JPH0367674B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明はメナキノン−４（以下、MK−４と称
す）の製造法に関する。 MK−４は、式 で示される生体の血液凝固やカルシウム代謝調節
に関与するビタミンK₂である。 従来の技術 細菌に含まれているメナキノンに関しては、分
類学的見地から詳細に検討されており、M.D.
CollinsおよびD.Jonesによつて総説がまとめられ
ている（Microbiol.Rev.，45：316−354、1981）。
しかしながらMK−４が主たるメナキノンとして
著量に含有されている細菌は見当たらない。最
近、谷ら（J.Ferment.Technol.，62：321−327、
1984）により、グラム陰性細菌であるフラボバク
テリウム・メニンゴセプチクムを用いるMK−４
の生産が報告されている。 発明の目的 フラボバクテリウム・メニンゴセプチクム（グ
ラム陰性菌）以外の微生物でMK−４を製造する
微生物を見い出した。 問題点を解決するための手段 本発明方法によると、アースロバクター属、コ
リネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミ
クロバクテリウム属、クルトバクテリウム属、オ
ーレオバクテリウム属又はグラム陽性のフラボバ
クテリウム属に属する微生物を用いることにより
収率よくMK−４を製造することができる。 本発明に用いる微生物としては、アースロバク
ター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリ
ウム属、ミクロバクテリウム属、クルトバクテリ
ウム属、オーレオバクテリウム属又はグラム陽性
のフラボバクテリウム属に属し、MK−４を生産
しうる微生物であればいずれも用いられ、具体的
には、アースロバクター・ニコテイアナエ
（Arthrobacter nicotianae）（旧コリネバクテリ
ウム・リケフアシエンス）ATCC14929、コリネ
バクテリウム・アカテイクム（Corynebacterium
aquaticum）ATCC14665、コネリバクテリウ
ム・コリニフイラム（Corynebacterium
choliniphilum）NRRL Ｂ−11157、コリネバク
テリウム・ムリセプテイクム（Corynebacterium
murisepticum）ATCC21374、ミクロバクテリウ
ム・ラクテイクム（Microbacterium lacticum）
ATCC8180、ミクロバクテリウム・インペリアレ
（Microbacterium imperiale）（旧ブレビバクテ
リウム・インペリアレ）ATCC8365、ミクロバク
テリウム・アルボレセンス（Microbacterium
arborescens）（旧ブレビバクテリウム・アルボレ
センス）ATCC4358、クルトバクテリウム・シト
レウム（Curtobacterium citreum）（旧ブレビバ
クテリウム・シトレウス）ATCC15828、オーレ
オバクテリウム・テスタセウム
（Aureobacterium testaceum）（旧ブレビバクテ
リウム・テスタセウム）ATCC15829、ブレビバ
クテリウム・フスクム（Brevibacterium
fuscum）IFO12127、ブレビバクテリウム・リネ
ンス（Brevibacterium linens）ATCC9175、フ
ラボバクテリウム・マリノテイプクム
（Flavobacterium marinotypicum）
ATCC19260、フラボバクテリウム・フラベセン
ス（Flavabacterium flavescens）ATCC8315、
フラボバクテリウム・デヒドロゲナンス
（Flavobacterium dehydrogenans）ATCC13930
などがあげられる。 これらの菌種の菌学的性質については、バージ
ーのマニユアル第７版（1957）、第８版（1974）、
山田・駒形：J.Gen.Appl.Microbiol.，18：399−
416（1972）などに記載されている。 本発明に用いる培地としては、炭素源、窒素
源、無機物、その他の栄養物を適当に含有する培
地ならば、合成培地、天然培地のいずれでも使用
可能である。 炭素源としては、例えばグルコース、シユクロ
ース、マルトース、グリセリン、ソルビツト、マ
ンニツト、糖密、有機酸、脂肪酸などが単独又は
組合わせて用いられる。窒素源としては、例えば
硫安、硝安、塩安、リン安、尿素、アンモニア、
アミン類、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキ
ス、肉エキス、カゼイン加水分解物、コーンスチ
ープエリカーなどが単独あるいは組合わせて用い
られる。無機塩としては、例えばリン酸−カリウ
ム、リン酸二カリウム、リン酸マグネシウム、硫
酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、
硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが用いられ
る。その他の微量要素として各種のビタミン、例
えばチアミン、ニコチン酸、ビオチン、パントテ
ン酸などが用いられる。さらにメナキノンの前駆
体であるシキミ酸、１，４−ナフトキノン、２−
メチル−１，４−ナフトキン（ビタミンK₃）な
どを培地は添加してもよい。 培養条件としては通常の通気撹拌培養が適して
いる。培養温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃
が適当である。培養時のPHは５〜９好ましくは７
前後に保持する。PHの修正には通常アンモニア
水、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カ
ルシウムなどが用いられる。 前記条件下で３〜７日培養するとMK−４が菌
体内に蓄積されるので、生成量が最大になつた時
点で培養を終了させ適当な手段で集菌し、目的物
を分離採取する。例えば、メタノール、エタノー
ル、アセトン、クロロホルムなどの単独あるいは
混合溶媒を用いてメナキノン含有抽出物を得、こ
れを有機溶媒による分配抽出、シリカゲル、アル
ミナ、セフアデツクスなどによるカラムクロマト
グラフイー及び薄層クロマトグラフイーなどを組
合わせて精製することができる。試料中のメナキ
ノンの定量には、Zorbax、ODS、Unisli NQ Ｃ
−18などを用いる逆相分配型の高速液体クロマト
グラフイーを利用する。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例 １ 菌株として、ミクロバクテリウム・ラクテイク
ムATCC8180を用いた。 イーストブイヨン寒天培地で30℃、24時間培養
した菌体を、グリセリン５％、ペプトン１％、酵
母エキス0.5％、コーンスチープリカー１％、硫
酸マグネシウム0.01％、硫酸第一鉄0.002％の組
成の培地（PH7.2）300mlを入れたバツフル付き２
三角フラスコをオートクレーブ殺菌し、それに
植菌し、別殺菌した炭酸カルシウムを２％添加し
て30℃、200rpm、24時間振盪培養した。これを
種培養として、上記組成の培地３を入れた５
容ジヤーメアーメンターをオートクレーブ殺菌
し、それに植菌し、通気量2vvm、撹拌600rpm、
温度30℃で培養した。培養24時間目にグリセリン
３％、ペプトン0.5％を添加、また、培養液のPH
は2N NaOHで7.0を維持するように調整した。
培養５日後のMK−４は30mg／であつた。 この培養液１を遠心分離し、菌体35ｇ（乾燥
重量）を得た。これに300mlのメタノールを加え
て55℃で３回抽出した。抽出液を濃縮して得られ
た油状物に200mlのヘキサンを加えて不溶物を
過し、液に５ｇのシリカゲルを加えて撹拌し目
的物をシリカゲルに吸着させた。非吸着物を洗い
出した後、酢酸エチル30mlを用いて目的物を溶
出、濃縮を行い油状物を得た。本品のアセトン溶
液をシリカゲル薄層60F₂₅₄（５枚）にスポツトし、
ベンゼン：酢酸エチル（９：1v／ｖ）を用いて
展開した。Rf値80の紫外部吸収を示す部分を削
りとり、アセトンで抽出、濃縮後、再びアセトン
に溶解した。本品をあらかじめパラフインで処理
した上記シリカゲル薄層（５枚）にスポツトし、
アセトン：水（95：5v／ｖ）で展開し、MK−４
の標準品と一致するRf62の部分を削りとり、ア
セトン溶出、濃縮を行い、24mgのMK−４を得
た。この物質の融点は35.1℃であつた。また、マ
ススペクトルおよび核磁気共鳴スペクトルによつ
て、得られた物質がMK−４であることを確認し
た。 実施例 ２ グリセリンまたはシユクロースまたはグルコー
ス５％、ペプトン１％、酵母エキス0.5％、コー
ンスチープリカー１％の組成を有し、PH7.2に調
整した培地20mlを邪魔板をつけた300mlの三角フ
ラスコに入れ、120℃で15分間殺菌した。これに
イーストブイヨン寒天培地で30℃、24時間培養し
た第一表に示す菌を１白金耳植菌し、さらに、別
に乾熱殺菌した炭酸カルシウムを２％添加して、
30℃、220rpmで振盪培養を行つた。５日間培養
後の培養液のMK−４の含量は第１表に示すとお
りであつた

【表】 発明の効果 本発明方法により収率よくMK−４を得ること
ができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アースロバクター属、コリネバクテリウム
   属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム
   属、クルトバクテリウム属、オーレオバクテリウ
   ム属又はグラム陽性のフラボバクテリウム属に属
   し、メナキノン−４生産能を有する微生物を栄養
   培地に培養し、培養物中にメナキノン−４を生成
   させ、培養物よりこれを採取することを特徴とす
   るメナキノン−４の製造法。