CN101429536B - 一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法 - Google Patents
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Abstract
一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，属于微生物发酵技术领域。其工艺步骤包括：阿维链霉菌的斜面培养；制成孢子悬浮液；确定接种量；进行种子摇瓶培养；最后进行发酵培养，得到含有阿维菌素的发酵液。本发明通过对阿维链霉菌通过纯化培养、种子培养和发酵培养，最后得到阿维菌素，此方法设计合理，简单易行。通过确定孢子的接种量和孢子接种到发酵培养基的时机，确定了最优条件，本发明与挖块接种和菌丝接种相比，孢子接种方式不仅在接种量上易控制，发酵结果较稳定，效价增幅上比挖块接种及菌丝接种有优势，最大的效价达到4600μg/ml以上。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法。
背景技术
阿维菌素(Avermectins)是1976年美国Merck公司从日本北里研究所提供的一株放线菌新种---阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis，简称S.avermitilis)发酵中获得一簇结构相似的新型化合物。它是一类新型大环内酯类抗生素，其分子由一个16元内酯环与两个齐墩果糖糖苷配基构成。天然阿维菌素有八种组分，主要是在C5、C22-C23和C26等三个位置存在结构差异。八种组分中以B1a的杀虫活性最高，其它异构体杀虫活性较低且毒性较高。在通常情况下，菌株的发酵产物中A1a、A2a、B1a和B2a组分之和的比例在80％以上，而A1b、A2b、B1b和B2b组分之和的比例在20％以下。该簇结构相似的化合物被统称为阿维菌素或称阿弗菌素。阿维菌素对家畜的肠内寄生虫具有极其有效的驱虫活性，并具有作用机制独特、有效剂量低、安全性高等特点，是一种有着良好市场应用前景的生物农药；同时阿维菌素也是高效的杀虫、杀螨剂，其衍生物也可用于治疗人类由于螨虫或线虫引起的疾病。
现有，对阿维链霉菌的培养主要采用菌丝接种培养和挖块接种培养，这两种接种方式接种量很难控制，发酵结果不稳定，效价增幅不明显。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明通过采用全孢子接种，设计提供一种生产阿维菌素的方法。
所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
(1)将阿维链霉菌接种至斜面培养基，在温度27-29℃下，培养7-9天；
(2)取上述的阿维链霉菌孢子斜面，用无菌水振荡洗涤斜面制备成孢子悬浮液；
(3)计算孢子悬浮液中孢子的数量，然后用移液管吸取孢子悬浮液至种子培养摇瓶中的种子培养基中，使每毫升种子培养基的孢子接种量为4×107-6×107个，种子培养摇瓶装量为30-50ml种子培养基/250ml摇瓶；
(4)将步骤(3)的孢子悬浮液进行摇床培养，在温度27-29℃下，转速为200-300r/mim的旋转式摇床上培养40-48小时，得到全孢子液；
(5)取上述的全孢子液，按培养基体积3％-7％的接种量，接种到发酵培养基中，进行摇床培养，发酵摇瓶装量为20-40ml发酵培养基/250ml摇瓶，在温度27-29℃下和湿度40％-50％下，转速为200-300r/mim的旋转式摇床上培养240-260小时，得到含有阿维菌素的发酵液。
所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于所述的斜面培养基组分重量百分比为：酵母膏0.1％、麦芽糖0.1％、胰蛋白胨0.2％、葡萄糖0.4％、琼脂粉2％，余量为蒸馏水，并使pH值调至7.2。
所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于种子培养基含有：玉米淀粉30g/L、玉米浆5g/L、酵母膏15g/L、KH2PO44g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L，并调pH为7.0-7.2。
所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于发酵培养基含有：玉米淀粉120g/L、酵母粉15g/L、豆粕粉5g/L、花生饼粉5g/L、KH2PO4 0.5g/L，并调pH为7.0-7.2。
所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于步骤(3)中用采用血球记数板计算孢子悬浮液中孢子的数量，每毫升种子培养基的孢子接种量为4×107-5×107个，种子培养摇瓶装量为30-40ml种子培养基/250ml摇瓶。
所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于步骤(3)中每毫升种子培养基的孢子接种量为5×107-6×107个，种子培养摇瓶装量为40-50ml种子培养基/250ml摇瓶。
所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于步骤(4)中摇床培养条件为：温度为27-28℃，摇床转速为230-270r/mim，培养时间为42-46小时。
所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于步骤(4)中摇床培养条件为：温度为28-29℃，摇床转速为240-260r/mim，培养时间为43-45小时。
所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于步骤(5)中摇床培养条件为：种子摇瓶装量为25-35ml发酵培养基/250ml摇瓶，接种量为3％-5％，温度为27-28℃，摇床转速为230-270r/mim，培养时间为245-255小时。
所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于步骤(5)中摇床培养条件为：种子摇瓶装量为28-32ml发酵培养基/250ml摇瓶，接种量为5-7％，温度为28-29℃，摇床转速为240-260r/mim，培养时间为247-253小时。
本发明通过对阿维链霉菌通过纯化培养、种子培养和发酵培养，最后得到阿维菌素，此方法设计合理，简单易行。通过确定孢子的接种量和孢子接种到发酵培养基的时机，确定了最优条件，本发明与挖块接种和菌丝接种相比，孢子接种方式不仅在接种量上易控制，发酵结果较稳定，效价增幅上比挖块接种及菌丝接种有优势，最大的效价达到4600μg/ml以上。
采用全孢子接种方式，连续进行5批摇瓶发酵，并以常规的挖块接种和菌丝接种培养作为对照。每批实验采用6个发酵摇瓶，260h放瓶测效价并计算平均值，孢子接种阿维菌素的最终效价远高于挖块接种和菌丝接种，其5批实验平均效价均处于4600μg/ml以上，批次实验之间效价结果较为稳定，这是因为而孢子接种可以保持一个较为稳定的接种量，同时又由于孢子接种时孢子分散性好、悬浮液较为均匀，所以批实验重复性相对较好。而挖块接种和菌丝接种方式的效价较低，5批均低于4000μg/ml，而且批次实验重复性不好，效价变化幅度比较大。
附图说明
图1孢子接种与挖块接种的阿维菌素效价增幅趋势；
图2采用不同接种方式的发酵过程中总糖的变化趋势；
图3采用不同接种方式的发酵过程中还原糖的变化趋势；
图4采用不同接种方式的发酵过程中氨基氮的变化趋势；
图5采用不同接种方式的发酵过程中pH的变化趋势；
图6采用不同接种方式的发酵过程中效价变化趋势。
具体实施方式
本发明所用的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)，由浙江升华拜克生物股份有限公司提供。
配置培养基：
斜面培养基：酵母膏0.1％、麦芽糖0.1％、胰蛋白胨0.2％、葡萄糖0.4％、琼脂粉2％、余量为蒸馏水，并使pH值调至7.2。
种子培养基：玉米淀粉30g、玉米浆5g、酵母膏15g、KH2PO44g、MgSO4·7H2O0.2g和蒸馏水1000ml，并调PH为7.0-7.2。
发酵培养基：玉米淀粉120g、酵母粉15g、豆粕粉5g、花生饼粉5g、KH2PO4 0.5g和蒸馏水1000ml，并调pH为7.0-7.2。并调PH为7.0-7.2。
实施例
(1)将阿维链霉菌接种至斜面培养基，在温度28℃下，培养8天；
(2)取上述的阿维链霉菌孢子斜面，用无菌水振荡洗涤斜面制备成孢子悬浮液；
(3)采用血球记数板计算孢子悬浮液中孢子的数量，然后用移液管吸取孢子悬浮液至种子培养摇瓶中的种子培养基中，使每毫升种子培养基的孢子接种量为5×107个，种子培养摇瓶装量为40ml种子培养基/250ml摇瓶；
(4)将步骤(3)的孢子悬浮液进行摇床培养，在温度28℃下，转速为250r/mim的旋转式摇床上培养46小时，得到全孢子液；
(5)取上述的全孢子液，按培养基体积5％的接种量，接种到发酵培养基中，进行摇床培养，发酵摇瓶装量为30ml发酵培养基/250ml摇瓶，在温度28℃下和湿度45％下，转速为250r/mim的旋转式摇床上培养250小时，得到含有阿维菌素的发酵液。
大量试验表明，步骤(1)中采用温度27℃、28.5℃、29℃，培养7、9天；步骤(3)中采用每毫升种子培养基的孢子接种量为4×107个，种子培养摇瓶装量为30ml种子培养基/250ml摇瓶，或每毫升种子培养基的孢子接种量为6×107个，种子培养摇瓶装量为50ml种子培养基/250ml摇瓶，或接种量4.5×107个/ml，步骤(4)中采用温度27℃，转速300r/mim，培养时间为40小时，或温度29℃，转速200r/mim，培养时间为48小时，或温度28.5℃，转速230r/mim，培养时间为45小时，步骤(5)采用接种量3％，6％，7％，发酵种瓶装量为20ml/250ml、40ml/250ml，温度为27℃、27.5℃、29℃，转速为200r/mim、230r/mim、270r/mim，时间为240小时、245小时、255小时、260小时，其他条件均与实施例相同，最后也能达到与实施例相同的技术效果。
一阿维菌素效价测定
阿维菌素含量测定采用HPLC，HP1100色谱系统。
色谱柱：Hypersil ODS C-18，5μm，250mm×4.0mm；流动相：CH3OH/H2O＝90/10；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：246nm。
分析方法：取发酵液2.5mL，取发酵液2.5rnl，加入甲醇定容至50ml，充分振荡超声20min，过0.22m滤膜，滤液用微量进样器准确吸取20μL样品滤液注入色谱仪，根据积分面积，利用外标法计算出发酵效价(发酵效价仅指B1a的浓度)。
二孢子接种量的确定及其对效价的影响
选取一支成熟丰满的阿维链霉菌孢子斜面制备孢子悬浮液，采用一定量的孢子悬浮液接种培养，并与挖块接种对照比较差异。如图1显示，在发酵前期与挖块接种对比，孢子接种(spore inoculation)的起步效价低，在48h时效价单位为0，且效价增幅较慢，但在中后期孢子接种效价增幅高于对照的挖块接种(ck)，且效价在200h左右已超过挖块接种，说明孢子接种的后劲较大。
这可能跟孢子本身的优势有关，孢子一般是单核的，发酵过程中易保持纯种和不退化，同时孢子后劲可能较大。推测可能还与两种接种方式的不同接种量有关，接种量影响了菌体的生长速度和菌丝形态，菌丝形态在发酵中是一极其重要的参数，从而导致斜面孢子接种量的多少直接影响菌体的整个生长与发酵过程。孢子接种简单的量化实验的结果表明不同的接种量对孢子接种的优势有一定的影响，当每ml种子培养基的孢子接种数量处于4×107和6×107个范围内，效价变化幅度不大，但是随着孢子接种量高于107或低于107效价下降的趋势较为明显，最适孢子接种量处于4×107/ml和6×107个/ml左右。因孢子接种可以保持一个较稳定的接种量，而挖块接种的接种量比较难以控制，从而也导致挖块接种的批内重复性实验不稳定，孢子接种由于孢子分散性好、悬浮液较为均匀导致批内实验重复性比较好。同时孢子接种的好坏与斜面孢子生长的好坏密切相关，因此孢子接种必需要首先保证孢子培养比较稳定，采用的孢子应是生长成熟丰满的略呈灰色凸起的阿维链霉菌孢子。
表1：不同接种量对阿维菌素效价的影响
三孢子接种到发酵培养基中时机的确定
孢子接种方法因孢子要经过吸水膨胀、萌发到生长成菌丝过程，采用全孢子接种需要确定其接种到培养基中的时机。根据试验结果，斜面孢子、培养基与培养条件等因素的不同均可能导致移种时间的差异，当每ml种子培养基的孢子接种量处于4×107和6×107个范围内时，移种至发酵培养基中时间大约为36h-48h左右，此时，孢子基本已萌发，但菌丝还未出现。此时接种到发酵培养基的孢子即为全孢子接种。
四不同接种方式的阿维链霉菌种子生长过程的差异
为挖掘孢子接种的优势存在的内因，进一步比较了几种不同接种方式(孢子接种(spore inoculation)、挖块接种(CK)、菌丝接种(mycelia inoculation)的阿维链霉菌发酵生长与发酵的差异，具体比较了阿维链霉菌生长与发酵过程中的营养消耗、过程pH变化、效价增长以及菌丝形态的差异。
1.不同接种方式的阿维链霉菌种子生长过程的差异
对种瓶中26h时不同接种方式的菌丝形态差异比较，可以得到挖块接种的摇瓶种子生长较快，油镜下观察孢子接种与菌丝接种26h时在视野范围内均只有少量菌丝，而挖块接种已有大量菌丝繁殖。这是因为挖块接种的菌块中含有孢子和菌丝，生长较快；孢子接种由于孢子要经过吸水膨胀、发芽到生长成菌丝的过程，菌丝接成网状到成团时间明显晚于挖块接种；菌丝接种挖的菌丝属于水洗后的不带孢子的菌落，接种量相对较少，少量的菌丝要繁殖成大量菌丝并接成网状结构的过程晚于挖块接种，但早于孢子接种。移种的时间大概为：挖块接种41h、菌丝接种44h、孢子接种48h。
从pH的变化状况来看，三种接种方式对pH的整个变化趋势并无影响。一般来说，阿维素产生菌的种子培养前期pH是稳定的，到10h左右开始上升，再下降再上升再缓慢下降，最佳的移种时机可能是第二次上升的最高点，一般此时大概处于种子的对数生长期，此时pH值为6.7-6.8。因为接种量，消毒过程的操作，培养条件的影响出现该转折点的时刻稍有偏差。基本上三种不同的接种方式的种子生长过程中pH的变化都是遵行这种先升后降再升再缓慢下降的过程。但是具体的变化范围有所区别，挖块接种pH变化的峰值最高，变化的幅度最大，菌丝接种的pH变化的峰值最抵，变化幅度最小，孢子接种界于两者之间，这可能与整个种子生长过程中的底物代谢有关。
2.接种方式对阿维链霉菌发酵过程的影响
实验结果表明不同接种方式的阿维链霉菌发酵过程中的营养消耗、过程pH变化以及菌丝形态均有差异。如图2所示，在120h前，菌丝接种的总糖消耗速率最快，孢子接种的消耗速率最慢，144h后发酵过程中挖块接种与菌丝接种的糖耗速率相当，孢子接种的糖耗速率最快；如图3所示，挖块接种在前中期(200h前)还原糖浓度一直处于上升时期，峰值最高，孢子接种在前期上升，中期(100h后)的早期开始缓慢下降，中间有一短暂的平稳期，菌丝接种在前期还原糖浓度上升最慢，峰值与孢子接种相当，但上升期比孢子接种长。
如图4表明在前期氨基氮的消耗速率挖块接种稍快于孢子接种，但在165h左右，挖块接种与菌丝接种的氨基氮浓度已开始回升，此时孢子接种的氨基氮浓度仍处于下降期，216h后孢子接种方式的氨基氮也开始回升。如图5所示pH变化趋势基本相同，但变化幅度各有差异，孢子接种不仅在早早期pH回升速度较快，在后面的pH的稳步下降过程中的下降速度也比其它两种接种方式要快，这与菌体的碳氮源消耗与代谢有关。在220h小时左右，pH均大幅度开始回升，菌丝接种的pH回升最快，推测菌丝接种方式在后期最先开始自溶。
挖块接种因延迟期较短，菌体生长很快，总糖和氨基氮前中期消耗速率均比孢子接种快，发酵周期较短；而用孢子接种时，延迟期相对较长，生长达到高峰时间推迟，总糖和氨基氮开始消耗较慢，但孢子接种后劲大，中后期总糖消耗速率最快，糖的利用率也相对要更高，如图6表明采用孢子接种方式阿维菌素的最终效价比对照挖块接种提高了10％以上，比菌丝接种提高了20％以上。菌丝接种在生长快慢上介于挖块接种与菌丝接种之间，效价增长最慢，糖的利用率最低，到发酵终点时效价最低。
因此与挖块接种和菌丝接种相比，孢子接种方式不仅在接种量上易控制，发酵结果较稳定，效价增幅上比挖块接种及菌丝接种有优势。
Claims (7)
1.一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
(1)将阿维链霉菌接种至斜面培养基，在温度27-29℃下，培养7-9天；
(2)取上述的阿维链霉菌孢子斜面，用无菌水振荡洗涤斜面制备成孢子悬浮液；
(3)计算孢子悬浮液中孢子的数量，然后用移液管吸取孢子悬浮液至种子培养摇瓶中的种子培养基中，使每毫升种子培养基的孢子接种量为4×107-6×107个，种子培养摇瓶装量为30-50m1种子培养基/250ml摇瓶；
(4)将步骤(3)的孢子悬浮液进行摇床培养，在温度27-29℃下，转速为200-300r/mim的旋转式摇床上培养40-48小时，得到全孢子液；
(5)取上述的全孢子液，按培养基体积3％-7％的接种量，接种到发酵培养基中，进行摇床培养，发酵摇瓶装量为20-40ml发酵培养基/250ml摇瓶，在温度27-29℃下和湿度40％-50％下，转速为200-300r/mim的旋转式摇床上培养240-260小时，得到含有阿维菌素的发酵液；
上述的斜面培养基组分重量百分比为：酵母膏0.1％、麦芽糖0.1％、胰蛋白胨0.2％、葡萄糖0.4％、琼脂粉2％和蒸馏水余量，并使pH值调至7.2；
上述的种子培养基含有：玉米淀粉30g/L、玉米浆5g/L、酵母膏15g/L、KH2PO44g/L和MgSO4·7H2O 0.2g/L，并调PH为7.0-7.2；
上述的发酵培养基含有：玉米淀粉120g/L、酵母粉15g/L、豆粕粉5g/L、花生饼粉5g/L和KH2PO40.5g/L，并调PH为7.0-7.2。
2.如权利要求1所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于步骤(3)中用采用血球记数板计算孢子悬浮液中孢子的数量，每毫升种子培养基的孢子接种量为4×107-5×107个，种子培养摇瓶装量为30-40ml种子培养基/250ml摇瓶。
3.如权利要求1所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于步骤(3)中每毫升种子培养基的孢子接种量为5×107-6×107个，种子培养摇瓶装量为40-50ml种子培养基/250ml摇瓶。
4.如权利要求1所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于步骤(4)中摇床培养条件为：温度为27-28℃，摇床转速为230-270r/mim，培养时间为42-46小时。
5.如权利要求1所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于步骤(4)中摇床培养条件为：温度为28-29℃，摇床转速为240-260r/mim，培养时间为43-45小时。
6.如权利要求1所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于步骤(5)中摇床培养条件为：种子摇瓶装量为25-35ml发酵培养基/250ml摇瓶，接种量为3-5％，温度为27-28℃，摇床转速为230-270r/mim，培养时间为245-255小时。
7.如权利要求1所述的一种采用全孢子接种工艺生产阿维菌素的方法，其特征在于步骤(5)中摇床培养条件为：种子摇瓶装量为28-32ml发酵培养基/250ml摇瓶，接种量为5-7％，温度为28-29℃，摇床转速为240-260r/mim，培养时间为247-253小时。
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