FI112375B - Avermektiinejä tuottava Streptomyces avermitilis -kanta - Google Patents
Avermektiinejä tuottava Streptomyces avermitilis -kanta Download PDFInfo
- Publication number
- FI112375B FI112375B FI20030488A FI20030488A FI112375B FI 112375 B FI112375 B FI 112375B FI 20030488 A FI20030488 A FI 20030488A FI 20030488 A FI20030488 A FI 20030488A FI 112375 B FI112375 B FI 112375B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- avermectins
- water
- natural
- avermectin
- pct
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
- C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
- C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
112375
Avermektiinejä tuottava Streptomvces avermitilis -kanta Keksinnön tausta Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta 5 FI 960304.
Tämä keksintö koskee Streptomyces avermitilis ATCC 55453:n biologisesti puhdasta viljelmää. Kannasta eristetään ja puhdistetaan avermektiiniyhdisteitä. Erityisesti avermektiiniyhdisteitä uutetaan fermentointiliemestä.
10 Avermektiinit ovat laajaspektrinen ryhmä macroli- di-tyyppisiä antiparasiittisia aineita. Niitä tuotetaan fermentoimalla Streptomvces avermitilis -mikro-organis-mikantaa (esim. ATCC 31267, 31271 tai 31272 tai niiden mu-tantteja) aerobisissa olosuhteissa vesipitoisessa ravinto-15 alustassa, joka sisältää epäorgaanisia suoloja ja assimiloituvia hiilen- ja typenlähteitä. Tyypillisesti avermektiinit on karakterisoitu nimistöjärjestelmällä, jossa käytetään erilaisia kirjaimia ja numeroita, jotka viittaavat spesifisiin substituentteihin.
20 Avermektiinien alaryhmä, luonnolliset avermektii- ,. nit, sisältävät yhdisteitä, joissa C5-kohta on korvattu • · nietoksilla (merkitty A: 11a) tai hydroksilla (merkitty >'·' B:llä), C2s-kohta on korvattu s-butyylillä (merkitty a:lla) tai isopropyylillä (merkitty b:llä) ja C23-kohta on 25 korvattu hydroksilla (merkitty 2:11a) tai liitetty j C22-kohtaan kaksoissidoksella (merkitty l:llä). Näin on olemassa kahdeksan mahdollista luonnollista avermektiiniä, ja spesifisiin yhdisteisiin viitataan käyttämällä symboli-:*,·. en yhdistelmiä, kuten Bla tai B2b. Lisäksi luonnollisten ,···, 30 avermektiinien alaryhmään voitaisiin viitata esimerkiksi ·’ käyttämällä termiä luonnolliset B-avermektiinit. Luonnol- i » · V · liset B-avermektiinit viittaavat neljään luonnolliseen avermektiiniin, joissa Cs-kohta on korvattu hydroksilla, I C25-kohta on korvattu joko isopropyylillä tai s-butyylillä .···, 35 ja C23-kohta on korvattu hydroksilla tai liitetty C22-kohtaan kaksoissidoksella. Kahdeksan luonnollisen 2 11237b avermektiiniyhdisteen eristys ja kemiallinen rakenne (joskus viitattu C-076-yhdisteet) kuvataan yksityiskohtaisesti GB-patenttijulkaisussa nro 1 573 955.
On useita menetelmiä eristää avermektiinejä kasvu-5 alustasta ja eristää selektiivisesti tiettyjä avermektiinejä kasvualustasta. Esimerkiksi US-patenttijulkaisussa nro 4 423 211 kuvataan menetelmä, jossa fermentointialus-tan pH säädetään alueelle 1,5 - 6 mineraalihapolla, kuten rikki-, kloorivety- tai typpihapolla. Sen jälkeen liemi 10 saatetaan yhteen ja sitä sekoitetaan uuttavan aineen, kuten tolueenin kanssa, ja avermektiiniyhdisteet liukenevat uuttavaan aineeseen ja saadaan sen mukana talteen. Liuos, joka sisältää avermektiinin ja uutteen, viedään sen jälkeen separaattorin läpi uuttavan aineen poistamiseksi, ja 15 jäljelle jäävä avermektiini eristetään esimerkiksi kiteyttämällä .
Lisäksi US-patenttijulkaisussa nro 5 077 398 kuvataan kaksivaiheinen menetelmä, jossa B1-komponentit kiteytetään avermektiinia sisältävän liemen konsentroidusta ve-20 teen sekoittumattoman liuottimen uutteesta alkoholilla tai . hiilivety/alkoholi-seoksella. B2-komponentit kiteytetään supersaturaatiota seuraavasta, jäljelle jäävästä uutteesta *' (joka jää B1-kiteytyksen jälkeen) (esimerkiksi alentamalla 1 » I lämpötilaa) käyttäen B2-ymppikiteitä.
,· 25 Vaikka edellä kuvatut menetelmät ovat edistäneet \· tekniikkaa, nämä menetelmät edelleen perustuvat vettä si- % : sältämättömien liuottimien käyttöön ja ympäristöä koskevat seikat edellyttävät vähäisempää liuottimien käyttöä, mil- • V. loin se on mahdollista. Niinpä etsitään edelleen uusia me- t » 30 netelmiä avermektiinien eristämiseksi.
Keksinnön yhteenveto • » t ‘ Tämä keksintö koskee menetelmää eristää luonnolli- nen B-avermektiini luonnollisesta avermektiiniä sisältä- • västä f ermentaatioliemestä käyttämällä saostusta vesipi- » I * » 35 toisella aineella. Menetelmä sisältää luonnollisten aver- I i » mektiinien uuttamisen fermentaatioliemestä veteen sekoit- 112375 3 tuvalla liuottimena ja riittävän vesimäärän lisäämisen luonnollisten B-avermektiinien saostamiseksi. Edullisesti veteen sekoittuva liuotin on Ci-3-alkoholi, asetoni tai asetonitriili. Lisäksi voidaan saostamisen helpottamiseksi 5 lisätä happoa, emästä, suolaa tai pinta-aktiivista ainetta. Edullisesti hapossa, emäksessä tai suolassa on natrium-, kalium-, kalsium-, ammonium- tai vetykationi ja kloridi-, fosfaatti-, sulfaatti-, nitraatti-, bikarbonaatti-, karbonaatti- tai hydroksidianioni. Pinta-aktiivinen aine 10 on edullisesti natriumlauryylisulfaatti.
Tässä keksinnössä tehdään merkittävä edistysaskel avermektiinin eristyksessä antamalla käyttöön menetelmä, joka korvaa saostukset vettä sisältämättömillä liuottimilla saostuksilla, joissa käytetään vettä. Vettä sisältämät-15 tornien liuottimien käytön vähentäminen saa aikaan taloudellista etua ja etua ympäristö- ja turvallisuusasioissa. Tuotteiden puhdistusta edistävän saostuksen valitseminen käyttää hyväkseen avermektiinien liukoisuuden voimakasta riippuvuutta veteen sekoittuvien orgaanisten liuottimien 20 vesisisällöstä. Menetelmää voidaan muunnella lisäämällä , erilaisia aineita (esim. happoa, emästä, suoloja, pinta- aktiivisia aineita) sakan ominaisuuksien muuttamiseksi (esim. rakeinen, mieluummin kuin öljyinen sakka) ja edul- » 1 · listen komponenttien (esim. B1-komponentit B2-komponentti- • 25 en kustannuksella) valitsemisen helpottamiseksi.
• ,·* Muut keksinnön kohteet, piirteet ja edut käyvät ilmeisemmiksi seuraavasta yksityiskohtaisesta selitysosasta ja patenttivaatimuksista.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus • t ,···, 30 Tämän keksinnön menetelmässä voidaan käyttää mitä
» I
’·' tahansa avermektiinilientä, joka sisältää halutun tuot- 1 » t * teen, luonnollista B-avermektiiniä tai tällaisten avermek- tiinien seosta, edullisesti pitoisuus, joka on yli noin : 0,2 grammaa/litra. Avermektiiniliemellä tarkoitetaan aver- 35 mektiiniä sisältävää alustaa, joka syntyy sopivan viljelmän, yleensä Streptomyces avermitilis -kannan, fermentoin- 112375 4 nin tuloksena. On kuitenkin tarkoitus, että siihen sisältyvät myös kiinteät aineet, tai kiinteiden aineiden suspensio (joka sisältää suurimman osan avermektiineistä) , jotka syntyvät tällaisen fermentaation tuloksena. Tällai-5 set kiinteät aineet voidaan konsentroida fermentaatiosta sellaisilla menetelmillä kuten sentrifugointi tai suodatus. Menetelmän tehokkuuden aste johtuu halutun avermek-tiinin/avermektiinien pitoisuudesta liemessä, joka johtuu avermektiinien ja liemestä peräisin olevien epäpuhtauksien 10 liukoisuusominaisuuksista vesipitoisen liuottimen seoksissa. Näiden ominaisuuksien johdosta haluttujen avermektiinien saanto ja menetelmästä saadun tuotteen laatu paranevat, kun halutun avermektiinin/avermektiinien pitoisuus liemessä kasvaa, On edullista, että halutun avermektii-15 nin/avermektiinien pitoisuus liemessä on suurempi kuin noin 0,2 grammaa/litra, koska tämä helpottaa suurempien saantojen ja parempilaatuisten tuotteiden saannon.
Mitä tahansa sellaista veteen sekoittuvaa liuotinta voidaan käyttää luonnollisten avermektiinien uuttami-20 seksi edellä kuvatusta avermektiiniliemestä, jolla kyetään . uuttamaan luonnolliset avermektiinit ja joka ei vaikuta haitallisesti haluttuun lopputuotteeseen. Veteen sekoittu- ;* va liuotin on tyypillisesti Ci-3-alkoholi, asetoni tai ase- < · : tonitriili. Edullisesti liuotin on Ci-3-alkoholi ja erit- 25 täin edullisesti liuotin on metanoli. Mitä tahansa sel-laista määrää liuotinta voidaan käyttää, jolla kyetään uuttamaan halutut luonnolliset avermektiinit. Yleensä käytetään noin 150 - 300 paino-% liuotinta suhteessa liemeen :V. tai konsentroituun liemeen sillä, kun mennään alle noin 30 150 %:n, huomattava määrä haluttuja luonnollisia avermek- tiinejä jää assosioituneeksi liemisuspension kiinteän faa-'* ‘ sin kanssa, ja noin 300 %:n yläpuolella ei-toivotut fer- mentaatiosivutuotteet voidaan uuttaa mukana ja liuotinta j käytetään tarpeettomasti. Kiinteät aineet poistetaan uut- * * » · 35 teestä standardilla menetelmällä, kuten suodatuksella tai sentrifugoinnilla.
3 112375
Vaikka pelkkää vettä voidaan lisätä avermektiinin veteen sekoittuvan liuottimen uutteeseen haluttujen luonnollisten B-avermektiinien saostamiseksi selektiivisesti, happoa, emästä, suolaa tai pinta-aktiivista ainetta (saos-5 tuksen käynnistäjä) lisätään tyypillisesti yhdessä veden kanssa saostuksen helpottamiseksi. Edullisesti hapossa, emäksessä tai suolassa on natrium-, kalium-, kalsium-, ammonium- tai vetykationi ja kloridi-, fosfaatti-, sulfaatti-, nitraatti-, bikarbonaatti-, karbonaatti- tai hydrok-10 sidianioni. On erittäin edullista, että happo, emäs tai suola on natriumkloridi, kaliumfosfaatti, rikkihappo, natriumbikarbonaatti, natriumhydroksidi tai kaliumhydroksidi. Natriumkloridin tai natriumbikarbonaatin lisäys on erityisen edullista, koska se parantaa sakan käsittelyominai-15 suuksia. Vaikka mitä tahansa pinta-aktiivista ainetta voidaan käyttää saostamisen helpottamiseksi (esim. saa aikaan edullisemman sakan laadun), on edullista, että pinta-aktiivinen aine on anioninen tai kationinen ja erityisen edullista, että pinta-aktiivinen aine on alkyylisulfonaat-20 ti, kuten natriumlauryylisulfaatti. Lisäksi voidaan käyt-, tää yhdistelmiä edellä kuvatuista hapoista, emäksistä, ;* suoloista tai pinta-aktiivisista aineista saostamisen hel pottamiseksi. Esimerkiksi suolojen ja pinta-aktiivisten aineiden yhdistelmät, kuten natriumkloridi ja natriumlau-25 ryylisulfaatti, ovat erityisen edullisia, koska ne saavat ‘ aikaan sakkoja, jotka ovat puhtaita ja joilla on halutut käsittelyominaisuudet.
Voidaan käyttää mitä tahansa sellaista määrää vettä, joka tehokkaasti, selektiivisesti saostaa luonnolliset . 30 B-avermektiinit veteen sekoittuvan liuottimen liemiuut- • teestä. Yleensä sen veden määrä, joka lisätään halutun ‘ tuotteen saostamiseksi, johtuu uutteen alkuperäisestä ve- ·...· sisisällöstä ja halutun avermektiinin/avermektiinien pi- : toisuudesta. Seoksen haluttu vesipitoisuus veden lisäyksen ,*·, 35 jälkeen vaihtelee lopullisen seoksen noin 45 paino-%:sta > · noin 75 paino-%:iin. Edullisesti lisätty vesi tuottaa lo- 6 112375 pullisessa seoksessa noin 50 - 65 paino-%:n vesipitoisuuden. Edullinen veden määrä saattaa vaihdella riippuen hapon, emäksen, suolan tai pinta-aktiivisen aineen tyypistä tai lisäyksen määrästä. Näin on yleensä edullista käyttää 5 enemmän vettä, jos esimerkiksi edellä kuvattuja lisäaineita ei käytetä. Lisäksi veden määrää voidaan edullisesti muuttaa tiettyjen luonnollisten B-avermektiinien selektiivisen saostumisen saavuttamiseksi. Näin esimerkiksi pienempi vesimäärän lisäys tekee yleensä helpommaksi Bl-kom-10 ponenttien selektiivisen saostumisen suhteessa B2-komponentteihin.
Yleensä voidaan käyttää mitä tahansa sellaista määrää saostuksen käynnistäjää, joka tehokkaasti yhdessä veden kanssa selektiivisesti saostaa luonnollisia B-aver-15 mektiineja veteen sekoittuvan liuottimen liemiuutteesta. Tyypillisesti käytetään suolaa noin 0-8 paino-% lopullisesta seoksesta ja edullisesti suolaa käytetään noin 3-5 paino-% lopullisesta seoksesta. Tyypillisesti käytetään pinta-aktiivista ainetta noin 0-2 paino-% lopullisesta 20 seoksesta ja edullisesti pinta-aktiivista ainetta käyte-. tään noin 0,1 - 1 paino-% lopullisesta seoksesta. Tyypil lisesti käytetään sellaista määrää happoa, joka riittää saamaan pH:ksi noin 2 - 7 ja edullisesti käytetään sel-. : laista määrää happoa, joka riittää saamaan pH:ksi noin ,· 25 2,5-4. Tyypillisesti käytetään sellaista määrää emästä, ,* joka riittää saamaan pH.-ksi noin 8 - 11 ja edullisesti : ; käytetään sellaista määrää emästä, joka riittää saamaan pH:ksi noin 8,5 - 10.
Yleensä tämän keksinnön menetelmä suoritetaan uut-, 3 0 tamalla luonnolliset avermektiinit fermentointiliemestä veteen sekoittuvalla liuottimena ja lisäämällä riittäväs- ; i · ' ti vettä (ja mitä tahansa haluttua saostuksen edistäjää) luonnollisten B-avermektiinien saostamiseksi. Edullisesti * fermentointiliemen biomassa konsentroidaan esimerkiksi . . 35 sentrifugoimalla, suodattamalla tai ultrasuodattamalla noin 4 - 12-kertaisesti alkuperäisestä pitoisuudestaan, ja 7 112375 tuloksena syntyvään kosteaan kiinteään aineeseen lisätään sopiva määrä veteen sekoittuvaa liuotinta. Tuloksena syntyvää lietettä sekoitetaan sopivalla voimakkuudella riittävä aika haluttujen avermektiinien liukenemisen varmista-5 miseksi (yleensä noin 1-8 tuntia). Jäljelle jäävä sus-pendoitu kiinteä aine (joka sisältää biomassan, fermentaa-tiosivutuotteet, lipidit, lipoproteiinit jne.) poistetaan sentrifugoimalla, suodattamalla tai ultrasuodattamalla. Tyypillisesti nämä prosessinvaiheet suoritetaan vaihtele-10 vissa lämpötiloissa, vaikka voidaankin käyttää mitä tahansa lämpötilaa (esim. noin 15 - 40 °C) , joka ei huomattavan haitallisesti vaikuta halutun tuotteen saantoon.
Muodostuvaan veteen sekoittuvan liuottimen fermen-taatioliemiuutteeseen lisätään haluttu määrä vettä ja mitä 15 tahansa haluttua saostuksen edistäjää. Tämä lisäys suoritetaan tyypillisesti ryhmälisäyksenä samalla sekoittaen. Liuosta sekoitetaan riittävä aika (esim. 12 - 48 tuntia) halutun luonnollisen B-avermektiinisakan saamiseksi. Jälleen tämä saostus suoritetaan edullisesti vaihtelevassa 20 lämpötilassa, vaikka voidaan käyttää mitä tahansa lämpötiloja (esim. noin 15-40 °C) , jotka eivät huomattavan hai-tallisesti vaikuta halutun tuotteen saantoon.
'•V Muodostuvat sakat kerätään esimerkiksi suodatta- maila ja puhdistetaan edelleen. Vaikka jatkopuhdistus voi-25 daan toteuttaa millä tahansa alan ammattimiesten tuntemal-: * : la keinolla (mukaan lukien esimerkiksi kromatografiset tekniikat tai liuottimeen perustuva uudelleenkiteytys, ku-
• I I
ten ne on kuvattu US-patenttijulkaisussa 5 077 398), on edullista käyttää uudelleenkiteytystä, joka perustuu veden ,··*, 3 0 ja veteen sekoittuvan liuottimen käyttöön ensimmäisessä • uutossa. Näin sakka liuotetaan uudelleen veteen sekoittu- ( » « ’·’ * vaan liuottimeen ja haluttu tuote saadaan puhtaampana li- säämällä riittävästi vettä ja vaihtoehtoisesti suoloja j ja/tai pinta-aktiivista ainetta halutun tuotteen selektii- ,··, 35 visen kiteytymisen saamiseksi. Menetelmää voidaan toistaa kunnes saadaan tuotteelle haluttu puhtaus. Tämän menetel- β 112376 män etu on se, että käytetään yhtä ainoaa liuotinta koko tuotteen talteenottamis- ja puhdistusprosessiin, mikä yksinkertaistaa liuottimen uudelleenkäyttöä, mistä seuraa taloudellista etua ja etua ympäristön kannalta.
5 Tämän keksinnön menetelmää voidaan käyttää selek tiivisesti, kollektiivisesti saostamaan luonnollisia B-avermektiinejä tai sitä voidaan käyttää saostamaan peräkkäin selektiivisesti luonnollisten B-avermektiinien alaryhmiä, kuten luonnolliset Bl-avermektiinit (ts. Bla, 10 Blb), jonka jälkeen saostetaan jäljelle jäävät luonnolliset B2-avermektiinit.
Alan ämmättimiehilie on ilmeistä, että edellä kuvattua menetelmää "luonnollisten" avermektiinien saamiseksi voidaan helposti käyttää muuntyyppisten avermektiinien 15 ottamiseksi talteen. Muita kuin "luonnollisia" avermek-tiineja, joita on kuvattu GB-patenttijulkisussa nro 1 573 955, ovat esimerkiksi sellaiset, jotka on kuvattu US-patenttijulkaisussa nro 5 089 480. Niinpä esimerkiksi avermektiinejä, joissa on sykloheksyyli- tai syklopentyy-20 lisubstituentteja C-25-kohdassa, voidaan saada niitä si sältävistä fermentaatioliemistä tätä keksintöä käyttämäl-• : lä.
,* Tämä keksintö antaa käyttöön sellaisen menetelmän ;* avermektiinien saamiseksi, jossa vältetään sellaisten liu- : 25 ottimien käyttöä kuin tolueeni tai klooratut liuottimet, ; joiden turvallisuusriskit ja ympäristöongelmat tunnetaan, ja tekee mahdolliseksi talteenoton yhden liuottimen avulla, ja puhdistusprosessin, joka helpottaa liuottimen kier-:v, rätystä ja käyttöä uudelleen. Se myös yhdistää yhdeksi me- i * 30 netelmän vaiheeksi avermektiinien konsentroinnin fermen- taatioliemestä ja merkittävän avermektiinien yleispuhdis-*,* * tuksen ja spesifisesti halutumpien komponenttien puhdis- V..: tuksen. Lopulta siinä ei tarvitse suorittaa liemiuutteen ; ,*, esikonsentrointia, mistä seuraa mahdollisia säästöjä lai- i 1 > ·*> 35 temenoissa menetelmää toteutettaessa.
» »
I I
I 1 i 9 112375
Tulisi ymmärtää, ettei keksintö rajoitu tässä kuvattuihin tiettyihin suoritusmuotoihin vaan, että voidaan tehdä useita muutoksia ja modifikaatioita poikkeamatta tämän uuden menetelmän hengestä ja piiristä, jotka määritel-5 lään seuraavissa patenttivaatimuksissa.
Esimerkki 1
Fermentaatio
Avermektiinit tuotettiin fermentoimalla Streptomy-ces avermitilis -mutanttikantaa. Käytetty kanta, joka ni-10 mettiin R69-73'ksi, tallennettiin Budapest-sopimuksen mukaisesti American Type Culture Collection'iin, Rockville, Maryland 20852, USA, talletusnumerolla ATCC 55453 20. pnä heinäkuuta, 1993. Tämä kanta tuottaa edullisesti pienempiä määriä A-tyypin (ts. 5-O-metyyli) avermektiinejä kuin tal-15 lennettu kanta, josta tämä kanta oli peräisin (ATCC 31272). Tämä ominaisuus helpottaa B-tyypin avermektiinien tuottoa, jonka tiedetään olevan tehokkaampaa kuin A-tyypin avermektiinien.
Ymppi valmistettiin kasvattamalla viljelmä Fern-20 bach-pulloissa (2,8 litran kapasiteetti), jotka sisältävät , 500 ml seuraavaa alustaa: ** grammaa/litra : Pharmamedia (puuvillansiemenjauho) 15
- I
, ·’ 25 Ardamine pH (hiivauute) 5 : Ohennettu tärkkelys 2 0
Kalsiumkarbonaatti 2
Alustan pH säädettiin 7,2:ksi natriumhydroksidilla ,·*·, 30 ja se steriloitiin autoklavoimalla pulloja 121 °C:ssa 45 t · ’·' minuuttia ennen käyttöä. Viljelmällä siirrostamisen jäi- Ϊ I i ’,· ' keen pulloja inkuboitiin 72 tuntia 29 °C-.n lämpötilassa pyörivässä ravistelijassa nopeudella 200 rpm. Kahta pulloa : .·. käytettiin sen jälkeen siirrostamaan tuotantofermentori, ,** , 35 14 litran astia, joka sisältää 10 litraa seuraavaa alus taa: 10 1 1237? grammaa/litra
Glukoosimonohydraatti 4 5 peptonoitu maitoravinne 24
Ardamiini pH (hiivauute) 2,5 5 P-2000 vaahtoamisenestoaine 2,5
Alustan pH säädettiin 7,0:ksi natriumhydroksidilla ja se steriloitiin autoklavoimalla pulloja 121 °C:ssa 75 minuuttia. Jäähtymisen jälkeen fermentoriin pantiin ilmaa 10 nopeudella 5 standardilitraa minuutissa ja sitä sekoitettiin nopeudella 600 rpm. Siirrostus suoritettiin edellä kuvatuilla pulloilla. Viisi päivää siirrostuksen jälkeen aloitettiin jatkuva glukoosiliuoksen syöttö, jolloin annettiin 50 grammaa glukoosia päivässä. Syöttöä jatkettiin 15 13. päivään saakka siirrostuksen jälkeen, jona ajankohtana fermentoinnista harvestoitiin saalis. Avermektiinien pitoisuudet harvestissa mitattuna HPLC:llä olivat seuraavat:
Bla-413, Blb-333, B2a-471, B2b-186 mg/litra.
Saalis 20 Fermentointiliemi (7 litraa) sentrifugoitiin bio massaan sisältyvien avermektiinien konsentroimiseksi. Saa-tiin kokonaismääräksi 1 163 grammaa (märkäpaino) konsent-** roituja liemen kiinteitä aineita. 581 grammaan märkää kiinteää ainetta lisättiin 1 200 ml metanolia. Perusteel-,· 25 lisen sekoittamisen jälkeen avermektiinien liuottamiseksi vesipitoisen metanolin liete suodatettiin suspendoituneen .kiinteän aineen poistamiseksi. Jäljelle jäävä metanoliuute sisälsi 39 painoprosenttia vettä (Karl Fischer -titrauk-sella) ja seuraavat pitoisuudet avermektiinejä: * 30 Bla-1146, Blb-822, B2a-1307, B2b-379 mg/litra.
Suodatetun uutteen haihtumaton kiinteä aine - si-V * sältö oli 17,1 grammaa/litra. Bla:n suhde haihtumattoman kiinteän aineen kokonaismäärään (Bla:n puhtaus) oli 6,7 %.
: Kussakin taulukon 1 kuvaamassa saaliissa käytet- ,···, 35 tiin 100 ml edellä kuvattua metanoliuuteliuosta. Taulukos sa 1 luetellut lisäaineet lisättiin ja liuosta sekoitet- X1 1 12375 tiin 24 tuntia huoneen lämpötilassa (23 °C). Muodostuvat sakat kerättiin viemällä suspensio suodattimen läpi, joka sisälsi 3 grammaa suodattavaa ainetta (ts. kalsinoitua piimaata) paperilla. Sakan laatu karakterisoitiin tekemäl-5 lä havaintoja sakasta ennen ja jälkeen suodatuksen, ja tulokset luetteloitiin taulukkoon 1. Sen jälkeen, kun suodatettu kakku oli pesty 10 ml :11a vesipitoista metanolia, jonka vesisisältö oli suurinpiirtein sama kuin suodatetun suspension, kakku suspendoitiin metanoliin avermek-10 tiinisakan liuottamiseksi uudelleen. Muodostuneista liuoksista määritettiin HPLC:llä niiden avermektiinisisällöt. Näytteet liuoksista kuivattiin haihtumattoman materiaalin kokonaissisällön määrittämiseksi. Bla-puhtaudet taulukossa 1 laskettiin sakkaliuosten Bla-sisällön suhteena liuosten 15 haihtumattoman kiinteän aineen kokonaissisältöön.
- » » i · > 1 #
! ! I
* · 112375 12
Taulukko 1 ..... ......... 11
Lisäaineet, Lopullinen Sakan Sakan Bla- Bla:n puhtaus paino/tilav.-% vesisisältö, laatu saanto sakassa paino-% ^ Vain vesi 55% öljyinen 79% 25/5%
Vain vesi__60%_ öljyinen 81%__22,5%_
Vesi 55% öljyinen 78% 18,2%
NaCI 4% —
Vesi 60% öljyinen 86% 19,5% U NaCI 4%_____
Vesi 55% tahnamai- 71% 19^7% Il
NaCI 4% NaLS* nen 0,2%_____
Vesi 60% vahamai- 82% 20,8% I
15 NaCI4%NaLS· nen 0,2%_____
Vesi 65% vahamai- 61% 14,6%
NaCI 4% Inen I 9
NaLS* 0,2%___
Vesi 55% öljyinen 74% 35,4% 1 20 NaHCOj 2%____
Vesi 55% öljyinen 81% 27,4% 1
K2HPQ4 2%_____I
!. Vesi 55% erittäin 73% 21,5% : H2S04 - öljyinen 25 pH 3_____
Vesi NH4OH - 61% I erittäin 82% I 27,3% I
pH 9 * NaLS = Natriumlauryylisulfaatti * ,··, 30 Lisäpuhdistus suoritettiin avermektiinien vedellä • tapahtuvalla uudelleenkiteytyksellä metanoliliuoksista li- * säämällä vettä ja toistamalla prosessia kunnes haluttu · puhtaus saavutettiin. Esimerkiksi tässä tapauksessa 4 % ; NaCl:ää, 0,2 % NaLS:ää ja 60 % vettä käytettiin saostami- 35 seen, kahden uudelleenkiteytyksen jälkeen saatu tuote oli » » 13 112375 95 paino-%:isesti avermektiiniä (noin 75 % Bla ja 20 %
Bib) .
Esimerkki 2
Konsentroitu liemen kostea kiinteä aine esimerkis-5 tä 1, 582 grammaa, sekoitettiin 1 200 ml:n kanssa asetonia avermektiinien liuottamiseksi. Vesipitoinen asetoniliete suodatettiin suspendoitujen kiinteiden aineiden poistamiseksi. Jäljelle jäävä asetoniuute sisälsi 41,9 painoprosenttia vettä (Karl Fischer -titrauksella) ja seuraavat 10 pitoisuudet avermektiinejä:
Bla-1393, Blb-999, B2a-1539, B2b-460 mg/litra. Uutteen haihtumaton kiinteä aine -sisältö oli 16,9 grammaa/litra ja uutteen Bla:n puhtaus (kuten edellä on kuvattu) Bla oli 8,2 %.
15 Kussakin taulukon 2 kuvaamassa saaliissa käytet tiin 100 ml edellä kuvattua asetoniuuteliuosta. Taulukossa 2 luetellut lisäaineet lisättiin ja liuosta sekoitettiin 24 tuntia huoneen lämpötilassa (23 °C) . Muodostuvat sakat kerättiin viemällä suspensio suodattimen läpi, joka sisäl-20 si 3 grammaa suodattavaa ainetta (ts. kalsinoitua piimää-. ta) paperilla. Sen jälkeen, kun suodatettu kakku oli pesty 10 ml :11a asetonin vesisliuosta, jonka vesisisältö oli < a suurin piirtein sama kuin suodatetun suspension, kakku : suspendoitiin metanoliin avermektiinisakan liuottamiseksi 25 uudelleen. Muodostuvat liuokset analysoitiin, samalla ta- » voin kuin esimerkin 1 liuokset, taulukko 1.
* I
t • » a < »
> · I
) » » # t i i » » a 112375 14
Taulukko 2
Lisäaineet, Lopullinen Sakan laatu Sakan Bla- Bla:n puh- I
Paino/ vesisisältö, saanto taus sakassa tilav.-% paino-% 5 Vain vesi 60%__öljyinen__75%__20,3%_
Vain vesi 70%__öljyinen__81%__22,1%_
Vesi 60% öljy inen 95% 161% O
NaCI 4%_____
Vesi 70% öljyinen 97% 16,4% 10 NaCI 4%_____
Vesi 60% vahamainen 75% 16.9%
NaCI 4%
NaLS* 0,2%_____
Vesi 70% vahamainen 87% 15,4%
NaCI 4% 15 NaLS* 0,2% — -I_ .--g=ga= - —-
Kuten esimerkissä 1, tuotteet, joiden avermek-tiinipuhtaudet olivat 95 %, saatiin toistamalla kiteytykset metanolista vettä lisäämällä.
20
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US9674593A | 1993-07-23 | 1993-07-23 | |
US9674593 | 1993-07-23 | ||
IB9400080 | 1994-04-26 | ||
PCT/IB1994/000080 WO1995003419A1 (en) | 1993-07-23 | 1994-04-26 | Method for precipitating natural avermectins |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI20030488A FI20030488A (fi) | 2003-04-01 |
FI112375B true FI112375B (fi) | 2003-11-28 |
Family
ID=22258886
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI960304A FI112092B (fi) | 1993-07-23 | 1996-01-22 | Menetelmä luonnollisten avermektiinien saostamiseksi |
FI20030488A FI112375B (fi) | 1993-07-23 | 2003-04-01 | Avermektiinejä tuottava Streptomyces avermitilis -kanta |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI960304A FI112092B (fi) | 1993-07-23 | 1996-01-22 | Menetelmä luonnollisten avermektiinien saostamiseksi |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5686274A (fi) |
EP (1) | EP0710290B1 (fi) |
JP (1) | JP2828343B2 (fi) |
AT (1) | ATE175240T1 (fi) |
AU (1) | AU674743B2 (fi) |
BR (1) | BR9407141A (fi) |
CA (1) | CA2167186C (fi) |
CO (1) | CO4230201A1 (fi) |
DE (1) | DE69415675T2 (fi) |
DK (1) | DK0710290T3 (fi) |
ES (1) | ES2125446T3 (fi) |
FI (2) | FI112092B (fi) |
GR (1) | GR3029285T3 (fi) |
NZ (1) | NZ263615A (fi) |
WO (1) | WO1995003419A1 (fi) |
ZA (1) | ZA945415B (fi) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998056939A1 (fr) * | 1997-06-09 | 1998-12-17 | Vladimir Alexandrovich Mosin | Souche de streptomyces avermitilis, procede de separation de complexes d'avermectine et preparations destinees a la protection d'animaux et de vegetaux |
KR100419554B1 (ko) * | 1999-10-29 | 2004-02-19 | 주식회사유한양행 | 아버멕틴의 정제방법 |
US6872708B2 (en) * | 2001-09-10 | 2005-03-29 | Mitsukazu Matsumoto | Local injection prescription |
JP4373080B2 (ja) * | 2002-12-24 | 2009-11-25 | 三井化学アグロ株式会社 | ミルベマイシン類の精製法 |
AU2004325859A1 (en) * | 2004-12-23 | 2006-06-29 | J P Laboratories Pvt. Ltd. | Process for preparing a detergent |
CN103333214B (zh) * | 2013-07-03 | 2015-08-12 | 大庆志飞生物化工有限公司 | 一种阿维菌素B2a精粉的制备方法 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FI56187C (fi) * | 1970-07-02 | 1979-12-10 | Takeda Chemical Industries Ltd | Foerfarande foer framstaellning av antibiotiskt aktiva estrar av makrolidglykosiderna b-5050 eller tetrahydro b-5050 |
US4017516A (en) * | 1972-11-15 | 1977-04-12 | Schering Corporation | Novel monoesters of rosamicin |
SE434277B (sv) * | 1976-04-19 | 1984-07-16 | Merck & Co Inc | Sett att framstella nya antihelmintiskt verkande foreningar genom odling av streptomyces avermitilis |
US4201861A (en) * | 1977-10-03 | 1980-05-06 | Merck & Co., Inc. | Acyl derivatives of C-076 compounds |
US4307085A (en) * | 1979-11-09 | 1981-12-22 | Schering Corporation | Antibiotic AR-5 complex, antibiotics coproduced therewith and derivatives thereof |
US4389397A (en) * | 1980-08-04 | 1983-06-21 | Merck & Co., Inc. | Solubilization of ivermectin in water |
US4399274A (en) * | 1981-07-02 | 1983-08-16 | Merck & Co., Inc. | Isolation of non-ionic lipophilic materials on macroreticular polymeric absorbents |
US4703009A (en) * | 1983-03-08 | 1987-10-27 | Merck & Co., Inc. | RDNA cloning vector pVE1, deletion and hybrid mutants and recombinant derivatives thereof products and processes |
ES8800986A1 (es) * | 1985-07-27 | 1987-12-01 | Pfizer | Un procedimiento para la produccion de un nuevo derivado de avermectina |
US5077348A (en) * | 1986-10-31 | 1991-12-31 | Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd. | Aqueous coating composition, process for the production thereof and aqueous coating |
US5077398A (en) * | 1986-11-18 | 1991-12-31 | Merck & Co., Inc. | Process for isolation of avermectin B1 components with improved purity and subsequent isolaton of B2 components |
US5234831A (en) * | 1987-01-23 | 1993-08-10 | Pfizer Inc | Cultures for production of B avermectins |
JP2888586B2 (ja) * | 1990-03-05 | 1999-05-10 | 社団法人北里研究所 | エバーメクチンの特定成分を選択生産するための微生物およびその選択的製造法 |
-
1994
- 1994-04-26 WO PCT/IB1994/000080 patent/WO1995003419A1/en active IP Right Grant
- 1994-04-26 JP JP6520399A patent/JP2828343B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-04-26 DE DE69415675T patent/DE69415675T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-04-26 BR BR9407141A patent/BR9407141A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-04-26 AU AU64361/94A patent/AU674743B2/en not_active Ceased
- 1994-04-26 NZ NZ263615A patent/NZ263615A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-04-26 DK DK94912049T patent/DK0710290T3/da active
- 1994-04-26 EP EP94912049A patent/EP0710290B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-04-26 CA CA002167186A patent/CA2167186C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-04-26 ES ES94912049T patent/ES2125446T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-04-26 US US08/569,200 patent/US5686274A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-04-26 AT AT94912049T patent/ATE175240T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-07-19 CO CO94031529A patent/CO4230201A1/es unknown
- 1994-07-22 ZA ZA945415A patent/ZA945415B/xx unknown
-
1996
- 1996-01-22 FI FI960304A patent/FI112092B/fi active
-
1997
- 1997-07-10 US US08/891,198 patent/US5905034A/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-02-03 GR GR990400365T patent/GR3029285T3/el unknown
-
2003
- 2003-04-01 FI FI20030488A patent/FI112375B/fi active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NZ263615A (en) | 1997-08-22 |
JP2828343B2 (ja) | 1998-11-25 |
JPH08506966A (ja) | 1996-07-30 |
AU674743B2 (en) | 1997-01-09 |
WO1995003419A1 (en) | 1995-02-02 |
EP0710290B1 (en) | 1998-12-30 |
CA2167186A1 (en) | 1995-02-02 |
CO4230201A1 (es) | 1995-10-19 |
DE69415675T2 (de) | 1999-05-20 |
DK0710290T3 (da) | 1999-08-30 |
CA2167186C (en) | 1999-01-26 |
FI112092B (fi) | 2003-10-31 |
FI960304A (fi) | 1996-01-22 |
ATE175240T1 (de) | 1999-01-15 |
US5905034A (en) | 1999-05-18 |
FI20030488A (fi) | 2003-04-01 |
DE69415675D1 (de) | 1999-02-11 |
BR9407141A (pt) | 1996-09-17 |
ZA945415B (en) | 1996-01-22 |
ES2125446T3 (es) | 1999-03-01 |
GR3029285T3 (en) | 1999-05-28 |
FI960304A0 (fi) | 1996-01-22 |
AU6436194A (en) | 1995-02-20 |
US5686274A (en) | 1997-11-11 |
EP0710290A1 (en) | 1996-05-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI112375B (fi) | Avermektiinejä tuottava Streptomyces avermitilis -kanta | |
DE3873845T2 (de) | Antimikrobielles agens, fr 109 615 und seine herstellung. | |
JPH0787796B2 (ja) | A‐21978c誘導体の改良製造法 | |
EP0185456A2 (en) | CL-1577D and CL-1577E antibiotic/antitumor compounds, their production and use | |
US5077201A (en) | Natural blue pigment | |
US3127315A (en) | Hypocholesterolemic agent m- | |
US4440857A (en) | Process for preparing mycarosyltylactone | |
DE3785868T2 (de) | Tierwachstum foerdernde mittel. | |
JP2592468B2 (ja) | 新規抗生物質ベナノマイシンaおよびbならびにその製造法 | |
KR940010304B1 (ko) | 발효법에 의한 d-이소구연산(d-isocitric acid)의 제조방법 | |
JPH03294289A (ja) | 新規抗かび性抗生物質2′―デメチルベナノマイシンaならびにその製造法 | |
FR2459288A1 (fr) | Procede de preparation de la mildiomycine par un micro-organisme du genre streptoverticillium, dans une culture contenant un compose n-methyle | |
US5137826A (en) | Morchella rotunda sp. useful for producing natural blue pigment | |
US3182004A (en) | Production of fungimycin | |
US2965547A (en) | Process for the production of l-6-diazo-5-oxonorleucine | |
US4137405A (en) | Isolation of antibiotic Cephamycin C | |
Nimi et al. | Effect of arginine on gramicidin S biosynthesis by Bacillus brevis | |
US3979433A (en) | 1,6-Di-O-(2-isocyano-3-methylcrotonyl)-D-mannitol compounds | |
JP2594085B2 (ja) | 新規抗腫瘍抗生物質sf2575物質ならびにその製造法 | |
US4696794A (en) | CL-1957D antibiotic compound and its production | |
DE1923885A1 (de) | Antibiotische Substanzen und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
JPH06312997A (ja) | Ko−8119物質及びその製造法 | |
JPH0956389A (ja) | アベルメクチンの精製法 | |
JPH03240791A (ja) | 新規免疫抑制抗生物質m1951―62f2物質およびその製造方法 | |
JPH0137119B2 (fi) |