JPH03254678A - エバーメクチンの特定成分を選択生産するための微生物およびその選択的製造法 - Google Patents

エバーメクチンの特定成分を選択生産するための微生物およびその選択的製造法

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JPH03254678A
JPH03254678A JP2053411A JP5341190A JPH03254678A JP H03254678 A JPH03254678 A JP H03254678A JP 2053411 A JP2053411 A JP 2053411A JP 5341190 A JP5341190 A JP 5341190A JP H03254678 A JPH03254678 A JP H03254678A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はイソロイシンあるいはそのケト酸（３−メチル
−２−オキソ吉草酸）を効率よくエノ＼−メクチン骨格
に取り込み、バリンあるいはそのケト酸（２−オキソイ
ソ吉草酸）のエバーメクチン骨格への取り込みが著しく
低下した、エバーメクチンａ成分のみを蓄積するストレ
プトミセス属に属する微生物、さらに同性質を有し、エ
バーメクチンＢＯ−メチルトランスフェラーゼ活性を欠
くストレプトミセス属に属する微生物を用いる、エバー
メクチン特定成分の選択的製造法に関する。
〔従来の技術〕
エバーメクチンはストレプトミセス・アベルミチルスよ
り生産される駆虫活性を有する抗生物質である。本菌株
の培養物中にはエバーメクチンの８種の成分が存在する
（米国特許第４３１０５１９号）。”Ａ”および”Ｂ”
の成分はそれぞれ５位の置換基がメトキシまたは水酸基
である。”１”は２２．２３位に２重結合が存在し、２
″は２２位に水素、２３位に水酸基を有する。　ａ系の
化合物は２５位の置換基が５ｅｃ−ブチル基であり、”
ｂ”系の化合物は２５位の置換基がイソプロピル基であ
る。これらの内、Ｂ１分画を分離精製した後、そのもの
を水素添加した、２２゜２３−ジヒドロエバーメクチン
Ｂｌ（イバーメクチン）が駆虫剤として医薬品業界など
の分野に利用されている。
従来、エバーメクチンの製造法として、ストレプトミセ
ス・アベルミチリスを責化し得る窒素源、炭素源、無機
塩を含有する培地中、好気的条件下で培養すると、エバ
ーメクチンＡ１ａ、Ａｌｂ、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ｂ１ａ、
Ｂｉｂ、Ｂ２ａおよびＢ２ｂの構造的に類似する８種の
成分が生産される。当該培養物を有機溶剤で抽出し、ａ
成分とｂ成分との分離が容易でないため、得られたエバ
ーメクチン混合物をさらにＡＩ、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２の４
つの分画に分離・精製してＢ１分画（Ｂ１ａとＢｉｂを
含む〉を得た後、これを水素添加した、２２．２３−ジ
ヒドロエバーメクチンＢｌを医薬品として利用すること
が知られていた。
〔発明が解決しようとする課題〕
このように従来のエバーメクチンの製造法は、上記８種
の成分が混合物として得られること、さらに工業生産上
ａ成分とｂ成分との分離が困難なことにより、８種のエ
バーメクチンの成分の中でも特に有効なり１ａ戒成分収
率よく安価に製造する方法が強く求められていた。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者らは直接醗酵法によりエバーメクチンＢ１ａを
収率よく安価に製造するためにより優れたエバメクチン
生産菌の育種研究を行った。その結果、イソロイシンあ
るいはそのケト酸（３−メチル−２−オキソ吉草酸〉を
効率よくエバーメクチン骨格に取り込み、バリンあるい
はそのケト酸（２−オキソイソ吉草酸）のエバーメクチ
ン骨格への取り込みが著しく低下した、エバーメクチン
ａ成分のみを蓄積する菌株にエバーメクチンＢＯ−メチ
ルトランスフェラーゼ活性の欠損を付与した菌株を用い
ると収率よくエバーメクチンＢ１ａ、Ｂ２ａ威分を得る
ことを見出し、本発明を完成した。なお、Ｂ１ａ（Ｃｚ
□、Ｃ２３に二重結合を有する〉とＢ１２（２３位にＯ
Ｈ基を有する）とはクロマトグラフィー上性質を異にす
るため両者の分離は容易である。
即ち、本発明はストレプトミセス属に属し、イソロジン
あるいはそのケト酸（３−メチル−２−オキソ吉草酸）
を効率よくエバーメクチン骨格に取り込み、バリンある
いはそのケト酸（２−オキソイソ吉草酸）のエバーメク
チン骨格への取り込みが著しく低下した、エバーメクチ
ンａ成分のみを蓄積する菌株にエバーメクチンＢＯ−メ
チルトランスフェラーゼ活性の欠損を付与した微生物を
培地で培養し、培養期間中外部より添加物を添加するこ
となく培養物中にエバーメクチンＢ１ａ、Ｂ１２を生産
蓄積させ、当該培養物よりエバーメクチンＢ１ａ、Ｂ２
ａを採取りることを特徴とするエバーメクチンの特定成
分の選択的製造法を提供するものである。
また、本発明はストレプトミセス・アベルミチリスに属
し、イソロイシンあるいはそのケト酸（３−メチル−２
−オキソ吉草酸）を効率よくエバーメクチン骨格に取り
込み、バリンあるいはそのケト酸（２−オキソイソカプ
ロン酸）のエバーメクチン骨格への取り込みが著しく低
下した、エバーメクチンａ成分のみを蓄積する菌株にエ
バーメクチンＢＯ−メチルトランスフェラーゼ活性の欠
損を付与したエバーメクチンの特定成分の選択的製造法
を提供するものである。
本発明のごとく、エバーメクチンを生産するストレプト
ミセス・アベルミチリス属に属する微生物に上記性状を
付与した菌株を用い培養期間中に添加物を添加せずに直
接醗酵法によってエバーメクチン特定成分を収率よく蓄
積せしめた報告は未だ知られていない。
上述したような、イソロイシンあるいはそのケト酸（３
−メチル−２−オキソ吉草酸）を効率よくエバーメクチ
ン骨格に取り込み、バリンあるいはそのケト酸（２−オ
キソイソ吉草酸〉のエバーメクチン骨格への取り込みが
著しく低下した、エバーメクチンａ成分のみを蓄積する
菌株でエバーメクチンＢＯ−メチルトランスフェラーゼ
活性が欠損した性質を有しているものであれば、自然界
から得られたままのものでも、栄養要求性あるいは薬剤
抵抗性などの性質を持つものでも、本発明において使用
可能であり、本発明の範囲に含まれる。さらに本発明は
生理的性質に係わらず、ＤＮＡを用いる形質転換、形質
導入、遺伝子組み換えによって改良し、それによって本
発明の明細書に記述された突然変異体の特徴を獲得した
生物体を含む。
本発明で用いられる微生物の代表的なものとしては、例
えばストレプトミセス・アベルミチリスに２０３８が挙
げられる。この菌株はストレプトミセス・アベルミチリ
スＡＴＣＣ３１２７１から誘導されたもので、イソロイ
シンあるいはそのケト酸（３−メチル−２−オキソ吉草
酸）を効率よくエバーメクチン骨格に取り込み、バリン
あるいはそのケト酸（２−オキソイソ吉草酸）のエバー
メクチン骨格への取り込みが著しく低下した、エバーメ
クチンａ成分のみを蓄積する変異株に２０３３とエバー
メクチンＢ　○−メチルトランスフェラーゼ活性を欠損
した変異株に２０３４とをプロトプラスト融合させに２
０３３株にエバーメクチンＢＯ−メチルトランスフェラ
ーゼ活性の欠損を付与した変異株である。なお、これら
の変異株はストレプトミセス・アベルミチリスに２０３
３、Ｋ２Ｏ３４、Ｋ２Ｏ３８として工業技術院微生物工
業技術研究所にブタペスト条約に基づく国際寄託にて「
微工研条寄第２７７３号（ＦＥＲＭＢＰ−２７７３）Ｊ
、「微工研条寄第２７７４号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２７
７４）Ｊ、「徽工研条寄第２７７５号（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−２７７５）Ｊとして寄託した。
変異の誘導は通常の変異処理によって比較的容易に行う
ことができる。すなわち、イソロイシンあるいはそのケ
ト酸（３−メチル−２−オキソ吉草酸）を効率よくエバ
ーメクチン骨格に取り込み、バリンあるいはそのケト酸
（２−オキソイソ吉草酸〉のエバーメクチン骨格への取
り込みが著しく低下した、エバーメクチンａ成分のみを
蓄積する変異株を得るには、親株を紫外線照射するかあ
るいは変異誘発剤、例えばＮ−メチル−Ｎ゛　−二トロ
ーＮ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸等
で処理した後、得られたコロニーをそれぞれ培地中で培
養し、培養途中に標識イソロイシンあるいはそのケト酸
（３−メチル−２−オキソ吉草酸）および標識バリンあ
るいはそのケト酸（２−オキソイソ吉草酸）を加え、数
時間培養する。菌体より培養物を抽出し培養物中に含ま
れるエバーメクチンを分離後、その放射活性を測定し、
標識イソロイシンあるいはそのケト酸（３−メチル−２
−オキソ吉草酸）をエバーメクチン骨格に取り込み、標
識バリンあるいはそのケト酸（２−オキソイソ吉草酸）
のエバーメクチン骨格への取り込みが親株でのエバーメ
クチンへの取り込みよりも有意に低下した変異株を取得
すればよい。
エバーメクチンＢＯ−メチルトランスフェラーゼ活性の
欠損した変異株を得るには、上記と同様に親株を変異誘
発剤で処理した後、得られたコロニーをエバーメクチン
を生産する培地に移植して培養し、培養終了後、菌体を
有機溶剤で抽出する。抽出した培養物をシリカゲル等の
薄層クロマトグラフィーによって分離し、エバーメクチ
ンＢ成分のみを生産する変異株を取得すればよい。
プロトプラスト融合法によるエバーメクチンＢＯ−メチ
ルトランスフェラーゼ活性欠損の付与は、イソロイシン
あるいはそのケト酸（３−メチル−２−オキソ吉草酸）
を効率よくエバーメクチン骨格に取り込み、バリンある
いはそのケト酸（２−オキソイソ吉草酸）のエバーメク
チン骨格への取り込みが著しく低下した、エバーメクチ
ンａ成分のみを蓄積する変異株より調製したプロトプラ
ストとエバーメクチンＢＯ−メチルトランスフェラーゼ
活性の欠損した変異株より調製したプロトプラストをポ
リエチレングリコールを用いて融合させた後、適当な再
生培地で融合プロスドプラストを菌糸体へ再生させ、再
生したコロニーについてａ成分のみを蓄積し、かつエバ
ーメクチンＢＯ−メチルトランスフェラーゼ活性の欠損
した再生体を取得すればよい。
本発明のエバーメクチンＢ　１　ａ　％　Ｂ　２　ａの
製造においては、先ず上記のイソロイシンあるいはその
ケト酸（３−メチル−２−オキソ吉草酸）を効率よくエ
バーメクチン骨格に取り込み、バリンあるいはそのケト
酸（２−オキソイソ吉草酸）のエバーメクチン骨格への
取り込みが著しく低下した、エバーメクチンａ成分のみ
を蓄積する菌株にエバーメクチンＢＯ−メチルトランス
フェラーゼ活性欠損を付与した変異株が適当な培地に培
養される。本発明におけるエバーメクチンＢ　１　ａ　
％　Ｂ２ａ生産用の培地は炭素源、窒素源、無機塩を含
有する通常の培地である。炭素源としてはグルコース、
グリセリン、ショ糖、デキストリン、澱粉、糖蜜などが
、窒素源としてはカゼイン、カゼイン氷解物、酵母抽出
物、酵母自己消化物、酵母加水分解物、乾燥酵母、大豆
粉、大豆消化物、コーンスチーブリカー、ディスティラ
ーズソルブル、綿実粉、肉エキスなどが、無機塩として
はナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム
、カルシウム、マンガン、亜鉛、鉄、コバルト等のリン
酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物、炭酸塩等であって、こ
れらイオンを放出し得る通常の塩が挙げられる。培養は
好気的条件下で行われる。培養の間、培地のｐＨは５〜
９に、温度は２５〜３５℃に調節され、１２０〜１９２
時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結果が得られ
る。上記の培養においてエバーメクチンＢ１ａを採取り
ることが目的であるならば、培地中に少なくともエバー
メクチンＢ１ａが生成蓄積されるようなエバーメクチン
生産株を培養すべきであることはいうまでもない。
培養物よりエバーメクチンＢ　１　ａ　ＳＢ　２　ａを
採取りるには、抗生物質を採取りる通常の方法を用いる
ことができる。例えば培養液を除去した菌体をアセトン
、メタノールなどの有ＩＩ溶媒でエバーメクチンを含む
成分を抽出し、残渣を除去後濃縮する。濃縮物を塩化メ
チレンのごとき有機溶媒で抽出する。塩化メチレン層を
集め減圧濃縮し、エバーメクチンＢ１ａ、Ｂ２ａを得る
ことができる。
さらにエバーメクチンＢ１ａを採取りるには得られた濃
縮物をイオン交換樹脂、シリカゲル、逆相シリカゲル、
セファデックス等を用いるカラムクロマトグラフィー、
向流分配等の方法によりＢ１ａ成分を分離採取りること
ができる。例えばエバーメクチンＢ１ａを含む混合物を
分取用高速液体クロマトグラフィー（逆相シリカゲル、
０ＤＳ）、移動相として８０％ｖ　／　ｖメタノール／
水でエバーメクチンＢ１ａを溶出させる。得られた溶出
液は減圧濃縮して、メタノールから再結晶してエバーメ
クチンＢ１ａを純粋な形で得ることができる。
以下本発明の実施例を具体的に説明する。
バーメクチンａ　　のみを　　　る　　　の夏 実遣側り一上 ストレプトミセス・アベル稟チリスＡＴＣＣ３１２７１
の胞子を常法によりＮ−メチル−Ｎ゛ニトロＮ−ニトロ
ソグアニジン処理（１ｍｇ／ｍ１、ｐＨ９，０で３０℃
６０分間）した後、この胞子を平板あたり２００個のコ
ロニーが生育するように滅菌水で希釈し、ＶＭＳ平板に
塗り広げ、３０℃で５日間培養した。生じたコロニーを
釣菌分離しＹＭＳ平板に１ｃｍ２のパッチ状に移植し、
これをマスター平板とした。マスター平板上の個々の菌
を１０ｍｌの生産培地１を含む１００ｍ１容エルレンマ
イヤフラスコに移植し、２８℃で２１Ｏｒｐｍ、振幅２
．５ｃｍの条件下で９６時間培養し、（Ｕ−１４Ｃ）−
Ｌ−イソロイシン（５０，０００ｃｐｍ）および［３，
４−Ｈ）−Ｌ−パリ：／（１００，０００ｃｐｍ）を添
加し、さらに６時間培養を続けた。培養終了後、菌体を
集め、３　ｍ　Ｉｔのアセトンで培養物を抽出し、残渣
を除去後抽出液を減圧乾固した。得られた粗抽出物を少
量のメタノールに溶し、シリカゲル薄層板（Ｍｅｒｋ　
　Ｋｉｅｓｅｌ　　ｇｅｌ　　６０Ｆｚｓ４）にスポッ
トし、１５％Ｖ　／　Ｖイソプロパツール／ヘキサンで
展開した。２５４ｎｍの紫外線を照射しエバーメクチン
に相当する部分を確認した後、その部分を切り取り１５
ｍＡ！容のシンチレーションバイアルに入れ、Ｑ、５ｍ
Ａのメタノールを加え、室温で１０分分間上うしてエバ
ーメクチンヲシリカゲルから溶出した。さらに５ｍｌの
シンチレータ（１０ｇジフェニルオキサゾール、０．２
ｇビスメチルスチリルベンゼン、１）キシレン）を加え
、液体シンチレーションスペクトロメーターでそれぞれ
の放射活性を測定した。なお、コントロールとしてはス
トレプトミセス・アベル旦チルスＡＴＣＣ３１２７１を
用いた。
裏益班−１ 実施例１で得た（Ｕ−”Ｃ）−Ｌ−イソロイシンをエバ
ーメクチン骨格に取り込み、（３，４−’Ｈ）−Ｌ−バ
リンのエバーメクチン骨格への取り込みが著しく低下し
た変異株についてマスター平板より相当する菌を選び、
実施例１で示したと同様の方法で培養を行った。培養９
６時間目に（Ｕ−四Ｃ）−Ｌ−イソロイシンおよび（３
，４−’Ｈ）　　Ｌ−ｔ＜リンあるいは〔Ｕ−四Ｃ）−
３−メチル−２−オキソ吉草酸および（３，４−’　Ｈ
）−２−オキソイソ吉草酸を実施例１と同量加え６時間
培養した。実施例１と同様に菌体よリエバーメクチンを
分離精製しその放射活性を測定した。
その結果は第１表に示すとおりである。親株のストレプ
ト〔セス・アベル逅チルスＡＴＣＣ３１２了１は添加し
た標識化合物をエバーメクチン骨格に取り込んだ。一方
、変異株に２０３３株は〔Ｕ１４Ｃ）　　Ｌ−イソロイ
シンまたはそのケト酸（３−メチル−２−オキソ吉草酸
）をエバーメクチン骨格に取り込んだが（３，４−’　
Ｈ）−Ｌ−バリンおよびそのケト酸（２−オキソイソ吉
草酸）のエバーメクチン骨格への取り込みは著しく低下
していた。
裏旌班−主 親株ストレプトミセス・アベルミチルスＡＴＣＣ３１２
７１および実施例２で得られたに２０３３株の胞子懸濁
液をｌ　Ｏｍｌの生産培地２を含む１００ｍｊ！容エル
レンマイヤフラスコにそれぞれ移植し、２８℃、２１Ｏ
ｒｐｍ振幅２．５ｃｍの条件下で１６８時間培養した。
培養終了後、１０ｍ１のメタノールを加え充分攪拌し培
養物を抽出した。菌体残渣を遠心除去後、抽出物中のエ
バーメクチンを高速液体クロマトグラフィー（ＯＤ３３
μｍ、カラムサイズ６φＸ７５ｍｍ、流速１ｍｊ！／ｍ
ｉｎ、移動相８０％ｖ　／　ｖメタノール／水、検出２
４６ｎｍ）で分析した。その結果は第１図ａ）、ｂ）に
示すとおりである。親株のストレプトミセス・アベルミ
チルスＡＴＣＣ３１２７１は８種の成分のエバーメクチ
ン（Ａ１ａ、Ａｌｂ、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ｂ１ａ、Ｂｉｂ
、Ｂ２ａおよびＢ２ｂ）を生産したが、Ｋ２Ｏ３３株は
８種の成分の内の有効成分であるＢ１ａを含む４種の成
分（Ａ１ａ、Ａ２ａ、Ｂ１ａ、Ｂ２ａ）を生産した。
実施例　４ ストレプト果セス・アベルごチルスＡＴＣＣ３１２７１
の胞子を常法によりＮ−メチル−Ｎ゛ニトロＮ−ニトロ
ソグアニジン処理（１ｍｇ／ｍ１）ｐＨ９，０で３０℃
６０分間）した後、この胞子を平板あたり２００個のコ
ロニーが生育するように滅菌水で希釈し、ＶＭＳ平板に
塗り広げ、３０℃５日間培養した。生したコロニーを釣
菌分離しＶＭＳ平板に１ｃｍ”のパッチ状に移植し３０
℃で５日間培養してマスター平板とした。
マスター平板を生産培地３にレプリカし３０℃で８日間
培養した。培養終了後、生産培地３上のそれぞれのバッ
チ状の菌体を寒天培地ごと切り出しプラスチックチュー
ブに入れ、０．５ｍｊ！のアセトンを加え室温で１５分
間放置して培養物を抽出した。菌体および寒天片を除き
抽出液を濃縮乾固した。得られた抽出物を２５μｌのア
セトンに溶解し、その５μｌをシリカゲル薄層板（Ｍｅ
ｒｋＫｉｅｓｅｌ　　ｇｅｌ　　６０Ｆｚｓ４）にスポ
ットし、１５％Ｖ　／　Ｖイソプロパツール／ヘキサン
で展開した。紫外線２５４ｎｒｎを照射し、エバーメク
チンＢ成分のみを生産している変異株に２０３４株を取
得した。
実施例　５ 実施例２で得たＬ−イソロイシンあるいはそのケト酸（
３−メチル−２−オキソ吉草酸）を効率よくエバーメク
チン骨格に取り込み、Ｌ−バリンあるいはそのケト酸（
２−オキソイソ吉草酸）のエバーメクチン骨格への取り
込みが著しく低下した、エバーメクチンａ成分のみを蓄
積する菌株に２０３３および親株ＡＴＣＣ３１２７１よ
り変異処理で得たエバーメクチンＢＯ−メチルトランス
フェラーゼ活性欠損株に２０３４の胞子懸濁液を５　Ｑ
　ｍ　１の３０％ｗ　／　ｖショｌｉ、５ｍＭＭｇＣ１
２、ｏ、５％ｗ／ｖグリシン含有ＹＥＭＥ培地を含む５
００ｍｌ容エルレンマイヤフラスコに移植し、２８℃、
１８０ｒｐｍ、６８時間振とう培養を行った。培養液を
３００　Ｏｒ　ｐ　ｍ　１０分間遠心し、菌体を集め１
０ｍ１のＰＩＯ培地に懸濁後再び遠心分離にて菌体を集
めた。洗浄菌体をｌＱｍｌのろ過滅菌した１　ｍ　ｇ　
／　ｍ　ｌの卵白リゾチームを含むＰＬＯ培地に懸濁し
３７℃で６０分分間中かに振とうしながらプロトプラス
トを形成させた。プロトプラストを含む試料を綿栓ろ過
器を通し、未消化の菌体を除去した。プロトプラストの
みを含む通過液を３００Ｏｒｐｍ、１０分間遠心しプロ
トプラストを沈澱させた。５ｍｌのＰ２０培地を加え、
穏やかにプロトプラストを懸濁させた後、遠心分離でプ
ロトプラストを集めた。２ｍＡのＰ２０培地にプロトプ
ラストを懸濁させた後、その一部を希釈し、希釈液を血
球測定板に移し位相差顕微鏡（４００倍）でプロトプラ
スト数を計測した。Ｋ２Ｏ３３株およびに２０３４株の
プロトプラストをそれぞれ５Ｘ１０”個を小形試験管に
移し充分混合した。なお、全体の容量は５０ｔｔ１以下
とした。０．５ｍ／の５０％ｗ　／　ｖポリエチレング
リコール＃１．　０００Ｒ？＆　（１ｇ（Ｄポリエチレ
ングリコール＃　１　、　　ＯＯＯヲ１）１）１！のＰ
２０培地に溶解後、０．４５μｍのフィルターを用いて
濾過滅菌）を加え速やかに混合しプロトプラストを融合
させた。室温で１分間放置した後、Ｐ２０培地を０．５
ｍＡ’加えて混合しポリエチレングリコールを希釈した
。融合物をＰ２０培地で１０−２１０−’に希釈し、平
板あたりＯ，１ｍＡの希釈した融合物をＲＭ１４培地上
に２．５ｍｌ軟寒天ＲＭ１４とともに広げた。平板を３
０℃１０日間培養し、菌糸体へ再生させた。再生した菌
糸体を平板表面より剥離し、ホモジナイザーを用いて均
一にし、滅菌水で希釈した一部をＶＭＳ平板に塗り広げ
、３０℃５日間培養した。完熟した胞子をかきとり、滅
菌水で平板あたり２００コロニーとなるように希釈しＶ
ＭＳ平板に塗り広げ３０℃５日間培養した。出現したコ
ロニーのおよそ８０％はに２０３３株（濃茶色、胞子多
〉の形態を示し、他はに２０３４株（薄茶色、胞子少）
の形態を示した。
実益班−１ プロトプラスト融合で得られたに２０３３株と同様の形
態を示したコロニーを生産培地３にｌＣｍ２のパンチ状
に塗り広げ３０℃８日間培養した。
培養終了後それぞれのコロニーのパンチを切り出し、プ
ラスチックチューブに入れ、Ｑ、５ｍＡのアセトンを加
え、室温で１５分間放置して培養物を抽出した。菌体お
よび寒天片を除き抽出液を濃縮乾固した。得られた粗抽
出物を２５μｌのアセトンに溶解しその一部５μｌをシ
リカゲル薄層板にスポ・２トし、８５％Ｖ　／　Ｖヘキ
サン／イソプロパツールで展開した。展開後、２５４ｎ
ｍの紫外線を照射して生産されたエバーメクチンの成分
を確認し、エバーメクチンＢＯ−メチルトランスフェラ
ーゼ活性欠損によるエバーメクチンＢ成分のみを生産す
る菌株を選択した。さらにそれらの培養抽出物を逆相シ
リカゲル薄層板（Ｗｈａｔｍａｎ　　ＫＣｌ８Ｆ）にス
ポットし７０％ｗ　／　ｖアセトニトリル／水で展開し
、紫外線２５４ｎｍを照射して、エバーメクチンａ成分
のみを生産している菌株を選択した。
失襄拠−１ プロトプラスト融合で得られたエバーメクチンＢ成分て
なおかつａ成分のみを生産する変異株（Ｋ２Ｏ３８株）
の胞子懸濁液を１０ｍ１の種培地を含む５０ｍ１容大形
試験管に移植し、３０℃４８時間振とう培養した後その
０．２ｍＡを１０ｍ１の生産培地２を含む１００ｍｌ容
エルレンマイヤフラスコに移植し、２８℃で２１Ｑｒｐ
ｍ、振幅２．５ｃｍの条件下で１６８時間培養した。培
養終了後実施例３で示した方法で培養物を抽出し、抽出
物の分析を行った。その結果は第２図に示すとおりであ
る。プロトプラスト融合で得られたに２０３８株はエバ
ーメクチンの８種の成分のうち有効成分であるＢ１ａ、
Ｂ２ａの成分のみを生産した。またエバーメクチンＢ１
ａの蓄積量も顕著に向上していることが明らかであった
。
大豊班−エ エルレンマイヤフラスコ３０本で培養したストレプトミ
セス・アベルミチリスに２０３８株の培養液（およそ２
５０ｍ１）より菌体を分取し、１５０ｍ１の脱イオン水
で菌体を洗浄した後、１０（Ｊｍｌのメタノールを加え
、室温で３０分間攪拌して抽出した。菌体抽出液をセラ
イトを用いてろ過し菌体残渣を除き、ろ液をおよそｌＱ
ｍ＃になるまで減圧濃縮した。濃縮液に１０ｍＡの脱イ
オン水を加え、さらに２０ｍＡの塩化メチレンを加えて
抽出した。塩化メチレン層を分取した後、水層を再度２
０　ｍ　ｌの塩化メチレンで抽出した。塩化メチレン層
を合わせ減圧乾固し５０　ｍ　ｊ！の酢酸、エチルに溶
解し、無水硫酸ナトリウム２ｇを加え脱水した。酢酸エ
チル溶液を１０ｇのシリカゲルを充填したカラムに通塔
し、さらに５０ｍ１ｌの酢酸エチルを流した。通過液を
集め、減圧濃縮し粘張な油状物質約０．８ｇが得られた
。約３０ｇのシリカゲｉＬｔ（Ｍｅｒｋ　　１００〜２
００メンシユ）を充填したカラムを塩化メチレンで平衡
化した後、０．８ｇの油状物質を少量の塩化メチレンに
溶解し、カラムに通塔した。塩化メチレンで洗浄した後
、５％ｖ　／　ｖイソプロパツール／塩化メチレンで溶
出した。エバーメクチンＢ１ａを多く含む画分を集めた
後、２ｇの活性炭を充填したカラムに通塔し、さらにカ
ラムを１０ｍＭの塩化メチレンで洗浄した。得られた通
過液を減圧乾固し少量のイソプロピルエーテルを加えて
溶し、冷却下へキサンを滴下して白色の沈澱を得た。沈
澱物をろ過して集め減圧乾燥し白色粉末Ｉ　Ｑｍｇが得
られた。高速液体クロマトグラフィーによる分析結果よ
り得られた白色粉末は９０％以上のエバーメクチンＢ１
ａを含んでいたく第３図参照〉。
この白色粉末の理化学的性状を調べたところ、ＪＡｍ、
Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１０３．４２１６４２２１記載のエ
バーメクチンＢ１ａの性状と一致した。
前記実施例において使用した各種培地の組成は以下に示
すごとくである。
ヱ藍主隻地旦緻底 麦芽エキス（Ｄｉｒｃｏ）　　　　１０ｇ酵母エキス（
Ｄｉｒｃｏ）　　　　　４ｇソルブルスターチ（Ｄｉｒ
ｃｏ）　　　４ｇ寒天　　　　　　　　　　　　　２０
ｇ蒸留水　　　　　　　　　　　　　１）２Ｎ水酸化カ
リウムでｐＨ７，２とした後１２１℃１５分間高圧滅菌
にかける。滅菌終了後塩化マグネシウム、硝酸カルシウ
ムを１０ｍＭ、８ｍＭとなるように加える。
１羞１鵠りじ１此底 グルコース 塩化ナトリウム リン酸２カリウム 硫酸第１鉄７水和物 ０ｇ ２、０ｇ ０．０５ｇ ０．０５ｇ 硫酸亜鉛７永和物 硫酸マンガン４水和物 硫酸マグネシウム７水和物 硫酸アンモニウム 炭酸カルシウム 蒸留水 ２Ｎ水酸化カリウムでｐＨ７゜ １℃１５分間高圧滅菌にかける。
０．０５ｇ ０、　０５ｇ ０、１ｇ １、５ｇ ５、０ｇ １／ ２とした後１２ 且しり１匿１セ４旧葭 グルコース ペプトン化牛乳 酵母自己消化物 寒天 蒸留水 ２Ｎ水酸化カリウムでｐＨ７，２ １℃で１５分間高圧滅菌にかける。
５ｇ ４ｇ ２、５ｇ ０ｇ ＩＩ！ とした後１２ Δ羞１幽ｈ２（彰敗虐 グルコース　　　　　　　　　　４５ｇペプトン化牛乳
　　　　　　　　２４ｇ酵母自己消化物　　　　　　　
　　２．５ｇポリプロピレングリコール ＃２０００　　　　　　　　　２．５ｍｌ蒸留水　　　
　　　　　　　　　　１）２Ｎ水酸化カリウムでｐＨ７
，２とした後１２１℃で１５分間高圧滅菌にかける。
ＹＥＭＥｆＬｌ　の 酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ） 麦芽エキス（Ｄｉｒｃｏ） ペプトン　（Ｄｉｒｃｏ） グルコース 蒸留水 １２１℃１ ５分間高圧滅菌にかける。
′−１ｒ′の 塩化第２鉄６水和物 塩化亜鉛 ｇ ｇ ｇ ０ｇ １ ００ｇ ４０　ｍ　ｇ 塩化第２銅２水和物　　　　　　１０ｍｇ塩化マンガン
４水和物　　　　　１０ｍｇホウ酸ナトナトリウム１０
水和物１０ｍｇモリブデン酸アンモニウム４ 水和物　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ蒸留水　　　
　　　　　　　　　　１）上１」」１）１匪底 ショ糖　　　　　　　　　　　１０３ｇ硫酸カリウム　
　　　　　　　　　　０．２５ｇ塩化マグネシウム６水
和物　　　　２．０３ｇ微量元素溶液　　　　　　　　
　　２．９ｍｌ蒸留水　　　　　　　　　　　８００ｍ
１１２１℃１５分間高圧滅菌にかけた後、以下の組成の
ものを加える。
０．５％リンＭ１カリウム　　　　１０ｍＢ．６８％塩
化カルシウム２水和物 １００ｍ１！ ０．２５Ｍ　　ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６，５１００ｍｌ！ ヱ」」１会馳４４旧罠 シーＩ＃Ｍ　　　　　　　　　　　　２０５％硫酸カリ
ウム　　　　　　　　　　０．２５ｇ塩化マグネシウム
６水和物　　　　２．０３ｇ微量元素溶液　　　　　　
　　　　２．０ｍｌ蒸留水　　　　　　　　　　　８０
０ｍｌ工２１℃１５分間高圧滅菌にかけた後、以下の組
成のものを加える。
０．５％リン酸１カリウム　　　ｌ　Ｏｍｊ！３．６８
％塩化カルシウム２水和物 ００ｒｒ１ ０．２５Ｍ　　ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６，５００ｍｌ ＲＭ１４立ｌ　の シｇ糖 硫酸カリウム 塩化マグネシウム６水和物 グルコース カザごノ酸 ０５ｇ ０．２５ｇ １０．１２ｇ １０．０ｇ ０．１ｇ Ｌ−プロリン　　　　　　　　　　　３．０ｇ酵母エキ
ス（Ｄｉｒｃｏ）　　　　　２．０ｇ微量元素溶液　　
　　　　　　　　２．Ｑｍ１オートミール寒天（Ｄｉｒ
ｃｏ）　　　３．０ｍｌ寒天　　　　　　　　　　　　
　２０ｇ蒸留水　　　　　　　　　　　８７０ｍ１１２
１″’ｃｌｓ分間高圧滅菌にかけた後、以下の組成のも
のを加える。
０．５％リン酸１カリウム　　　ｌ　Ｑｍｌ３．６８％
塩化カルシウム２水和物 ０ｍ１ Ｏ，２５Ｍ　　ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６，５Ｑｍｌ Ｌ−プロリン　　　　　　　　　　　３．０ｇ酵母エキ
ス（Ｄｉｒｃｏ）　　　　　　２．０ｇ微量元素溶液　
　　　　　　　　　２．０ｍ／オートミール寒天（Ｄｉ
ｒｃｏ）　　　３．０ｍ７！寒天　　　　　　　　　　
　　　　５，０ｇ蒸留水　　　　　　　　　　　８７０
ｍ１１２１″ＣＩ５分間高圧滅菌にかけた後、以下の組
成のものを加える。
０．５％リン酸エカリウム　　　１０ｍ１３．６８％塩
化カルシウム２水和物 　　０ｍＪ ０．２５Ｍ　　ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６，５Ｑｍｌ 東　　ＲＭ１４ｔ”ｔ　　の ショ糖 硫酸カリウム 塩化マグネシウム６水和物 グルコース カザくノ酸 ０５ｇ ０．２５ｇ １０．１２ｇ １０．０ｇ ０、１　ｇ
【図面の簡単な説明】
第１図はストレプトミセス・アベルミチリスＡＴＣＣ３
１２７１（ａ）及びス＋しブトミセス・アベルミチリス
に２０３３（ｂ）の培養物の高速液体クロマトグラム、 第２図はストレプトミセス・アベルミチリスに２０３８
の培養物の高速液体クロマトグラム、第３図はストレプ
トミセス・アベルミチルスに２０３８の培養物を分離精
製した標品の高速液体クロマトグラムである。 イＬ李う′　日１）間 （分） 僅ｒｅ　Ｍ団 （分） 保ｔ）ロケ藺（分）

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）イソロイシンあるいはそのケト酸（３−メチル−
    ２−オキソ吉草酸）を効率よくエバーメクチン骨格に取
    り込み、バリンあるいはそのケト酸（２−オキソイソ吉
    草酸）のエバーメクチン骨格への取り込みを著しく低下
    した、エバーメクチンａ成分のみを蓄積することを特徴
    とするエバーメクチンの特定成分を選択生産するための
    微生物。
  2. （２）ストレプトミセス・アベルミチルスＫ２０３３（
    ＦＥＲＭＢＰ−２７７３）である請求項１記載のエバー
    メクチン特定成分を選択生産するための微生物。
  3. （３）ストレプトミセス・アベルミチルスＫ２０３４（
    ＦＥＲＭＢＰ−２７７４）である請求項１記載のエバー
    メクチン特定成分を選択生産するための微生物。
  4. （４）ストレプトミセス・アベルミチルスＫ２０３８（
    ＦＥＲＭＢＰ−２７７５）である請求項１記載のエバー
    メクチン特定成分を選択生産するための微生物。
  5. （５）エバーメクチンＢＯ−メチルトランスフェラーゼ
    活性を欠く請求項１記載のエバーメクチン特定成分を選
    択生産するための微生物。
  6. （６）イソロイシンあるいはそのケト酸（３−メチル−
    ２−オキソ吉草酸）を効率よくエバーメクチン骨格に取
    り込み、バリンあるいはそのケト酸（２−オキソイソ吉
    草酸）のエバーメクチン骨格への取り込みを著しく低下
    した、エバーメクチンａ成分のみを蓄積する性質を有す
    る微生物を培地で培養し、培養物中に少なくともエバー
    メクチンＢ１ａを生産蓄積させ、当該培養物よりエバー
    メクチンＢ１ａを採取することを特徴とする請求項１記
    載の微生物。
  7. （７）イソロイシンあるいはそのケト酸（３−メチル−
    ２−オキソ吉草酸）を効率よくエバーメクチン骨格に取
    り込み、バリンあるいはそのケト酸（２−オキソイソ吉
    草酸）のエバーメクチン骨格への取り込みを著しく低下
    した、エバーメクチンａ成分のみを蓄積する性質を有す
    る微生物を培地で培養し、培養物中に少なくともエバー
    メクチンＢ１ａ、Ｂ２ａを生産蓄積させ、当該培養物よ
    りエバーメクチンＢ１ａ、Ｂ２ａを採取することを特徴
    とする請求項１記載の微生物。
  8. （８）ストレプトミセス・アベルミチルスに属し、イソ
    ロイシンあるいはそのケト酸（３−メチル−２−オキソ
    吉草酸）を効率よくエバーメクチン骨格に取り込み、バ
    リンあるいはそのケト酸（２−オキソイソ吉草酸）のエ
    バーメクチン骨格への取り込みを著しく低下した、エバ
    ーメクチンａ成分のみを蓄積する性質を有する微生物を
    培地で培養し、培養物中にエバーメクチンＢ１ａを生産
    蓄積させ、当該培養物よりエバーメクチンＢ１ａを採取
    することを特徴とするエバーメクチンの特定成分の選択
    的製造法。
  9. （９）ストレプトミセス・アベルミチルスに属し、イソ
    ロイシンあるいはそのケト酸（３−メチル−２−オキソ
    吉草酸）を効率よくエバーメクチン骨格に取り込み、バ
    リンあるいはそのケト酸（２−オキソイソ吉草酸）のエ
    バーメクチン骨格への取り込みを著しく低下した、エバ
    ーメクチンａ成分のみを蓄積する性質を有する微生物を
    培地で培養し、培養物中にエバーメクチンＢ１ａ、Ｂ２
    ａを生産蓄積させ、当該培養物よりエバーメクチンＢ１
    ａ、Ｂ２ａを採取することを特徴とするエバーメクチン
    の特定成分の選択的製造法。
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