JPS5937949B2

JPS5937949B2 - コエンチ−ムｑ↓１↓０の製造法

Info

Publication number: JPS5937949B2
Application number: JP52158202A
Authority: JP
Inventors: 「あきら」古屋; 和美荒木; 肇好田; 正裕杉本
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1977-12-27
Filing date: 1977-12-27
Publication date: 1984-09-12
Also published as: JPS5489086A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、コエンチームＱ１ｏ生成能を有する微生物を
培地に培養してコエンチームＱ１ｏを製造する方法にお
いて、コエンチームＱ１ｏの生合成前駆物質あるいはそ
の代謝関連物質、またはそれらの物質を含有する天然あ
るいはその処理物を培地中に存在させて培養することを
特徴とするコエンチームＱＩＯの製造法に関する。

コエンチームＱ１ｏ（以下「ＣｏＱ１贋という）は、広
く生物界に分布し、電子伝達系において重要な機能を持
つことが知られているが、最近、本物質が、心不全症、
筋シフドロフィー症その他の疾病に対し、顕著な薬理効
果を有することが明らかとなった。

Ｃ０Ｑｔｏを生成蓄積することの知られている微生物と
しては、バラコツカス・デニトリフィカンス（Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６３、２’０７、１９
６８）、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ｂｉ
ｏｃｈ−ｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌｌ１１、４
６１、１９６９）、シュウトモナス・デニトリフィ
カンス（ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ＆Ｂ１ｏｐｈｙｓｉｃｓ８９、３１８
゜１９６０）、ロドスピリルム属（Ｂ１ｏｃｈｅｒｎ
１ｃａｌＪｏｕｒｎａ１９６、６８８、１９６５
）、ロドシュードーＥナス属（同上）、ロドミクロビ
ウム属洞上）細菌、ロドトルラ属（特公昭４８−８８３
６号公報）、クリプトコツカス属（同上）、スポロボロ
ミセス属（同上）オオスポリデイウム属（特開昭５２−
１０５２８８号公報）、スポリデイオボラス属（同上）
酵母などが知られている。

本発明者らは工業的に有利なＣｏＱｌｏの製造法につい
て研究を行なった結果、ＣｏＱ１ｏ生成能を有する微生
物を培養して、ＣｏＱｌｏを製造するに際し、培地中に
Ｃ０Ｑｔｏの生合成前駆物質あるいはその代謝関連物質
、またはそれらの物質を含有する天然物あるいはその処
理物を培地中に存在せしめて培養したときＣ０ＱＩＯの
生成量が著しく向上することを見出し本発明を完成する
に到った。

従来、カンデイダ属酵母を用いるコエンチームＱｎ生産
に際して、ｐ−ハイドロキシ安息香酸の培地中への添加
がコエンチームＱｎ生成収率を向上せしめることが知ら
れている（特公昭４７−２０３９６号公報）。

しかし、このカンデイダ属の生産するコエンチームＱｎ
はｎ＝９であることがわかっており（Ｊ、Ｆｅｒｍｅ
ｎｔＴｅｃｈｎｏｌ、ＶＯＩ。

４７、漸９、ｐ、５４２−５５０．１９６９）。

Ｃ０ＱＩＯの微生物による生産に際して、上記したごと
き物質の存在がＣｏＱ＋０の生成量を向上せしめるとい
う知見は、本発明者らにより初めて見出されたものであ
る。

以下本発明について詳細に説明する。

本発明によれば、Ｃ０Ｑ１ｏ生成能を有する微生物を培
地に培養してＣｏＱｌｏを生成せしめるに際し、培地中
にＣ０Ｑ１ｏの生合成前駆物質あるいはその代謝関連物
質、またはそれらの物質を含有する天然物あるいはその
処理物を培地中に存在せしめて培養を行えば、ＣｏＱｌ
ｏの生成量を顕著に増大せしめることができる。

本発明に使用する微生物はＣ０Ｑｔｏ生成能を有する微
生物であればいかなる菌株でもよいが、バラコツカス属
、アゲ吊バクテリウム属、シュードモナス属、ロドスピ
リルム属、ロドシュードモナス属、ロドミクロビウム属
、ロドトルラ属、クリプトコツカス属、スポロボロミセ
ス属、オオスポリデイウム属またはスポリデイオボラス
属に属する菌株が好適である。

より好適にはバラコツカス・デニトリフィカンス、アグ
ロバクテリウム・ツメファシェンス、ロドトルラ・ルブ
ラなどに属する菌株が用いられる。

具体的な菌株の一例としてはバラコツカス・デニトリフ
ィカンスＡＴＣＣ１９３６７、アグロバクテリウム・ツ
メファシェンスＡＴＣＣ４４５２およびロドトルラ・ル
ブラＡＴＣＣ２０２５８が挙げられる。

バラコツカス・デニトリフィカンスおよびアグロバクテ
リウム・ツメファシェンスの菌学的性質はＢｅｒｇｅｙ
’ｓＭａｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖ
ｅＢａｃ−ｔｅｒｉｏ１ｏｇｙ第８版、４３８頁およ
び２６５頁に、ロドトルラ・ルブラの菌学的性質はＩ、
ｏｄｄｅｒ’ ５ＴｈｅＹｅａｓｔｓ、１９７１
年、１２１７頁にそれぞれ記載がある。

微生物の培養培地としては、炭素源、窒素源、無機物そ
の他の栄養源を程よく含有する培地ならば合成培地また
は天然培地の何れも使用可能である。

培地に使用する炭素源は、使用菌株が利用可能なものな
らば何れの種類を用いてもよい。

すなわち、クルコース、フラクトース、シュークロース
、廃糖蜜などの炭水化物、グリセロール、ソルビトール
などの糖アルコール、アスパラギン酸、グルタミン酸な
どのアミノ酸、乳酸、酢酸、リンゴ酸などの有機酸また
はｎ−ヘキサンなどの炭化水素など種々のものが使用で
きる。

蜜素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムな
どの無機および有機のアンモニウム塩類、硝酸ナトリウ
ムあるいは尿素および他の窒素化合物並びにペフトン、
肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー、カ
ゼイン加水分解物、脱脂大豆あるいはその消化物、蛸加
水分解物など種々のものが使用可能である。

更に無機物としては、燐酸カリウム、硫酸マグネシウム
、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅
、硫酸亜鉛および炭酸カルシウムなどが使用できる。

なお使用菌株が生育のため他の栄養源を必要とする場合
には、轟然その要求を満足させる栄養源の適当量を培地
に加えなくてはならないが、これらの物質は、窒素源と
して使用される天然物に含まれて添加される場合もある
。

ＣｏＱｌｏの生合成前駆物質あるいはその代謝関連物質
としては、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、プロ
トカテキュ酸、ｐ−クマール酸、ｐ−ハイドロキシ安息
香酸、トランス−桂皮酸、シキミ酸、メチオニン、メバ
ロン酸、メバロン酸のラクトン、インブレニールアルコ
ール、３，３−ジメチルアリルアルコール、ケラニルア
ルコール、ファルネシルアルコール、ジメチルアクリル
酸、バニリン酸、プレフェニン酸などがあげられる。

またそれらを含有する天然物またはその処理物としては
、蚕糞およびその処理物、たばこの葉の抽出物などがあ
げられる。

これらの物質の量は物質の種類、使用菌株、培養条件な
どによって異なるが、通常は培地中に０．１〜２％（Ｗ
／■）、より好ましくは０．５〜：ｔ％（Ｗ／Ｖ）の割
合で存在させればよい。

これら物質は培養開始時に全量を培地中に加えてもよい
し培養途中に添加してもよい。

培養は、通常、振盪培養あるいは深部攪拌培養などの好
気的条件で行うが、使用菌株が生育すれば、嫌気条件下
でも実施しうる。

また、培養は、暗所にて実施できるが、使用菌株によっ
ては、光照射条件下の方が、好適な場合もある。

培養温度は通常２０°Ｃ〜４０℃であるが、使用菌株が
生育する温度であれば他の温度条件でも実施しうる。

培養液のｐＨは、通常５．０〜８．０であるが、その他
のｐＨでも使用菌株が生育するｐＨであれば実施可能で
ある。

かくして培養することによりＣｏＱｔ□は菌体内および
菌体外に生成するが、大部分は菌体内に生成するので通
常は菌体からＣ０ＱＩＯを単離する。

菌体からのＣ０ＱＩＯの単離は、常法に従って行うこと
ができる。

即ち、培養終了液より、遠心分離などにより集めた菌体
を、メタノール、水酸化ナトリウム、ピロガロールの混
合物を用いて菌体中のリン脂質などのケン化性物質をケ
ン化し、本ケン化液からｎ−ヘキサンの如き水と混合し
ない有機溶媒を加えて、Ｃ０Ｑ１ｏを抽出する。

ついで抽出物を、シリカゲルなどを用いて分別精製を行
なってＣｏＱ、。

を単離することができる。Ｃ０Ｑｔｏの同定には、ペー
パークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、液
体クロマトグラフィー、元素分析、核磁気共鳴スペクト
ル、赤外および紫外部吸収スペクトルなどの手法が用い
られる。

定量法としては、ｌ”ｏｌｋｅｒらの方法ＣＡｒｃｈｉ
ｖＢｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、８７、２
９８（１９６８）］や、高速液体クロマトグラフィー〔
ビタミン、す、１１１（１９７７）〕が用いられる。

以下に実施例を示す。

実施例１種菌として、バラコツカス・デニトリフィカンスＡＴＣ
ＣＩ９’３６７を用いる。

グルコース２ｇ／ｄｌ、ペプトン１．９／市、イー
ストエキ２エ（ｐＨ７．２）５Ｑ′ｒｒＬｌを
３００ｍ１容三角フラスコニ入れ、殺菌する。

前記菌株を１白金耳あて核種培地に植菌し、３０°Ｃで
２４時間振盪培養した。

該種培養液２ｍｌを３００ｍ１容邪魔板付三角フラスコ
中の廃糖蜜１０ｇ／ｄｌ（グルコース換算）、硫
安ＩＥＩ／ｄｌ，リン酸−カリウム０．０５ｇ
／ｄ１１リン酸二カリウム０．０５，！ｉｌ／ｄｄ
，硫酸マグネシウム０．０２５Ｅｌ／ｄｌｌ、
炭酸ｊ３）Ｌ／シウム２ｇ／ｄｅの基本組成を有するｐ
Ｈ７．２の栄養培地および上記基本組成の培地に、第１
表に示す如き物質を添加した培地２０ＴＬｌに植菌し、
３０℃で、９６時間振盪培養する。

上記方法で得られた培養液各５０ｍ１から生菌体を集め
、３０ｍ１の水に懸濁後、メタノール８０ｍ１１水酸化
ナトリウム１６Ｊ１ピロガロール３ｇを加え、８５℃で
４０分間還元ケン化後、放冷し、２００７１１１のｎ−
ヘキサンで２回抽出操作を行う。

ｎ−ヘキサン層を取り、無水芒硝で脱水後、ｎ−ヘキサ
ンを溜去し、残渣を一定量のジオキサンに溶解し、高速
液体クロマトグラフィーにより、ＣｏＱｔ□を定量した
。

その結果を第１表に示す。Ｌ−チロシン１％を添加した
培地で培養した菌体１００ｇ（乾燥菌体重量換算）を３
００Ｔｔｌの水に懸濁後、メタノール８００ｍ１，水酸
化ナトリウム１６０Ｌピロガロール３０ｇを加え
、８５℃で４０分間還元ケン化後、放冷し、２ｅのｎ−
ヘキサンで２回抽出操作を行う。

抽出物を無水芒硝で脱水後、ｎ−ヘキサンを溜去し、残
渣を４０ｍ１のアセトンに溶解し、不溶物を除いた後、
再び濃縮乾固し、１０ｍ１のアセトンに溶解後、シリカ
ゲルカラムに流し、ベンゼンにて溶出する。

ＣｏＱｌ。を含む画分を集め、濃縮乾固し、残渣を５ｍ
ｌのエタノールに溶解し、冷却して、黄色の粗結晶を得
た。

エタノールで再結を繰り返し、黄色い板状結晶４５”Ｑ
をえた。

本結晶は、逆相薄層クロマトグラフィーのＲｆ値、高速
液体クロマトグラフィーのリテンションタイム、融点、
核磁気共鳴スペクトル、元素分析、赤外および紫外部吸
収スペクトルなどにより、ＣｏＱ、。

と同定された。実施例２種菌として、アゲ冶バクテリウム・ツメファシェンスＡ
ＴＣＣ４４５２を用いる他は、実施例１と同様に実施し
た場合のＣｏＱｔｏの生成量は第２表に示す。

実施例３種菌として、ロドトルフ・ルブラＡＴＣＣ２０２５８を
用いる他は、実施例１と同様に実施した場合のｃｏＱｔ
ｏの生成量を第３表に示す。

Claims

【特許請求の範囲】１コエンチームＱ１ｏ生成能を有する微生物を培地に
培地に培養してコエンチームＱ１ｏを製造する方法にお
いて、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、プロトカ
テキュ酸、ｐ−クマール酸、トランス−桂皮酸、シキミ
酸、メチオニン、メバロン酸、メバロン酸のラクトン、
イソブレニールアルコール、３，３−ジメチルアリルア
ルコール、ケラニルアルコール、ファルネシルアルコー
ル、ジメチルアクリル酸、バニリン酸、プレフェニル酸
、蚕糞抽出物又はたばこ葉抽出物を培地中に存在させて
培養することを特徴とするコエンチームＱｒ。の製造法。