JPH048039B2 - - Google Patents

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JPH048039B2
JPH048039B2 JP60107922A JP10792285A JPH048039B2 JP H048039 B2 JPH048039 B2 JP H048039B2 JP 60107922 A JP60107922 A JP 60107922A JP 10792285 A JP10792285 A JP 10792285A JP H048039 B2 JPH048039 B2 JP H048039B2
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menaquinone
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Susumu Tomohiro
Shizuko Shirasago
Takemitsu Arai
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KH Neochem Co Ltd
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/66—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing the quinoid structure
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    • Y10S435/843—Corynebacterium

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、生体の血液凝固やカルシウム代謝の
調節に関与する重要な生理活性物質であり、下記
式で示されるメナキノン−４の新規な工業的製法
を提供する。
従来の技術 メナキノン−４の製造法としては、合成法、動
植物組織または微生物菌体からの抽出法が知られ
ている。
細菌では、グラム陽性菌のフラボバクテリウ
ム・メニンゴセプチクムを用いるビタミンK2（メ
ナキノン−４）の生産が知られている〔ジヤーナ
ル・オブ・フアーメンテーシヨン・テクノロジイ
（J.Ferment.Technol.），62，321−327，1984〕。
本発明者は、先にグラム陽性のコリネフオーム
型細菌の一部がメナキノン−４を著量に蓄積する
ことを見い出した〔特願昭60−14667（特開昭61−
173792）〕。
発明が解決しようとする問題点 従来の方法はいずれもコスト高であり、メナキ
ノン−４をさらに安価に製造できる方法の開発が
望まれる。
問題点を解決するための手段 本発明者は、メナキノン−４を工業的にさらに
有利に製造する方法について、研究を行つた結
果、アースロバクター属に属し、メナキノン−４
生産能を有する微生物のカロチノイド色素生成変
異株がより優れたメナキノン−４生産能を有する
ことを見い出し、本発明を完成した。
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明はアースロバクター属に属し、メナキノ
ン−４生産能を有する微生物のカロチノイド色素
生成変異株を培地に培養し、培養物中にメナキノ
ン−４を蓄積させ、該培養物より蓄積したメナキ
ノン−４を採取することを特徴とする発酵法によ
るメナキノン−４の製造法を提供する。
本発明に使用する微生物としては、アースロバ
クター属に属し、メナキノン−４生産能を有する
微生物のカロチノイド色素生成変異株であればい
ずれでも使用することができる。
本発明に使用する微生物は、メナキノン−４生
産能を有する微生物に変異処理を施して、カロチ
ノイド色素生成変異株を誘導することによつて得
ることができる。
変異処理としては、通常の変異処理法、例え
ば、紫外線照射、またはＮ−メチル−N′−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）、亜硝酸な
どの化学処理を施す常法が採用される。
本発明に使用する好適な微生物として、通常の
培地、培養条件で培養物中に少なくとも10mg／
のカロチノイドを蓄積する能力を有するものが挙
げられる。具体例としては、メナキノン−４生産
能を有するコリネバクテリウム・リケフアシエン
ス（アースロバクター・ニコテイアナエ）
（Corynebacterium liquefaciens〔アースロバク
ター・ニコテイアナエ（Arthrobacter
nicotianae）と改名〕ATCC14929から誘導した
コリネバクテリウム・リケフアシエンスKS−８
−18が挙げられる。
次にこのような微生物を得る具体的な操作例を
説明する。
＜操作例＞ ブイヨン培地（肉エキス1g／ｇ、ペプトン
1g／dl、NaCl0.3g／dl、PH7.2）で28℃、１夜振
盪培養したコリネバクテリウム・リケフアシエン
ス（アースロバクター・ニコテイアナエ）
ATCC14929（メナキノン−４生産能を有する親
株）を集菌し、0.05Mトリスマレエート緩衝液で
洗浄した。菌体をＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン200μg／mlで溶解した同緩
衝液に懸濁し、30℃で２〜３時間インキユベート
した。同緩衝液で２度洗浄後、その洗浄菌体をブ
イヨン培地で28℃で２時間振盪培養を行つた。集
菌後、同緩衝液で１度洗浄した。ついで、同緩衝
液に約103〜104菌体／mlになるように懸濁した。
上記懸濁液0.1mlを最少培地寒天平板（グルコー
ス1g／dl、塩化アンモニウム0.5g／dl、尿素
0.2g／dl、リン酸一カリウム0.1g／dl、リン酸二
カリウム0.3g／dl、硫酸第一鉄１mg／dl、硫酸マ
グネシウム・７水塩50mg／dl、硫酸マンガン0.4
mg／dl、硫酸銅・５水塩0.1mg／dl、ビオチン
3μg／dl、ビタミンB10.5mg／dl、システイン２
mg／dl、寒天2g／dl、PH7.2）に塗布し、28℃で
３〜４日間培養後、出現した集落のうち親株と比
べて明らかに赤色の色素を生成しているものを、
カロチノイド色素生成変異株として選択した。変
異株中、メナキノン−４生産能の最も高いものを
選び、これをコリネバクテリウム・リケフアシエ
ンス（アースロバクター・ニコテイアナエ）KS
−８−18と命名した。
コリネバクテリウム・リケフアシエンス（アー
スロバクター・ニコテイアナエ）KS−８−18は
昭和60年５月15日付で工業技術院微生物工業技術
研究所（微工研）に寄託されており、その寄託番
号は、FERM Ｐ−8232である。
本発明に用いる培地としては、炭素源、窒素
源、無機物、その他の栄養物を適当に含有する培
地ならば合成培地、天然培地のいずれでも使用で
きる。
具体的には、炭素源としてグルコース、シユー
クロース、マルトース、グリセリン、ソルビツ
ト、マンニツト、糖密、有機酸、脂肪酸などを単
独または組み合わせて用いることができる。窒素
源としては、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキ
ス、肉エキス、カゼイン加水分解物、コーンスチ
ープリカー、大豆粕、無機および有機アンモニウ
ム塩などを単独あるいは組み合わせて用いること
ができる。無機塩としては、リン酸塩、マグネシ
ウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、ナト
リウム塩、カリウム塩などを用いる。
その他の微量元素として各種のビタミン例えば
チアミン、ニコチン酸、ビオチン、パントテン酸
などを用いる。
メナキノン−４生合成前駆物質およびその関連
物質を培地に添加することにより、メナキノン−
４生成量が増加する場合がある。
培養は、振盪培養、通気撹拌培養などの好気的
条件下で行う。
培養温度は、20〜40℃、好ましくは25〜35℃が
適当である。培養中、培養液のPHは５〜９、好ま
しくは７前後に保持するのがよい。
PH調整剤としては、アンモニア水、水酸化ナト
リウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、リン
酸マグネシウム、尿素などを用いる。
培養期間は通常３〜７日間である。メナキノン
−４は培養液中および菌体中の両方に蓄積する
が、大部分は菌体中に蓄積する。
培養物からのメナキノン−４の単離は、メタノ
ール、エタノール、アセトン、クロロホルムなど
の単独あるいは混合溶媒を用いて、メナキノン−
４含有抽出物を得、これを有機溶媒による分配抽
出、シリカゲル、アルミナ、セフアデツクスなど
によるカラムクロマトグラフイーおよび薄層クロ
マトグラフイーなどを組み合わせて精製すること
ができる。試料中のメナキノン−４の定量は
Shimpack ODS、Zorbax ODS、Unisil NQC−
18などを用いる逆相分配型の高速液体クロマトグ
ラフイーを利用する。
以下に本発明の実施例を挙げて、本発明を具体
的に示す。
実施例 １ ペプトン1g／dl、肉エキス1g／dl、
NaCl0.3g／dlの組成よりなるPH7.2の種培地300
mlを２容三角フラスコに入れて殺菌した。
これにコリネバクテリウム・リケフアシエンス
（アースロバクター・ニコテイアナエ）KS−８−
18を接種し、28℃、24時間振盪培養した。該培養
液300mlを下記の組成の発酵培地３を含む５
容ジヤーフアーメンターに移し、400rpmの回転
数、１分間当り３の通気、温度28℃の培養条件
下で５日間培養した。
このときメナキノン−４の生成量は36mg／
で、カロチノイドの生成量は55mg／であつた。
菌体抽出液の色は濃赤橙色を呈した。
ついで培養液２を遠心分離し、乾燥重量とし
て43gに相当する菌体を得た。これに400mlのメ
タノールを加えて55℃で３回抽出した。その抽出
液を濃縮して得られた油状物に250mlのヘキサン
を加えて不溶物を過した。液に7gのシリカ
ゲルを加えて撹拌し、目的物をシリカゲルに吸着
させた。非吸着物を洗い出した後、酢酸エチル50
mlを用いて、目的物を溶出した。溶出液を減圧濃
縮し、油状物120mgを得た。
次にこの油状物を７mlのアセトンに溶かし、こ
のアセトン溶液をシリカゲル薄層60F254（メルク
社製）（７枚）にスポツトし、トルエン：酢酸エ
チル（９：１）を用いて展開した。Rf値80の紫
外部吸収を示す部分を削りとり、アセトンで抽
出、濃縮後、再びアセトン3.5mlに溶解した。こ
れをあらかじめパラフインを浸漬したシリカゲル
60F254（メルク社製）（７枚）にスポツトし、アセ
トン：水（95：５）で展開し、メナキノン−４の
標準品と一致するRf値62の部分を削りとり、ア
セトン抽出、濃縮を行い30mgのメナキノン−４を
得た。
これは、逆相薄層クロマトグラフイー、高速液
体クロマトグラフイーなどによりメナキノン−４
であることを確認した。
一方、シユークロース3g／dl、イーストエキ
ス2g／dl、リン酸−カリウム0.1g／dl、リン酸二
カリウム0.05g／dl、硫酸マグネシウム・７水塩
0.1g／dl、硫酸アンモニウム0.25g／dl、炭酸カ
ルシウム0.5g／dl、硫酸第一鉄0.1mg／dlの組成
よりなる発酵培地（PH7.2）を用い、同じ条件で
コリネバクテリウム・リケフアシエンス（アース
ロバクター・ニコテイアナエ）ATCC14929を培
養した。そのときのメナキノン−４の生成量は
5.3mg／で菌体抽出液の色は淡黄色を呈し、カ
ロチノイドの副生は、１mg／であつた。
以上のように、本発明のカロチノイド色素生成
変異株は、親株に比べて極めて著量のカロチノイ
ドを生成すると同時に、極めて著量のメナキノン
−４を生成することが明らかになつた。
発明の効果 本発明方法によれば、メナキノン−４の発酵生
産を著しく向上させることができるので、メナキ
ノン−４を大量に安価に供給することができる。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ アースロバクター属に属し、メナキノン−４
    生産能を有する微生物のカロチノイド色素生成変
    異株を培地に培養し、培養物中にメナキノン−４
    を蓄積させ、該培養物より蓄積したメナキノン−
    ４を採取することを特徴とする発酵法によるメナ
    キノン−４の製造法。
JP60107922A 1985-05-20 1985-05-20 発酵法によるメナキノン−４の製造法 Granted JPS61265097A (ja)

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US06/863,008 US4849354A (en) 1985-05-20 1986-05-14 Process for producing menaquinone-4
DE8686106639T DE3667796D1 (de) 1985-05-20 1986-05-15 Verfahren zur herstellung von menachinon-4.
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EP0202613B1 (en) 1989-12-27
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