JPS61173792A - メナキノン−4の製造法 - Google Patents

メナキノン−4の製造法

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JPS61173792A
JPS61173792A JP1466785A JP1466785A JPS61173792A JP S61173792 A JPS61173792 A JP S61173792A JP 1466785 A JP1466785 A JP 1466785A JP 1466785 A JP1466785 A JP 1466785A JP S61173792 A JPS61173792 A JP S61173792A
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menaquinone
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高山 健一郎
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新井 雄光
Susumu Tomohiro
友弘 進
Shizuko Shirasago
白砂 静子
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KH Neochem Co Ltd
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はメナキノン−4(以下、MK−4と称す)の製
造法に関する。
MK−4は、式 で示される生体の血液凝固やカルシウム代謝調節に関与
するビタミンに2である。
従来の技術 細菌に含まれているメナキノンに関しては、分類学的見
地から詳細に検討されており、M、D、Co11ins
およびり、 Jonesによって総説がまとめられてい
る(Microbiol、’Rev、、 45 :31
6−354.1981)。しかしながらMK−4が主た
るメナキノンとして著量に含有されている細菌は見当た
らない。最近、谷ら(J、 ferment、  Te
chnol、、 62 : 321−327.1984
)により、ダラム陽性細菌であるフラボバクテリウム・
メニンゴセプチクムを用いるMK−4の生産が報告され
ている。
発明の目的 フラボバクテリウム・メニンゴセプチクム(グラム陽性
菌)以外の微生物でMK−4を製造する微生物を見い出
した。
間 点を解決するための手段 本発明方法によると、コリネバクテリウム属、ブレビバ
クテリウム属、ミクロバクテリウム属、クルトバクテリ
ウム属、オーレオバクテリウム属又はグラム陽性のフラ
ボバクテリウム属に属する微生物を用いることにより収
率よ<MK−4を製造することができる。
本発明に用いる微生物としては、コリネバクテリウム属
、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、タル
トバクテリウム属、オーレオバクテリウム属又はダラム
陽性のフラボバクテリウム属に属し、MK−4を生産し
つる微生物であればいずれも用いられ、具体的には、コ
リネバクテリウム’ !1 ケア 7 シ! 7:7、
 (Corynebacterium l1que−f
aciens)ATCC14929、コリネバクテリウ
ム・アカティクム(Corynebacterium 
aquaticum)ATCC14665、コリネバク
テリウム・コリニフィラム(Corynebacter
ium choliniphilum) NRRL B
−11157、コリネバクテリウム・ムリセプティクム
(Coryne−bacterium murisep
ticum) ATCC21374、ミクロバクテリウ
ム・ラフティクム(Microbacteriumla
cticum)ATCC8180、ミクロバクテリウム
・インペリアレ(Microbacterium im
periale)(旧ブレビバクテリウム・インペリア
レ)ATCC8365、ミクロバクテリウム・アルボレ
センス(Microbacte−riu+n arbo
rescens) (旧ブレビバクテリウム・アルボレ
センス)ATCC4358、クルトバクテリウム・シト
レウム(Curtobacterium citreu
m) (旧ブレビバクテリウム・シトレウス)ATCC
15B28、オーレオバクテリウム・テスタセウム(A
ureobacter iumtestaceum) 
(旧ブレビバクテリウム・テスタセウム)ATCC15
g29、ブレビバクテリウム・フスクム(Brevib
acterium fuscum) [Fo 1212
7 、ブレビバクテリウム・リネンス(Breviba
cterium 1inens)ATCC9175、フ
ラボバクテリウム・マリノティピクム(Flavoba
cterium marinotypicum) AT
CC19260、コリネバクテリウム・フラベセンス(
F 1avabacte−riu+n flavesc
ens)ATCC8315、フラボバクテリウム・デヒ
ドロゲナンス(Flavobacterium deh
ydro−genans) ATCC13930などが
あげられる。
これらの菌種の菌学的性質については、バージ−のマニ
二アル第7版(1957)、第8版(1974)、山田
・駒形:J、 Gen、Appl、 Microbio
l、、18 : 399−416 (1972)などに
記載されている。
本発明に用いる培地としては、炭素源、窒素源、無機物
、その他の栄養物を適当に含有する培地ならば、合成培
地、天然培地のいずれでも使用可能である。
炭素源としては、例えばグルコース、シュクロース、マ
ルトース、クリセリン、ソルビット、マンニット、糖蜜
、有機酸、脂肪酸などが単独又は組合わせて用いられる
。窒素源としては、例えば硫安、硝安、塩安、リン安、
尿素、アンモニア、アミン類、ペプトン、ポリペプトン
、酵母エキス、肉エキス、カゼイン加水分解物、ヨーン
スチープリカーなどが単独あるいは組合わせて用いられ
る。
無機塩としては、例えばリン酸−カリウム、リン酸二カ
リウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化
ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウ
ムなどが用いられる。その他の微量要素として各種のビ
タミン、例えばチアミン、ニコチン酸、ピオチン、パン
トテン酸などが用いられる。さらにメナキノンの前駆体
であるシキミ酸、1.4−ナフトキノン、2−メチル−
1,4−ナフトキン(ビタミンKs )などを培地は添
加してもよい。
培養条件としては通常の通気攪拌培養が適している。培
養温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃が適当
である。培養時のpHは5〜9好ましくは7前後に保持
する。pHの修正には通常アンモニア水、水酸化ナトリ
ウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウムなどが用いられ
る。
前記条件下で3〜7日培養するとMK−4が菌体内に蓄
積されるので、生成量が最大になった時点で培養を終了
させ適当な手段で集菌し、目的物を分離採取する。例え
ば、メタノール、エタノール、アセシン、クロロホルム
などの単独あるいは混合溶媒を用いてメナキノン含有抽
出物を得、これを有機溶媒による分配抽出、シリカゲル
、アルミナ、セファデックスなどによるカラムクロマト
グラフィー及び薄層クロマトグラフィーなどを組合わせ
て精製することができる。試料中のメナキノンの定量に
は、Zorbax ODS、 l1nisil NQ 
C−18などを用いる逆相分配型の高速液体クロマトグ
ラフィーを利用する。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例1゜ 菌株として、ミクロバクテリウム・ラフティクムATC
C8180を用いた。
イーストブイヨン寒天培地で30℃、24時間培養した
菌体を、グリセリン5%、ペプトン1%、酵母エキス0
.5%、ヨーンスチーブリカ−1%、硫酸マグネシウム
0.01%、硫酸第一鉄0.002%の組成の培地(p
H7,2) 300mlを入れたバッフル付き21三角
フラスコをオートクレーブ殺菌し、それに植菌し、別殺
菌した炭酸カルシウムを2%添加して30℃、20Or
pm、24時間振盪培養した。これを種培養として、上
記組成の培地31を入れた51容ジヤーメアーメンター
をオートクレーブ殺菌し、それに植菌し、通気量2vv
m、攪拌600rpm、温度30℃で培養した。培養2
4時間抜にグリセリン3%、ペプトン0.5%を添加、
また、培養液のpHは2N  NaOHで7.0を維持
するように調整した。培養5日後のMK−4は30mg
/lであった。
この培養液11を遠心分離し、菌体35g(乾燥重量)
を得た。これに30 Qmlのメタノールを加えて55
℃で3回抽出した。抽出液を濃縮して得られた油状物に
20 Qmlのヘキサンを加えて不溶物を枦通し、p液
に5gのシリカゲルを加えて攪拌し目的物をシリカゲル
に吸着させた。非吸着物を洗い出した後、酢酸エチル3
Qmlを用いて目的物を溶出、濃縮を行い油状物を得た
。本島のアセトン溶液をシリカゲル薄層60 F254
(5枚) にスポットシ、ベンゼン:酢酸エチル(9:
 1 v/v)を用いて展開した。Rf値80の紫外部
吸収を示す部分を削りとり、アセトンで抽出、濃縮後、
再びアセトンに溶解した。本島をあらかじめパラフィン
で処理した上記シリカゲル薄層(5枚)にスポットし、
アセトン:水(95: 5 V/V)で展開し、MK−
4の標準品と一致するRFe5の部分を削りとり、アセ
トン溶出、濃縮を行い、24■のM K−4を得た。こ
の物質の融点は35.1℃であった。また、マススペク
トルおよび核磁気共鳴スペクトルによって、得られた物
質がMK−4であることを確認した。
実施例2゜ グリセリンまたはシュクロースまたはグルコース5%、
ペプトン1%、酵母エキス0.5%、コーンスチープリ
力−1%の組成を有し、p H7,2に調整した培地2
0ITllを邪魔板をつけた3 0 Qmlの三角フラ
スコに入れ、120℃で15分間殺菌した。これにイー
ストブイヨン寒天培地で30℃、24時間培養した第−
表に示す菌を1白金耳植菌し、さらに、別に乾熱殺菌し
た炭酸カルシウムを2%添加して、30℃、22Orp
mで振盪培養を行った。5日間培養後の培養液のMK−
4の含・量は第1表に示すとおりであった。
第1表 コリネバクテリウム・リケファシエンス  ATCC1
4929B            7.2コリネバク
テリウム・アカティクム  ATCC14665A  
          3.5コリネバクテリウム・ムリ
セブティクム  ATCC21374B       
     2.5コリネバクテリウム・コリニフィラム
  NRRL  B−11157B         
   2.8ミクロバクテリウム・ラフティクム  A
TCC8180C15,0ミクロバクテリウム・インベ
リアレ  ATCC8365C4,5ミクロバクテリウ
ム・アルポレセンス  ATCC4358B     
       8.6クルトバクテリウム・シトレウム
  ATCC15828C3,6トレtバクテリウム・
テスタセウム  ATCC15829B       
    10.5ブレビバクテリウム・フスクム  I
FO12127C4,0ブレビバクテリウム・リネンス
  ATCC9175C2,4フラボバクテ:;ラム・
マリノテイビクム  ATCC19260B     
      12.0フラボバクテリウム・フラベセン
ス  ATCC8315B            6
.5フラボバクテリウム・デヒドログナンス  ATC
C13930C3,2本発明方法により収率よ<MK−
4を得ることができる。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロ
    バクテリウム属、クルトバクテリウム属、オーレオバク
    テリウム属又はグラム陽性のフラボバクテリウム属に属
    し、メナキノン−4生産能を有する微生物を栄養培地に
    培養し、培養物中にメナキノン−4を生成させ、培養物
    よりこれを採取することを特徴とするメナキノン−4の
    製造法。
JP1466785A 1985-01-29 1985-01-29 メナキノン−4の製造法 Granted JPS61173792A (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61216696A (ja) * 1985-03-19 1986-09-26 Mitsubishi Gas Chem Co Inc メナキノン−4の製造法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61216696A (ja) * 1985-03-19 1986-09-26 Mitsubishi Gas Chem Co Inc メナキノン−4の製造法
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