JPH03103186A

JPH03103186A - 醗酵法によるエバーメクチンＡ１ａ、Ａ２ａ、Ｂ１ａおよびＢ２ａの製造法およびストレプトミセス・アベルミチルスに属する新菌株

Info

Publication number: JPH03103186A
Application number: JP23824789A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Omura; 智大村; Haruo Ikeda; 治生池田
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 1989-09-13
Filing date: 1989-09-13
Publication date: 1991-04-30
Anticipated expiration: 2014-05-31
Also published as: JP2897834B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はイソロイシン代謝拮抗物質耐性を示し、エバー
メクチン生産能を有するストレプト呉セス属に属する微
生物を用いるエバーメクチンＡ１ａ．．Ａ２ａ、Ｂ１ａ
および／またはＢ２ａの製造法に関する。

〔従来の技術〕

エバーメクチンは８種の戒分が存在し、そのうちＢ１ａ
を多く含む戒分を水素添加した２２．２３ジヒドロエバ
ーメクチン（イバーメクチン〉が駆虫剤として医薬品産
業などの分野に利用されている。

従来、エバーメクチンの製造法としては、ストレプトミ
セス・アベル果チルスを、責化し得る窒素源、炭素源、
無機塩を含有する水性培地中、好気的条件下で培養し、
当該培養物を有機溶剤で抽出し、エバーメクチンＡ１ａ
，Ａｌｂ．．Ａ，！ａ，Ａ２ｂｓ　Ｂ１ａ，ＢｌｂＳＢ
２ａおよびＢ２ｂを得る方法が知られていた。そして、
得られたこれら８種の戒分を分離精製し、Ｂ１ａを多く
含む両分を得た後、これを水素添加し、２２．２３−ジ
ヒドロエバーメクチンが医薬品として利用されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来のエバーメクチンの製造法においては、上記８種の
成分の混合物として得られるため、８種のエバーメクチ
ンの威分の中で最も有効なＢ１ａ戊分を収率良く安価に
製造する方法が求められていた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者はエバーメクチンＢ１ａを収率よく安価に製造
するためにより優れたエバーメクチン生産菌の育種研究
を行った。その結果、イソロイシン代謝拮抗物質に耐性
を示したエバーメクチン生産菌を用いると収率よくエバ
ーメクチンＢ１ａを含むエバーメクチンａ或分を得るこ
とを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明はストレプトミセス属に属し、イソロイシ
ン代謝拮抗物質に耐性を示し、かつエバーメクチン生産
能を有する微生物を培地で培養し、培養物中にエバーメ
クチンＡ　１　ａ　，Ａ　２　ａ　％　Ｂ　１　ａおよ
び／またはＢ２ａを生産蓄積させ、当該培養物よりエバ
ーメクチンＡｌ　ａ，Ａ２ａ，Ｂ　１　ａおよび／また
はＢ２ａを採取することを特徴とするエバーメクチンＡ
　１　ａ　％　Ａ　２　ａ　ＸＢ　１　ａおよび／また
はＢ２ａの製造法を提供するものである。また、本発明
はストレプトミセス・アベルミチリス属に属し、イソロ
イシン代謝拮抗物質に耐性を示し、かつエバーメクチン
生産能を有する菌株を提供するものである。

本発明のごとく、エバーメクチンを生産するストレプト
ミセス属に属する微生物にイソロイシン代謝拮抗物質に
対する耐性を付与することによってエバーメクチンの特
定成分を収率よく蓄積せしめた報告は未だ知られていな
い。

本発明で用いられる微生物はストレプトξセス属に属し
、イソロイシン代謝拮抗物質に耐性を有する微生物であ
る。イソロイシン代謝拮抗物質とはストレプトミセス属
に属する微生物の１）生育を阻害し、その生育がＬ−イ
ソロイシンの添加により回復する物質、または２）　Ｉ
、一イソロイシン生合或系の酵素の抑制作用および阻害
作用を示す物質のことである。

このようなイソロイシン代謝拮抗物質としては、例えば
イソロイシンハイドロキサメート、チアイソロイシン、
Ｏ−メチルスレオニン、α−アミノ酪酸、α−アξノー
β−ヒドロキシ吉草酸、β−メチルスレオニンなどが挙
げられる。

上述したようなイソロイシン代謝拮抗物質耐性としての
性質を有していれば、他の要求性あるいは他の薬剤抵抗
性などの性質を持つものでも、本発明において使用可能
であり、したがって、本発明の範囲に含まれる。

本発明で用いられる微生物の代表的なものとしては、例
えばストレブトミセス・アベルξチリスＫ２０２１が挙
げられる。この菌株はストレプト旦セス・アベルξチリ
スＡＴＣＣ３　１　２　７　１から誘導されたものでイ
ソロイシン代謝拮抗物質のうち○−メチルスレオニンに
耐性を有する変異株である。

なお、この変異株はストレプトミセス・アベルミチリス
Ｋ２０２１として工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されている（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０９９１）。このよ
うにして得られるＯ−メチルスレオニンに耐性を有する
変異株のＯ−メチルスレオニンに対する耐性度は以下の
通りである。

○−メチルスレオニン　　　の第１表に示す菌株の胞子懸濁液を実施例１の○ーメチル
スレオニン耐性株の分離で示した完全合成培地に○−メ
チルスレオニンを各々０、０．２、０．４、０．８、１
．６ｇ／７！を含む培地に塗布し、３０℃で３日間培養
し、菌株の生育を調べた。その結果は第１表に示すとお
りである。本発明で使用する○−メチルスレオニン耐性
株（Ｋ２０２１）では親株のストレプトξセス・アベル
ミチリスＡＴＣＣ３１２７１と比較して、０−メチルス
レオニンによって生育が阻害されず、Ｏ−メチルスレオ
ニンに対する耐性を獲得していることが明らかである。

第」≦友ウム０．５％、α−ア旦ノ酪酸０．１％、ｐＨ７．０）
に接種し、３０℃で４８時間振とう培養し、培養液中に
蓄積したＬ−イソロイシンを定量した。その結果は第２
表に示す通りである。本発明で使用する０−メチルスレ
オニン耐性株（Ｋ２０２１）では親株のストレプトミセ
ス・アベルミチリスＡＴＣＣ３ｌ２７１と比較して有意
にＬ−イソロイシンを蓄積することが明らかである。

Ｏ−メチルスレオニン耐性株のＬ−イソロイシン第２表
に示す各菌株の胞子懸濁液を１０ｍｌの７培地（グルコ
ース３％、塩化ナトリウム０．２％、リン酸二カリウム
０．０５％、硫酸第１鉄７水和物０００５％、硫酸亜鉛
７水和物０．００５％、硫酸マンガン４水和物０．００
５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０１％、硫安０．
１５％、炭酸カルシ変異の誘導は、通常の変異処理によ
って比較的容易に行うことができる。すなわち、イソロ
イシン代謝拮抗物質に耐性を有する変異株を得るには、
親株を紫外線照射するかあるいは変異誘発剤、例えばＮ
−メチルーＮ゜　−ニトローＮ−二トロソグアニジン、
エチルメタンスルホン酸等で処理した後、親株が充分に
生育できないような量のイソロイシン代謝拮抗物質を含
む培地で、親株に比べて有意に生育良好な菌株を取得す
ればよい。

本発明のエバーメクチンＡ　１　ａ　．．　Ａ　２　ａ
　％　Ｂ　１　ａおよび／またはＢ２ａの製造において
は、先ず、上記のイソロイシン代謝拮抗物質に耐性を有
する変異株が適当な培地に培養される。本発明における
エバーメクチンＡ　１　ａ　．．Ａ　２　ａ　．．　Ｂ
　１　ａおよび／またはＢ２ａ生産用の培地は炭素源、
窒素源、無機塩を含有する通常の水性培地である。炭素
源としては、グルコース、サソカロース、マルトース、
ラクトース、デキストリン、澱粉、糖蜜などが、窒素源
としてはカゼイン氷解物、酵母抽出物、酵母自己消化物
、酵母加水分解物、大豆粉、コーンスチープリカーディ
スティラーソルプル、綿実粉、肉エキスなどが、無機塩
としてはナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモ
ニウム、カルシウム、マンガン、亜鉛、鉄、コバルト、
リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物、炭酸塩等のイオン
を放出しうる通常の塩が挙げられる。

培養は好気的条件下で行われる。培養の間、培地のｐＨ
は５〜９に、温度は２５〜３５℃に調節され、１２０〜
１９２時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結果が
得られる。

上記の培養において、エバーメクチンＢ１ａを採取する
ことが目的であるならば、培地中に少なくともエバーメ
クチンＢ１ａが生戊蓄積されるようエバーメクチン生産
菌株を培養すべきである。

培養物よりエバーメクチンＡ１ａ，Ａ２ａ、Ｂ１ａおよ
び／またはＢ２ａを採取するには抗生物質を採取する通
常の方法を用いることができる。例えば、培養濾液を除
去した菌体をアセトン、メタノールなどのような有機溶
媒で抽出し、エバーメクチンを含む戒分を抽出し、残渣
を除去後クロロホルムの如き有機溶媒でで抽出する。ク
ロロホルム層を集め、減圧濃縮しエバーメクチンＡ　１
　ａ　％　Ａ　２　ａ　％　Ｂ　１　ａおよび／または
Ｂ２ａを得ることができる。更にエバーメクチンＢ１ａ
を採取するには、得られた濃縮物をイオン交換樹脂、シ
リカゲル、逆相シリカゲル、セファデックス等を用いる
カラムクロマトグラフイー、向流分配等の方法により戒
分を分離採取することができる。例えばエバーメクチン
Ｂ１ａを含む混合物をメタノールに溶し、分取用高速液
体クロマトグラフイー（逆相シリカゲル、ＯＤＳ）を用
い、移動相として８０％Ｖ　／　Ｖメタノール／水でエ
バーメクチンＢ１ａを溶出させる。得られた溶出液は減
圧濃縮して、メタノールから再結晶してエバーメクチン
Ｂ１ａを純粋な型で得ることができる。

以下本発明の実施例を具体的に説明する。

ストレプトミセス・アベルミチリスＡＴＣＣ３１２７１
の胞子を常法によりＮ−メチルーＮ゜　−ニトロ一Ｎ−
ニトロソグアニジン処理（ｌｍｇ／ｍ６、１）Ｈ９．Ｏ
で３０℃、６０分）した後、この胞子をＯ−メチル一〇
，Ｌ−スレオニン０．８ｇ／Ｉ！を添加した寒天培地（
グルコース１％、硫安０．０２％、リン酸二カリウム０
．０５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％、硫酸
第一鉄７水和物０．０００１％、寒天１．５％を含む完
全合成培地）に塗布した。次に３０℃にて３〜５日間培
養し、生じた大きなコロニーを釣菌分離し、０−メチル
スレオニン耐性株（ストレブトミセス・アベルミチリス
Ｋ２０２１）を取得した。

実益斑−１第３表に示す各々の菌株の胞子懸濁液を１　０ｍ／の種
培地（ラクトース２％、ディスティラーズソルブル１．
５％、酵母自己消化物０．５％、ｐ　Ｈ　７　．０）を
含む５　０ｍｊ！容大型試験管に移植し、３０℃で４８
時間振とうして前培養した後、その０．２ｍｌを下記の
組成の主醗酵培地ｌ　Ｑｍ７！を含む１００ｍｌ容エル
レンマイヤフラスコに移植し、２８゜Ｃで２１０ｒｐｍ
，振幅２．５ｃｍの条件下で１６８時間培養した。

瀉１Ｕ色地−」一グルコース　　　　　　　　　　４．・５％ペプトン化
牛乳　　　　　　　　２．４％酵母自己消化物　　　　
　　　　０．２５％ポリプロピレングリコール＃２，０００　　　　　　　　　　０．２５％ｐ　Ｈ　
７　．　　０　（　Ｋ　Ｏ　Ｔ４　Ｔ：調製）醗Ｂ土ロ
しーｉグルコース　　　　　　　　　　３．０％塩化ナトリウ
ム　　　　　　　　０．２％リン酸二カリウム　　　　
　　　０．０５％硫酸第■鉄７水和物　　　　　　０．
００５％硫酸亜鉛７水和物　　　　　　　０．００５％
硫酸マンガン４水和４’７１　　　　　　０．００５％
硫酸マグネシウム７水和物　　　０．０１％硫酸アンモ
ニウム　　　　　　　０．１５％炭酸カルシウム　　　
　　　　　０．５％ｐＨ７．０　（ＫＯＨで調製）培養終了後、ｌＱｍ７！のメタノールを加え、充分攪拌
し培養物を抽出した。菌体残渣を遠心除去後、抽出物中
のエバーメクチンを高速液体クロマトグラフイー（ＯＤ
’３　　３μｍ，カラムサイズ　６φｍｍＸ７５ｍｍ，
流速１　ｍ　ｌ！　／　ｍ　１　ｎ、移動相８０％Ｖ／
Ｖメタノール／水、検出２４６ｎｍ）で分析した。エバ
ーメクチン各成分の定量はエバーメクチンＢ１ａの標品
を用いて行った。その結果は第３表に示すとおりである
。

親株のス１・レプトミセス・アベルミチリスＡＴＣＣ３
１２７１は８種の戊分のエバーメクチンを生産したが、
本発明で使用したＯ−メチルスレオニン耐性株（Ｋ２０
２１）は８種の成分のうちの有効戒分であるＢ１ａを含
む４種の威分を生産した。またエバーメクチンＢ１ａの
蓄積濃度も顕著に向上していることが明らかである。

災施皿−１エルレンマイヤフラスコ１０本で培養したストレプトミ
セス・アベルミチリスＫ２０２１の培養液（１　０　Ｑ
ｍｊ！）より菌体を分取し、５　Ｑ　ｍ　ｅのメタノー
ルを加え充分攪拌し抽出した。遠心分離により菌体残渣
を除きさらに５　０ｍ＋２のクロロホルムを加え抽出し
た。クロロホルム相を分取した後、減圧乾固し２５ｍＡ
’の酢酸エチルに溶解し、無水硫酸ナトリウム２ｇを加
え脱水した。酢酸エチル溶液を１０ｇシリカゲルを充填
したカラムに通搭し、さらに５０ｍｌの酢酸エチルを流
した。通過液を集め、減圧乾固し粘張な油状物質０．４
ｇが得られる。この０．４ｇを８枚の分取用シリカゲル
プレートにのせｌ５％Ｖ　／　Ｖイソプロパノール／ヘ
キサンで２回展開する。エバーメクチンＢ１ａに相当す
る部分を削り取り、３０％Ｖ　／　Ｖメタノーノレ／ク
ロロホノレムで？容出し、溶出液をＩｇの活性炭を充填
したカラムに通搭しさらに１　０ｍｌのクロロホルムを
流した。得られた溶出液を減圧乾固し白色粉末１０ｍｇ
が得られる。高速液体クロマトグラフイーによる分析結
果より、得られた白色粉末は９０％以上のエバーメクチ
ンＢ１ａを含んでいた。

この白色粉末の理化学的性状を調べたところ、ＪＡｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３．４２１６−４２２１記載の
エバーメクチンＢ１ａの性状と一致した。

〔発明の効果〕

本発明の方法によれば、エハーメクチンａ成分のみを得
ることができ、さらにはエバーメクチンの有効成分Ｂ１
ａの蓄積量および収率が向上し、より安価なエハーメク
チンＢ１ａの生産が可能になった。

■．事件の表示平成　１　年特許願　第２３８２４７号２．発明の名称エバーメクチンＡ１ａＸＡ２ａ、Ｂ１ａおよび／または
Ｂ２ａの製造法およびストレプトミセス・アベルミチリ
ス属に属する新菌株３．補正をする者事件との関係　特許出願人住所　東京都港区白金５−９−１名称　北里研究所（秘１ヨ３板丸冫代表者　水之江　公英４　代理人　〒１７０東京都豊島区北大塚２−２５−１太陽生命大塚ビル３階　電話（９１７）１９１７５．補
正命令の日付起案日　平或ｌ年ｌ２月Ｉｌ日発送日　平或ｌ年１２月２６日６．補正の対象（１）発明の名称を正確に記載した適正な願書を提出し
ます。

（２）明細書の発明の名称の欄（３）明細書の発明の詳細な説明の欄７．補正の内容（１）明細書の発明の名称を「エバーメクチンＡｌ　ａ，Ａ２ａ，Ｂｌ　ａおよび／
またはＢ２ａの製造法およびストレプトミセス・アベル
ミチリス属に属する新菌株」と訂正する。

（２）明細書第２ページ上から８行目ＦＢ２ａの製造法
に関す」とあるをｒＢ２ａの製造法およびス１・レプト
ミセス・アベルミチリス属に属する新菌・株に関す」と
訂正する。

（３）明細書第１０ページ下から３行目「有ａ溶媒でで
」とあるを「有機溶媒でｊと訂正する。

−６４

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ストレプトミセス属に属し、イソロイシン代謝拮
抗物質に耐性を示し、かつエバーメクチン生産能を有す
る微生物を培地で培養し、培養物中にエバーメクチンＡ
１ａ、Ａ２ａ、Ｂ１ａおよび／またはＢ２ａを生産蓄積
させ、当該培養物よりエバーメクチンＡ１ａ、Ａ２ａ、
Ｂ１ａおよび／またはＢ２ａを採取することを特徴とす
るエバーメクチンＡ１ａ、Ａ２ａ、Ｂ１ａおよび／また
はＢ２ａの製造法。
（２）ストレプトミセス属に属し、イソロイシン代謝拮
抗物質に耐性を示し、かつエバーメクチン生産能を有す
る微生物を培地に培養して培養物中に少なくともＢ１ａ
を生成蓄積させ、当該培養物よりエバーメクチンＢ１ａ
を採取することを特徴とするエバーメクチンＢ１ａの製
造法。
（３）ストレプトミセス・アベルミチリス属に属し、イ
ソロイシン代謝拮抗物質に耐性を示し、かつエバーメク
チン生産能を有する菌株。