KR100419554B1

KR100419554B1 - 아버멕틴의 정제방법

Info

Publication number: KR100419554B1
Application number: KR10-1999-0047368A
Authority: KR
Inventors: 류승우; 김종균; 윤기영; 박광영; 이병규; 강희일
Original assignee: 주식회사유한양행
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 1999-10-29
Publication date: 2004-02-19
Also published as: KR20010039119A

Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) KCTC 0662BP 배양액으로부터 역상 흡착수지 또는 용매추출공정 및 결정화 공정을 조합하여 수행하는 아버멕틴 정제방법에 관한 것으로, 아버멕틴 B1a가 80% 이상인 아버멕틴을 고수율로 회수할 수 있는 정제방법이다.

Description

아버멕틴의 정제방법{Process for the purification of Avermectin}

본 발명은 아버멕틴(Avermectin)의 정제방법에 관한 것이다.

아버멕틴은 가축 및 가금류에 심한 경제적 손실을 야기시키는 선충류를 포함한 내부 기생충에 광범위한 구충효과를 갖는 약물로서, 항세균, 항진균 활성은 거의 없으나 광범위한 구충효과로 살충제 및 살비제로 유용하다. 최근에는 농약으로의 사용량이 급증하고 있으며 사람을 대상으로 한 열대병 치료에도 효과가 있는 것으로 보고되고 있다. 아버멕틴은 물에 대한 용해도가 매우 낮고, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등의 알코올류 및 유기 용매에 쉽게 용해되는 것으로 알려져 있다. 특히 톨루엔에 대한 용해도는 300 mg/L로 가장 우수하다.

한편, 아버멕틴은 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomycesavermitilis) 세포내에 존재하는 2차 대사산물로서 8종류 서브타입의 혼합물로 생합성된다. 즉, A1, A2, B1, 및 B2 4종의 주요성분이 각각 a 및 b로 구분되는 8종류의 서브타입의 혼합물 형태로 얻어진다. (화학식 1 및 표1 참조)

아버멕틴	R₁	R₂	X-Y
A1a	CH₃	C₂H₅	CH=CH
A1b	CH₃	CH₃	CH=CH
A2a	CH₃	C₂H₅	CH₂-CH(OH)
A2b	CH₃	CH₃	CH₂-CH(OH)
B1a	H	C₂H₅	CH=CH
B1b	H	CH₃	CH=CH
B2a	H	C₂H₅	CH₂-CH(OH)
B2b	H	CH₃	CH₂-CH(OH)

상기 종래의 균주(미국특허 제4,310,519호 및 제4,429,042호)로부터 생산되는 아버멕틴 서브타입중 약 90% 이상이 a 성분들 즉, A1a, A2a, B1a, 및 B2a 이다.또한, 상기 8종류의 아버멕틴중 생물학적 효과면에서 가장 유용한 것은 아버멕틴 B1a 이며, 동물용 구충제로서의 아버멕틴 생성물은 상대적으로 소량인 B1b가 함께 얻어지는 아버멕틴 B1a로 구성된다.

상기에서 설명한 바와 같이, 아버멕틴은 스트렙토마이세스 아버미틸리스의 배양액으로부터 얻어지며(미국특허 제4,310,519호 및 제4,429,042호), 이외에 다양한 변이주가 개발된 바 있으며, 본 발명자들은 특정의 스트렙토마이세스 아버미틸리스 변이주가 배양액중의 아버멕틴 B1a 성분 비율이 40% 이상인 고역가의 아버멕틴을 생산한다는 것을 발견하여 동일자로 특허출원을 완료하였다.

한편, 아버멕틴 생산균주의 배양액으로부터 아버멕틴 B1a 성분비율이 높은 아버멕틴을 정제하기 위한 종래의 방법은 미국특허 제4,310,519호에 개시된 바와 같다. 즉, 아버멕틴의 아세톤 추출액을 농축하여 pH를 4.7로 조정하고 메틸렌클로라이드로 아버멕틴을 추출한 다음 농축하였다. 농축액에 메탄올을 넣고 밤새 방치한 후 에틸렌글리콜과 헵탄을 넣고 교반한 후 층분리를 하여 헵탄층을 버리고 에틸렌글리콜과 메탄올 용액에 무기염 수용액을 넣었다. 이 용액에 에틸에테르를 넣고 교반하여 아버멕틴을 추출하고 추출액은 진공에서 농축하였다. 이 농축액을 메틸렌클로라이드에 용해하고 알루미나와 활성탄이 충진된 컬럼크로마토그래피를 수행하고, 메틸렌클로라이드와 이소프로판올의 용출액중에서 활성분획을 감압농축하였다. 이 농축액은 메틸렌클로라이드, 헥산, 및 메탄올이 10:10:1로 혼합된 혼합용매로 세파덱스 LH-20(Sephadex LH-20) 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 아버멕틴 A와 B를 분리하고, 아버멕틴 B분획은 메탄올과 에틸렌글리콜의 혼합용매로 2회 결정화하여 아버멕틴 B1을 얻었다. 회수된 아버멕틴 B1은 헥산, 톨루엔, 메탄올의 혼합 용매로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 B1a와 B1b 성분을 분리하였다.

또한, 미국특허 제5,077,398호에서는 아버멕틴 B1 및 B2 혼합물로부터 아버멕틴을 제조하는 방법을 개시한 바 있다. 즉, 배양액의 pH를 2.5-6.0 으로 조정하고 비-수혼화성 용매(클로로벤젠, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올, 클로로톨루엔 등)로 아버멕틴을 추출한 다음, 발효기름(소포제와 지질)과 용매가 50:50의 부피비로 혼합되게 농축한 다음, 얻어진 농축액을 활성탄으로 처리한 후 여과하여 세포파쇄물을 제거한다. 잔류용매를 증기로 증류하여 제거하여 고온기름(hot oil)을 얻는다. 여기에는 아버메틴 B1이 100-150 g/L로 존재하고 B2가 70-105 g/L로 존재한다. 결정화 방법으로서 상기에서 얻어진 고온기름을 헥산, 헵탄, 벤젠, 톨루엔 등과 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 부탄올등의 혼합용매에 넣고 결정화 씨앗(seed)을 넣어 밤새 방치하고 여과하여 아버멕틴 B1 결정을 회수한다. 이때 회수율은 81.4%이다.

그러나, 미국특허 제4,310,519호에 따른 정제방법은 정제공정이 매우 복잡할 뿐 아니라, 실리카겔, 알루미나 및 활성탄을 이용한 컬럼 크로마토 그래피를 수행함으로써 많은 용매를 사용하게 되고, 이에 따라 정제비용의 증가와 작업시간이 길다는 문제점이 있다. 또한, 아버멕틴 서브타입중 활성성분인 아버멕틴 B1a를 얻기 위하여 세파덱스(Sephadex LH-20) 컬럼 크로마토그래피 공정을 수행하여야 하기 때문에 제조비용이 많이 소요된다는 문제점이 있다.

또한, 미국특허 제5,077,398호에 따른 정제방법은 아버멕틴 B1과 B2의 혼합물에서 B1을 회수하는 방법으로서 다른 아버멕틴 서브타입 즉, 아버멕틴 A1, A2가 함께 존재할 경우 B1의 회수율은 더욱 낮아지게 되는 문제점이 있고, 활성탄을 처리하는 공정을 수행하여야 하며, 고온의 유체를 결정화용매에 넣은 후 결정화 씨앗을 넣어 결정을 얻어야 하므로 제조공정이 복잡하다는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 아버멕틴 생산균주의 배양액으로부터의 정제공정을 간소화하고 용매의 사용을 줄이며 아버멕틴 B1a의 회수율이 높은 정제방법을 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) KCTC 0662BP 배양액으로부터 역상 흡착수지 또는 용매추출공정 및 결정화 공정을 조합하여 수행하였을 때, 아버멕틴 B1a가 80% 이상인 아버멕틴을 고수율로 회수할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 간단하고 경제적이며 고수율로 아버멕틴을 정제하기 위한 아버멕틴 정제방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도1은 흡착 크로마토그래피를 통과시켜 분획별로 얻은 아버멕틴 성분의 고속 액체 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 것이다.

도2는 본 발명의 정제방법에 따라 정제된 아버멕틴 B1a, B1b를 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 스트렙토마이세스 아버미틸리스(Streptomyces avermitilis) KCTC 0662BP 배양액으로부터 회수한 세포를 수혼화성(water-miscible) 유기용매로 추출하여 아버멕틴 추출액을 얻는 공정;

① 얻어진 아버멕틴 추출액에 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸 아세테이트, 톨루엔, 부탄올, 및 이소부탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 비극성 용매를 가하고 농축하거나, 또는 ② 얻어진 아버멕틴 추출액을 흡착 컬럼크로마토그래를 통과시키켜 얻은 아버멕틴 용출액으로부터 분리한 아버멕틴 B1a 분획을 농축하여 아버멕틴 농축액을 얻는 공정; 및

얻어진 아버멕틴 농축액에 헥산, 헵탄, 펜탄, 벤젠, 및 톨루엔으로 이루어진 군으로부터 선택된 탄화수소 용매 및 C₁∼C₄저급알콜의 혼합용매를 가하여 아버멕틴 결정을 얻는 공정을 포함하는 아버멕틴의 정제방법에 관한 것이다

본 발명에 따른 제조방법에서 사용되는 아버멕틴을 생산하는 균주는 1999년 9월 28일자로 생명공학연구소 유전자원센터 유전자은행에 기탁번호 KCTC 0662BP로 기탁된 스트렙토마이세스 아버미틸리스 (Streptomyces avermitilis) 변이주이다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 아버멕틴 추출액을 얻는 공정에서 사용되는 수혼화성 유기용매는 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, 에탄올, 및 이소프로필알콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 이중 아버멕틴에 대한 용해도가 높고 및 용매의 가격이 저가인 아세톤 또는 메탄올이 바람직하다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 아버멕틴 추출액으로부터 비극성 용매를 가하고 농축하여 아버멕틴 농축액을 얻는 공정에서 비극성 용매로는 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸 아세테이트, 톨루엔, 부탄올, 또는 이소부탄올을 사용할 수 있으며, 이중 인체에 미치는 독성이 적고, 쉽게 농축이 가능한 에틸 아세테이트가 더욱 바람직하다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 흡착 컬럼크로마토그래피를 수행하여 아버멕틴 농축액을 제조하는 경우, 흡착 컬럼크로마토그래피에 충진되는 흡착수지는 역상 흡착수지로서 스티렌 및 디비닐벤젠의 공중합체, 디비닐벤젠 중합체, 또는 스티렌 중합체를 사용할 수 있으며, 구체적으로는 앰버라이트(Amberlite) XAD-2000^(TM)(롬앤드하스사, 프랑스), 앰버라이트 XAD-4^(TM)(롬앤드하스사, 프랑스), 앰버라이트 XAD-8^(TM)(롬앤드하스사, 프랑스), 다이아이온(Diaion) HP-20^(TM)(미쓰비시가세이사, 일본), 다이아이온 SP-207^(TM)(미쓰비시가세이사, 일본), 다이아이온 HP-20SS^(TM)(미쓰비시가세이사, 일본), 또는 다이아이온 SP-207SS^(TM)(미쓰비시가세이사, 일본) 을 사용할 수 있고, 이중 아버멕틴 흡착능이 우수하고 저가인 앰버라이트 XAD-2000^(TM)(롬앤드하스사, 프랑스)이 바람직하다. 추출액은 상기 역상 흡착수지로 충진된 컬럼을 통과시켜 아버멕틴을 흡착시키고 극성이 낮은 용매 또는 수용액으로 아버멕틴을 용출시켜 용출액을 얻는다.

상기와 같이 에틸아세테이트를 사용하거나 흡착 컬럼크로마토그래피를 수행하여 아버멕틴 농축액을 얻는 공정에 의하여 아버멕틴과 함께 추출된 세포내 성분들이 상당량 제거되게 된다.

또한, 본 발명에 따른 제조방법은 아버멕틴 농축액을 헥산, 펜탄, 벤젠, 및 톨루엔헥산으로 구성된 군으로부터 선택된 탄화수소 용매 및 C₁∼C₄저급알콜의 혼합용매를 사용하여 아버멕틴 결정을 얻는 공정을 포함하며, 이 공정은 2회 내지 5회 반복하는 것이 바람직하다. 또한 결정화 용매로 사용되는 혼합용매의 탄화수소 용매와 C₁∼C₄저급알콜의 중량비는 세포파쇄물 제거 및 아버멕틴 B1 성분의 용해도를 고려할 때 1∼10 : 1 이 바람직하고, 이중 아버멕틴 B1 성분의 용해도에 따른 회수율을 높이기 위해서는 중량비가 3∼6 : 1 인 헥산과 메탄올의 혼합용매가 더욱 바람직하다. 또한, 결정화 공정은 초기에 40∼80℃로 가열한 다음, 다시 10∼30℃ 로 유지하여 수행하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이것이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

참조예. 아버멕틴 배양액의 제조

스트렙토마이세스 아버미틸리스(Streptomyces avermitilis) KCTC 0662BP의 포자가 형성된 한천배지로부터 포자농도를 5 X 10⁶포자/ml 이 되도록 다음과 같은 종균배양용 배지 50 ml을 넣은 250 ml 플라스크에 접종하였다.

포도당 20 g/L

대두분 15 g/L

낙화생분 5 g/L

효모추출물 3 g/L

탄산칼슘 1 g/L

황산마그네슘 10 mg/L

황산아연 10 mg/L

대두유 3 g/L

증류수 1000 ml

pH 멸균후 7.0

상기 플라스크를 28 ℃ 회전진탕기에서 220rpm으로 48시간 배양한 후, 다음과 같은 아버멕틴 생성용 배지 4L가 들어있는 7L 발효조에 60ml를 접종하였다.

포도당 100 g/L

대두분 20 g/L

면실분 5 g/L

효모추출물 3 g/L

인산칼륨 1 g/L

황산아연 10 mg/L

황산마그네슘 100 mg/L

황산철 10 mg/L

염화코발트 10 mg/L

대두유 5 g/L

비타민 B1 100 mg/L

증류수 1000 ml

pH 멸균전 7.6

상기 발효조를 28 ℃ 250rpm, 1VVM의 공기를 공급하여 11일간 배양하여 아버멕틴 배양액(30L)을 제조하였다.

실시예 1

참조예 1에서 얻은 배양액 20L을 여과하여 회수한 세포에 메탄올 10L을 넣고 5시간 동안 교반하여 아버멕틴을 추출하였다. 추출액을 여과하여 세포 성분을 제거하고 여액을 XAD-2000을 80% 메탄올로 평형시킨 컬럼(수지 및 80% 메탄올 총부피는 1.2L)에 시간당 2 수지부피의 유속으로 흘려주었다. 여액을 모두 흘려준 다음 80% 메탄올 1.2L를 다시 흘려주어 수지를 세척한 후, 95% 메탄올 6L을 흘려주어 수지에 흡착되어 있는 아버멕틴을 용출시켰다. 얻어진 아버멕틴 용출액은 25 ml씩 분취하였고 각각의 분획은 고압 액체 크로마토 그래피로 분석한 결과는 도1과 같다. 도1의 결과에 근거하여 아버멕틴 B1a 성분을 포함하는 분획을 모두 혼합하여 감압하에서 농축하여 아버멕틴 농축액을 얻었다. 상기에서 고속 액체 크로마토그래피의 조건은 다음과 같다.

장치 ; 히타치(HITACHI) 모델 L-7100, 7200, 7300, 7400, D-7500

컬럼 ; 코스모실(COSMOSIL) 5C18-AR-II, 4.6 X 250 mm

이동상 ; 아세토니트릴:메탄올:증류수(750:50:200)

유속 ; 분당 1ml

주입량 ; 10 ㎕

아버멕틴 B1a 10g을 포함하는 농축액에 헥산 43 ml과 에탄올 7ml을 넣고 50 ℃에서 2시간 교반하고 온도를 20 ℃로 낮춰 다시 2시간 교반하여 형성된 결정을 여과하여 아버멕틴 8.5g (회수율: 85%, B1a함량: 81%)를 회수하였다. 회수된 아버멕틴 결정을 다시 동일 방법으로 재결정하여 아버멕틴 8.1g (회수율: 81%, B1a함량: 90%)를 제조하였다.

실시예 2

참조예 1에서 얻은 배양액 10L를 여과하여 회수한 세포에 아세톤 2L를 넣고 2시간 교반하였다. 에틸아세테이트 2리터를 다시 넣고 4시간 동안 교반한 다음, 에틸아세테이트 층을 분리하여 감압하에서 농축하였다. 아버멕틴 B1a 10g을 포함하는 농축액에 핵산 85ml과 에탄올 15ml을 넣고 50℃에서 2시간 교반하고, 다시 20 ℃에서 2 시간 동안 교반하여 아버멕틴 결정을 형성시킨 후 이를 여과하여 9.4g의 아버멕틴을 회수하였다(회수율: 94%, B1a함량: 82%). 회수된 결정은 다시 동일한 방법으로 재결정하여 분리 정제된 아버멕틴 9.1 g을 얻었으며(회수율:91%, B1a함량: 93%), B1a성분 및 B1b성분의 HPLC 분석결과는 도2와 같다.

상기와 같이 본 발명의 정제공정을 수행하여 아버멕틴을 정제할 경우, 아버멕틴 A1, A2, B1, 및 B2가 포함된 배양액으로부터 아버멕틴 B1a의 함량이 80 % 이상인 아버멕틴을 간단하고 높은 수율로 정제할 수 있다.

Claims

스트렙토마이세스 아버미틸리스(Streptomyces avermitilis) KCTC 0662BP 배양액으로부터 회수한 세포를 수혼화성(water-miscible) 유기용매로 추출하여 아버멕틴 추출액을 얻는 공정;

① 얻어진 아버멕틴 추출액에 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸 아세테이트, 톨루엔, 부탄올, 및 이소부탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 비극성 용매를 가하고 농축하거나, 또는 ② 얻어진 아버멕틴 추출액을 흡착 컬럼크로마토그래를 통과시키켜 얻은 아버멕틴 용출액으로부터 분리한 아버멕틴 B1a 분획을 농축하여 아버멕틴 농축액을 얻는 공정; 및

얻어진 아버멕틴 농축액에 헥산, 헵탄, 펜탄, 벤젠, 및 톨루엔으로 이루어진 군으로부터 선택된 탄화수소 용매 및 C₁∼C₄저급알콜의 혼합용매를 가하여 아버멕틴 결정을 얻는 공정을 포함하는 아버멕틴의 정제방법
제1항에 있어서, 아버멕틴 추출액을 얻는 공정에서 사용되는 수혼화성 유기용매가 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, 에탄올, 및 이소프로필알콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 아버멕틴의 정제방법.
제1항에 있어서, 아버멕틴 농축액을 얻는 공정에서 가하는 비극성 용매가 에틸 아세테이트임을 특징으로 하는 아버멕틴의 정제방법.
제1항에 있어서, 흡착 컬럼크로마토그래피에 충진되는 흡착수지가 스티렌 및 디비닐벤젠의 공중합체, 디비닐벤젠 중합체, 또는 스티렌 중합체임을 특징으로 하는 아버멕틴의 정제방법.
제1항에 있어서, 아버멕틴 결정을 얻는 공정을 2회 내지 5회 반복하는 것을 특징으로 하는 아버멕틴의 정제방법.
제1항에 있어서, 결정화 용매로 사용되는 혼합용매의 탄화수소 용매와 C₁∼C₄저급알콜의 중량비가 1∼10 : 1임을 특징으로 하는 아버멕틴의 정제방법.
제6항에 있어서, 결정화 용매가 중량비 3∼6 : 1 인 헥산과 메탄올의 혼합용매임을 특징으로 하는 아버멕틴의 정제방법.