−ＢｕＯＨ（５ｄ）に溶解し、凍結乾燥しＡ３３５４３Ｄを２１２■得た。

班−土ＮＲＲＬ１８５３７によるＡ３３５４３の−Ａ、Ｙフースコ例２、Ａと同じ方法を用いカルテ＋　−５ａｃｃｈａｒｏ　ｏｌ　ｓ　ｏｒａ胚頂児■ＮＲＲＬ１８５３７を振盪フラスコ中で培養するが、以下の植物培地Ｃを用いる。

板貫府並立 −１−一立−１酵素加水分解カゼイン”　３０．０ｇイースト抽出物　３．０ｇＭｇＳＯ４・７Ｈ，ｏ　Ｏ，２ｇグルコース　１０．Ｏｇグリセロール　２０　１ｄ脱イオン水　１ｉに十分量ｐｉ（６，６、Ｎａ０）１で７．０に調節”　ＮＺ　Ａｍ１ｎｅＡＢ、　バイオリアクターカルチャーの液体窒素アンプルを例２に記載のようにして製造する。１つのアンプルを用い第１段階植物カルチャー（２５０−フラスコ中５０ｍの培地Ｃ）に接種し、これを約４８〜７２時間インキュベートする。インキュベートした第１段階カルチャーを用い第２段階カルチャー（２１フラスコ中４００１ｄの培地Ｃ）に接種し、これを約４８時間インキユヘヒトする。インキュベートした第２段階カルチャー（５１）を用い以下の組成を有する製造培地（１ｉ！Ｍ）に接種する。

製遺旦叫↓ ペプトン化ミルク１２０綿子粉゛２０ＣａＣＯｘ　５オレイン酸メチル　３０Ｉ１１／ｌ生水　１２に十分量１ペプトン化ミルク栄養素、５ｈｅｆｆｉｅｌｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ。

”Ｐｒｏｆｌｏ　（ＮａＯＨで７．０にｐＨ調節）接種した製造培地を１６５１撹拌バイオリアクタ一中３０°Ｃの温度で約８〜１０日間発酵させる。溶解酵素レベル（Ｄｏ）は、例２のように空気飽和の５０％以上のＤＯレベルを保つようセ・７トされたコンピューター化システムによりｓｊｌＭされる。

■−】ＮＲＲＬによるＡ３３５４３のｉＡ、ンフラスコ例２と同様の方法を用い、カルチ＋　−５ａｃｃｈａｒｏ　ｏｌ　ｓ　ｏｒａ且工巨■ＮＲＲＬ１８５３９を植物培地Ｂを用いて振盪フラスコ中で培養する。

Ｂ、　バイオリアクターカルチャーの液体窒素アンプルを例２に記載のようにして製造する。１つのアンプルを用い第１段階植物カルチャー（２５０ｄフラスコ中５０Ｗ１の培地Ｂ）に接種し、これを約４８〜７２時間インキュベートする。インキュベートした第１段階カルチャーを用い第２段階カルチャー（２２フラスコ中４００ｄの培地Ｂ）に接種し、これを約４８時間インキュベートする。インキュベートした第２段階カルチャー（２ｉ！、）を用い以下の組成を有する製造培地（１１５１）に接種する。

盟盈玉並ｌ植物蛍白、一部酵素的に加水分解°２０綿子粉°゛１０ＣａＣ０，５オレイン酸メチル　３０ｄ／ｊ２水水　１２に十分量 ”　５ｈｅｆ　ｔｏｎｅ　Ｈ ”Ｐｒｏｆｌｏ　（ＮＨ４ＯＨで７．０にｐＨ調節）綿子粉　３ペプトン化ミルク　２コーン浸７責ｉ　１ＣａＣＯｘ　（工業グレード）０．５オレイン酸メチル　３．０生水 ”　Ｐｒｏｆｌ。

°°ペプトン化ミルク栄養素（ＮａＯＨで７．０にｐＨ調節）接種した製造培地を３０°Ｃの温度において約８〜１０日間又はそれ以上１６５１の撹拌バイオリアクター内で発酵させる。

Ｄ○レベルは例４に記載のようにして調節する。

斑−■ ＮＲ１１１Ｌ１８５３８によるＡ３３５４３の量　り例２及び５と同様の方法を用い、しかし植物培地Ｂ及び製造培地ｍを用いカルチャー５ａｃｃｈａｒｏ　ｏｌ　ｓ　ｏｒａ且お庶巨且セ遼胆ＮＲＲＬ１８５３８を培養する。

炭−二法によるＡ３３５４３の例６に記載のようにして発酵ブロスを製造する。以下のようにしてＡ３３５４３をブロスから分離する。

１、　ブロスに等量のアセトンを加え、セラミックフィルター又はフィルタープレスと共にフィルター助剤を用い濾過し、２、　濾液をｐＨｌｏに調節し、３、酢酸エチル（ブロスの体積の１／４〜１／２）を加え、４、不混和性水性部分をデカントすることにより酢酸エチル抽出液を回収し、そして酢酸エチル抽出液を真空により１／２体積に濃縮し、５、　水性０．１Ｍ酒石酸（１／２体積）により濃縮酢酸エチル溶液を抽出し、そして相を分離し、６、真空蒸留により水相から可溶性酢酸エチルを除去し、逆浸透を用い水溶液を濃縮し、７、　水酸化ナトリウムにより濃縮水溶液をｐＨｌ０〜１１に調節し、８、′ａ過により沈殿を分離し、水洗し、そして真空上乾燥しＡ３３５４３を得る。

勇−主法による　ブロスか゛のＡ３３５４３Ａ　びＤの例２に記載の方法と同様の方法により発酵ブロスを製造する。用いるＡ３３５４３産生カルチヤーはＮＲＲＬ１８５３９カルチャーの原種であるが、ＮＲＲＬ１８５３８及び１８５３９株の原種である。用いる株はＮＲＲＬ１８５３８及び１８５３９株よりも約６倍低い抗生力価を形成する。植物培地Ｂを用い、そして製造培地は以下のものであった。

Ｗ植物蛍白、一部酵素加水分解　２０．０綿子粉　１０．０酢酸ナトリウム　０．２グリセロール　５．０大豆油　１０．０生水　１１に十分量製造培地は３０°Ｃで約８日間インキュベートした。

インキュベートした後、ブロスは１４１ｓｃｇ／　ｍｌ！　Ａ３３５４３Ａ及び１３ｍｃｇ／ｄ　Ａ３３５４３Ｄを含んでいた（総量１６．９４ｇのＡ３３５４３Ａ及びＡ３３５４３Ｄ）、等量のアセトン（１１０ｊりを加えた。

ブロス／アセトンをプレート及びフレームプレスに通し濾過し、菌糸固体を除いた。

回収した濾液（２００ｆ）を５Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨ７，６からｐＨｌ０に調節した。次いで酢酸エチル（６０ｉ！、）を加え活性体を抽出した。撹拌後、相を分離させ、下相（１００ｆｆｉ）を捨てた。上相（酢酸エチル５０％以上）を１６０２から８０２に濃縮しアセトンを除去した。

かなり着色した水相（２０ｆ）をデカントにより除去し、濃縮酢酸エチル相（６０ｊ２）を等量の水中０．ＩＮ酒石酸を用い逆抽出した。水性酒石酸相（７０ｆ）を回収し、真空下１ｍし不混和性酢酸エチルを除去し、次いでＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　ＰｒｏＬａｂ逆浸透ユニットを用い４ｆ（２０倍）に４縮した。

１４縮水性酒石酸溶液（４２）を水酸化ナトリウムによりｐＨ３からｐＨ１０に調節し、ゆっくり沈殿を形成させた。沈殿を濾過し、水洗し、真空下４０°Ｃで乾燥し、８１５＊ｃｇ／■のＡ３３５４３Ａ及び６７ｍｃｇ　／■のＡ３３５４３Ｄを有する乾燥沈殿を１３．４ｇ得た。

この収量は１１．８　ｇのＡ３３５４３Ａ及びＡ３３５４３Ｄの回収率を示し、ブロス全体より６９，６％の収率である。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ａ８３５４３Ａ及びＡ８３５４３Ｄを含む発酵生成物Ａ８３５４３の回収方法であって、１）ブロス全体にほぼ等量の水混和性溶剤を加えること；２）バイオマスから液相を分離すること；３）約１０〜約１１のｐＨにおいて不混和性溶剤により液相を抽出すること；４）有機相を分離しそしてこれを濃縮し残っている水混和性溶剤を除去すること；５）有機相からかなり着色した不混和性水相を除去すること；６）酸の希釈溶液により有機相を逆抽出すること；７）（ｉ）（ａ）水性酸性相から有機溶剤の混和性部分を除去し、（ｂ）逆浸透を用いて水相を濃縮し、そして（ｃ）十分量の塩基を加えＡ８３５４３を沈殿させること；又は（ｉｉ）アセトン又はメタノールを２０％以下含む塩基を十分量加えＡ８３５４３を沈殿させること、そして８）濾過によりＡ８３５４３を分離することを含む方法。
２．工程７（ｉ）を用いる、請求項１記載の方法。
３．工程７（ｉｉ）を用いる、請求項１記載の方法。
４．工程１の水混和性溶剤がアセトンである、請求項１記載の方法。
５．工程３で用いられる溶剤が酢酸エチルである、請求項１記載の方法。
６．工程６で用いられる酸が酒石酸である、請求項１記載の方法。