JPH0523749B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物によるメナキノン−４の製造
法に関する。メナキノン−４は、医薬用のビタミ
ンK₂として知られており、血液の凝固を促進す
る脂溶性ビタミンで抗出血性作用を有する重要な
生理活性物質である。 〔従来技術、発明が解決しようとする問題点〕 メナキノン−４の製造法としては、合成法およ
び動植物組織からの抽出法が知られているが、合
成法は原料の入手が困難な上コスト高であり、又
動植物組織からの抽出法も資源が限られ抽出操作
が煩雑なことも加わつてコスト高をまぬがれな
い。 反面、メナキノン−４を生産する微生物を見出
すことが出来れば、微生物を工業的に大量に生産
できるので、非常に有利であるが、今までメナキ
ノン−４を効率的に生産する微生物は見出されて
いない。 本発明は、前記の事情に鑑みてなされたもの
で、微生物によるメナキノン−４の生産を目的と
するものである。 〔問題点を解決するための手段〕 前記目的を達成すべく、本発明者が鋭意検討を
重ねた結果、フラボバクテリウム アクアタイル
（Flavobacterium aquatile）に属しメナキノン
−４を生産しない菌株を親株として、変異処理を
行ない、メナキノン−４を生産する菌株を得るこ
とに成功し、本発明を完成した。 すなわち本発明は、フラボバクテリウム アク
アタイル（Flavobacterium aquatile）に属しメ
ナキノン−４を生産する微生物を培養して、メナ
キノン−４を菌体内に生成せしめ、これを採取す
ることを特徴とするメナキノン−４の製造法であ
る。 変異処理を行なう親株としては、フラボバクテ
リウム アクアタイル（Flavobacterium
aquatile）に属しメナキノン−５以上の側鎖にイ
ソプレン単位５以上を有するメナキノン生産微生
物が用いられる。これらフラボバクテリウム ア
クアタイル（Flavobacterium aquatile）に属す
るすべてのメナキノン生産微生物を親株としてこ
れを変異処理することにより、メナキノン−４を
生産する変異株を取得することは可能である。 変異処理方法としては、通常行なわれている方
法でよいが、就中、UV処理、Ｎ−メチル−N′−
ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）処理
およびエチルメタノサルフアネート（EMS）処
理などが好ましい。 変異処理した後のメナキノン−４生産変異株の
取得は、いろいろな方法−たとえばランダムスク
リーニング法、あるいは薬剤耐性株、薬剤感受性
株からのスクリーニング等の方法により行なうこ
とができる。薬剤としては、通常はメナキノン生
合成阻害物質が使用されるが、メナキノン生合成
阻害物質としてたとえば１−ヒドロキシ−２−ナ
フトエ酸、ウスニン酸およびメナジオン等があ
る。 メナキノン−４生産株を得る方法を以下に記
す。親株として、フラボバクテリウム アクアタ
イル（Flavobacterium aquatile）No.238−７（微
工研菌寄第8113号）を用いた。本菌株は、自然界
より新たに分離した菌株であるが、その分類学的
特徴からバージエイズ マニユアル オブ シス
テマテイツク バクテリオロジー 第１巻
（1984）によりフラボバクテリウム アクアタイ
ル（Flavobacterium aquatile）と同定した。こ
の菌の菌学的性質は、「ビタミン58巻 p.409〜
419（1984）」に記載されている。 フラボバクテリウム アクアタイル
（Flavobacterium aquatile）No.238−７からたと
えばつぎのようにしてメナキノン−４生産菌が得
られる。すなわちペプトン−グリセロール液体培
地（M31培地）（グリセロール 10ｇ、ポリペプ
トン 15ｇ、酵母エキス １ｇ、K₂HPO₄ ３
ｇ、NaCl ２ｇ、MgSO₄・7H₂Ｏ 0.2ｇ およ
び純水 1000ml、PH7.0）で30℃、24時間生育さ
せたフラボバクテリウム アクアタイル
（Flavobacterium aquatile）No.238−７をＮ−メ
チル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
100μｇ／mlを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH 7.0）
中に10⁸個／mlとなるように懸濁し、30℃30分間
振盪した。その後遠心分離で集菌した菌体を、
0.1Mリン酸緩衝液で洗浄後、同様な緩衝液中に
10⁶／mlとなるように懸濁した。１−ヒドロキシ
−２−ナフトエ酸 350μｇ／mlを含むペプトン
−グリセロール寒天培地（前記ペプトン−グリセ
ロール液体培地に寒天 20ｇ／を添加したも
の）上に上記懸濁液0.1mlを塗布し、出現したコ
ロニーを１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸耐性株
として採取した。これらの耐性株の中からメナキ
ノン−４を生産するフラボバクテリウム アクア
タイル（Flavobacterium aquatile）HNA 250
−15（微工研菌寄第8114号）を得た。さらに、フ
ラボバクテリウム アクアタイル
（Flavobacterium aquatile）HNA 250−15を親
株として、たとえばつぎのようにしてメナキノン
−４の生産性がより高い菌が得られる。すなわち
ペプトン−グリセロール液体培地で30℃、24時間
生育させたフラボバクテリウム アクアタイル
（Flavobacterium aquatile）HNA 250−15を
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）中に10⁸個／mlとなる
ように懸濁させ、UV処理（10w紫外線ランプ２
本、40cm）を30秒間行なつた。ウスニン酸 4μ
ｇ／mlを含むペプトン−グリセロール寒天培地上
に前記処理液0.1mlを塗布し、出現したコロニー
をウスニン酸耐性株として採取した。これらの耐
性株の中から、親株（HNA 250−15）に比べて
明らかに高いメナキノン−４生産性を有するフラ
ボバクテリウム アクアタイル
（Flavobacterium aquatile）USN^r−２（微工研
菌寄第8115号）を得た。 さらに、フラボバクテリウム アクアタイル
（Flavobacterium aquatile）USN^r−２を親株と
して、たとえばつぎのようにしてメナキノン−４
の生産性がさらに一層高い菌が得られた。すなわ
ち変異処理は前記と同様なUV処理とした。メナ
ジオン 20μｇ／mlを含むペプトン−グリセロー
ル寒天培地上に前記処理液0.1mlを塗布し、こゝ
で出現したコロニーをメナジオン耐性株として採
取した。これらの耐性株の中から親株（USN^r−
２）に比べてメナキノン−４生産性が明らかに一
層高いフラボバクテリウム アクアタイル
（Flavobacterium aquatile）K₃−15（微工研菌寄
第8116号）を得た。 これらのメナキノン−４生産微生物を培養する
に当つて用いられる栄養培地は、炭素源、窒素源
および無機塩などを含有する微生物の培養に用い
られる通常の培地が用いられる。 上記炭素源としては、これら微生物が資化しう
るものであればいずれでもよく、グルコース、フ
ラクトース、シユークロース、マルトース、廃糖
蜜、デン粉、デン粉加水分解物等の炭水化物、グ
リセロール、ソルビトール等の糖アルコール、ア
スパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アラニ
ン、グリシン、プロリン、メチオニン等のアミノ
酸類、乳酸、ピルビン酸、酢酸、リンゴ酸、ギ
酸、コハク酸、フマール酸、クエン酸、プロピオ
ン酸、脂肪酸等の有機酸類、エタノール、プロパ
ノール、ブタノール等のアルコール類を単独ある
いは組合わせて使用できる。これらのうち特にグ
リセロールが好ましい。 窒素源としては、硫酸アンモニウム、尿素、硝
酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、ペプト
ン、肉エキス等が用いられる。これらのうちポリ
ペプトンが特に好ましい。 無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム
塩、鉄塩、その他必要に応じて微量金属塩が用い
られ、更にアミノ酸、核酸、ビタミン、酵母エキ
ス、麦芽エキス等生育促進物質も使用される。一
般にKH₂PO₄、NaClおよび酵母エキスをそれぞ
れ添加した場合にはメナキノン−４の含有量は増
大される。又使用菌株が栄養要求性を示す場合に
は、その要求性物質を培地に添加する。 更に、これら微生物の培養に当つて用いられる
上記培地に、イソペンテニルアルコール、ジメチ
ルアリルアルコール、ゲラニオール、フアルネソ
ールなどのアルコール類およびシキミ酸、Ｄ−サ
クシニル安息香酸、Ｌ−チロシン、パラヒドロキ
シフエニルピルビン酸、セダーウツドオイル、α
−ピネン、ジフエニルアミンなどを添加すること
により、無添加に比して菌体内のメナキノン−４
の蓄積量が増大する傾向にある。 微生物の培養はPH５〜8.5、培養温度20〜40℃
で１〜５日間好気的に振盪又は通気攪拌培養する
ことによつて行なわれる。なお通気量は溶存酸素
が制限因子とならぬように十分な量とされる必要
がある。メナキノン−４は微生物菌体中にほとん
ど全て蓄積されるので、培養液を遠心分離、又は
ろ過して菌体を分離した後、菌体から抽出、単離
される。 菌体からメナキノン−４を単離するには、常法
をそのまま適用できる。例えば、生菌体あるいは
乾燥菌体をアセトン中に懸濁し、60℃で２時間抽
出する。この抽出物を濃縮後、エーテルで抽出
し、シリカゲルカラムクロマトグラフイーを行な
い、メナキノン−４画分を分取し、濃縮して得ら
れる。 本発明のメナキノン−４の同定は、高速液体ク
ロマトグラフイー、薄層クロマトグラフイー、
UV及びIRスペクトル、マススペクトル等の結果
からメナキノン−４であることを確認した。又定
量法としては高速液体クロマトグラフイー法を使
用した。 〔実施例〕 以下実施例にて具体的に説明する。 実施例 １ グリセロール 10ｇ／、ポリペプトン 15
ｇ／、酵母エキス １ｇ／、K₂HPO₄２ｇ／
、NaCl ２ｇ／、MgSO₄・7H₂Ｏ 0.2ｇ／
を含有する培地（PH7.0）−グリセロール液体培
地（M31培地）−1.5を３容の小型ジヤーフア
ーメンターに入れ、120℃、30分間加熱殺菌を行
ない、同じ培地を用いて30℃で１日間前培養（フ
ラスコ培養）されたフラボバクテリウム アクア
タイル（Flavobacterium aquatile）K₃−15を接
種し、アンモニア水を添加することによりPHを
7.0に調節しながら、培養温度30℃で通気攪拌培
養を行なつた。対照としてフラボバクテリウム
アクアタイル（Flavobacterium aquatile）238
−７、同HNA 250−15、同USN^r−２を全く同
じ方法で培養した。70時間培養した後の、培養液
及び乾燥菌体１ｇ当りのメナキノン−４の含量を
測定した結果を第１表に示す。

【表】 実施例 ２ グリセロール 50ｇ／、ポリペプトン 20
ｇ／、酵母エキス ３ｇ／、K₂HPO₄６ｇ／
、NaCl ２ｇ／およびMgSO₄・7H₂O0.2
ｇ／を含有する培地（PH7.0）1.5を３容の
小型ジヤーフアーメンターに入れ、120℃、30分
間加熱殺菌を行ない、実施例１のグリセロール培
地を用いて30℃で１日間前培養（フラスコ培養）
されたフラボバクテリウム アクアタイル
（Flavobacterium aquatile）K₃−15を接種し、
アンモニア水を添加することによりPHを7.0に調
節しながら培養温度28℃で通気攪拌培養を行なつ
た。 ７日間培養を行なつたところ、菌体濃度10ｇ／
であり、乾燥菌体１ｇ当りのメナキノン−４含
量は、8.3mg／ｇ・cellであつた。 実施例 ３ 培地に、セダー ウツド オイル（Cedar
woud oil）を0.4ｇ／添加した以外は、実施例
２と同様にしてフラボバクテリウム アクアタイ
ル（Flavobacterium aquatile）K₃−15の培養を
行なつた。培養日数と、菌体濃度、菌体中メナキ
ノン−４含量、培養液中メナキノン生産量の関係
を第２表に示す。

〔発明の効果〕

本発明によれば、医薬品として価値の高いメナ
キノン−４を微生物を培養することにより、容易
に得ることが出来る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ フラボバクテリウム アクアタイル
   （Flavobacterium aquatile）に属しメナキノン
   −４を生産する能力を有する微生物を培養してメ
   ナキノン−４を菌体内に生成せしめ、これを採取
   することを特徴とするメナキノン−４の製造法。