JPH0255037B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵法による補酵素Q₁₀（以下CoQ₁₀と
略称する。）の製造法に関する。更に詳細に述べ
れば、フラボバクテリウム属に属し、CoQ₁₀を生
産する能力を有する微生物を、３位置換ピリジン
誘導体を添加した培養基に培養し、著量のCoQ₁₀
を菌体中に蓄積せしめこれを採取する方法に関す
るものである。 CoQ₁₀は生体内の末端呼吸系の電子伝達体とし
て重要な役割を果たしている。近年CoQ₁₀は心臓
薬としての需要が急増しており、さらに肝機能障
害、糖及び脂肪酸代謝異常、脳血管障害に対する
効果も認められている。 従来、CoQ₁₀の製造に使用されている微生物と
しては各種細菌、酵母、糸状菌などがあり、発酵
法による製造ではこれらを培養した菌体中から
CoQ₁₀を抽出する方法がとられている。 本発明はCoQ₁₀を工業的により有利に生産する
ため、収穫菌体中の含有量を更に増大せしめる方
法について研究を重ねた結果、ピリジン誘導体の
うちピリジン骨格の３位に官能基を有する化合物
の適当濃度を培地中に存在せしめて培養すると、
CoQ₁₀の含有量が著量に増大することを見い出
し、本発明を完成した。 本発明で培地中に添加する３位置換ピリジン誘
導体とは一般式

【式】で示されるピリジン 骨格の第３位に官能基を有する化合物であり、官
能基Ｒはカルボキシ、ホルミル、カルバモイル、
アリルオキシ、１―メチルピロリジル基等を表わ
すが、この他にも３位に官能基を有するピリジン
誘導体ならば使用可能である。このうち本発明の
実施に特に適する３位置換ピリジン誘導体として
は、ニコチン、ニコチン酸、ニコチンアミドを挙
げることができる。 本発明で使用する微生物としてはフラボバクテ
リウム属に属し、CoQ₁₀を生産する能力を有する
ものであればいずれの菌株でもよいが、特にフラ
ボバクテリウム・カプシユラタム
（Flavobacterium capsulatum）IFO−12533は
CoQ₁₀を高収率で生産することができるので好ま
しい菌株である。 本発明で使用する培地としては、細菌が増殖し
うるものあれば天然培地または合成培地のいずれ
でもよく、炭素源としては同化しうるものであれ
ばいかなるものでもよいが、例えば、グルコー
ス、シユクロース、マルトース、ラクトース、セ
ルロース等の糖類、エタノール、プロパノール、
等のアルコール類、炭水化物等をあげることがで
きる。窒素源としては、硫安、塩安、リン安、硝
酸ナトリウム、尿素、ペプトン、カゼイン、等の
無機又は有機物が使用でき、その他の無機塩類と
してカリウム、マグネシウム、リン酸、亜鉛、
鉄、マンガン、銅、カルシウム等の各塩類が使用
される。又、微量栄養源として、必要に応じて酵
母エキス、肉エキス、コーンステイープリカー、
ビタミン類、アミノ酸類等を添加してもよい。培
養は好気条件下に行うのが良く、一般に通気撹拌
培養、振とう培養を行うのが有利である。培養は
通常、PH５〜８、温度25〜35℃で10〜50時間行
う。 培地への３位置換ピリジン誘導体の添加方法と
しては通常培養初期に加えるのが好ましい。これ
らの化合物は最終濃度１×10^-3〜10×10^-3M好ま
しくは２×10^-3〜６×10^-3Mとなるように添加す
る。 菌体からのCoQ₁₀の抽出は常法に従つて行うこ
とが出来、例えば菌体を抗酸化剤としてピロガロ
ールの存在下にメタノール性あるいはエタノール
性アルカリでけん化し、本けん化液からｎ―ヘキ
サン、ｎ―ヘプタン、石油エーテル等の非極性有
機溶媒にCoQ₁₀を転溶させる。また、けん化方法
を用いない方法として、親水性の有機溶媒である
メタノールあるいはエタノールにて加温抽出する
か、メタノール―エーテル混合溶媒にて還流抽出
を行つても目的物を抽出することができ、以下け
ん化方法と同様に非極性溶媒に転溶させる。さら
に精製する場合は、本抽出物をフロリジル、シリ
カゲル、アルミナ等を用いる吸着クロマトグラフ
イー等で分別精製することができる。CoQ₁₀の同
定はUVスペクトル、融点測定、逆相TLC、液体
クロマトグラフイー、MNR、及びマススペクト
ル等により標準品と比較することにより行つた。
また、定量はCraneらの方法（Methods of
Biochemical Analysis 第11巻、289頁、1963
年）を用いた。次に本発明の実施例を挙げて具体
的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。 実施例 １ 乾燥ブイヨン（日水製薬社製）30ｇ、グルコー
ス10ｇを水１に溶解し、PHを7.0に調整した。
この培地100mlを500ml容坂口フラスコに分注後、
120℃、15分間オートクレーブにて殺菌した。殺
菌フラスコ中にニコチン溶液を3mMになるよう
に添加した後、フラボバクテリウム・カプシユラ
タムIFO−12533菌を接種し、30℃、48時間振と
う培養した。培養後遠心分離して集菌し、乾燥菌
体として4.9ｇを得た。同菌体１ｇ中のCoQ₁₀含
有量は1.25mgであり、培養液１から6.1mgの
CoQ₁₀が生産されたことになる。 次にこの乾燥菌体にメタノール150ml、水50ml
を加え、抗酸化剤としてピロガロール10ｇ、水酸
化ナトリウム20ｇを加えた後、80〜85℃の恒温浴
槽にて１時間加熱還流した。却後200mlの水を加
えてｎ―ヘキサン200mlで３回抽出した。水洗後、
ｎ―ヘキサン層を減圧濃縮乾固し、残渣をアセト
ン少量に溶解後、この溶液をシリカゲルカラムに
流し、クロロホルムにて溶出させた。溶出後
CoQ₁₀区分を合し、減圧乾固した後、残渣を少量
のエタノールに溶解させ、冷暗所に放置すると
CoQ₁₀の粗結晶が得られる。この粗結晶をエタノ
ールからの再結晶を２回くり返すことにより
CoQ₁₀の黄色結晶2.5mgを得た。 一方、ニコチン溶液を添加しない上記培地で、
前記と同様の培養を行い、かつ前記と同様の方法
により乾燥菌体5.1ｇを得た。この菌体１ｇ中に
はCoQ₁₀が0.82mg含まれていた。得られた乾燥菌
体より前記と同様の方法によりCoQ₁₀の結晶1.6
mgを得た。 この結果から、CoQ₁₀の生成、蓄積に及ぼすニ
コチンの効果を比較すると、培地にニコチンを添
加したことによりCoQ₁₀は培養液１当り約47％
増加し、乾燥菌体１ｇ当りでは約52％増加した。
従つてCoQ₁₀の生産におけるニコチンの効果が明
確に認められた。 実施例 ２ 実施例１のニコチンの代わりにニコチン酸
2mMを添加した以外は実施例１と同様の方法に
よりフラボバクテリウム・カプシユラタムIFO−
12533菌を培養し、乾燥菌体として4.2ｇを得た。
同菌体１ｇ中のCoQ₁₀の含有量は1.53mgであり、
培養液１から6.4mgのCoQ₁₀が生産された。得
られた乾燥菌体より実施例１と同様の方法で
CoQ₁₀の結晶2.7mgを得た。 ニコチン酸の添加により生産されるCoQ₁₀は添
加しないものに比して培養液１当り約52％増加
し、乾燥菌体１ｇ当り約86％増加した。 実施例 ３ 実施例１のニコチンの代わりにニコチンアミド
5mMを添加した以外は実施例１と同様の方法に
よりフラボバクテリウム・カプシユラタムIFO−
12533を培養し、乾燥菌体として4.7ｇを得た。同
菌体１ｇ中のCoQ₁₀の含有量は1.35mgであり、培
養液１当り6.3mgのCoQ₁₀が生産された。得ら
れた乾燥菌体より実施例１と同様の方法により
CoQ₁₀の結晶2.6mgを得た。 ニコチンアミドの添加により、生産される
CoQ₁₀は無添加のものに比して培養液１当り約
53％増加し、乾燥菌体１ｇ当り約64％増加した。
従つてCoQ₁₀の生産におけるニコチンアミドの効
果が明確に得られた。 実施例 ４ グルコース20ｇ、KH₂PO₄ １ｇ、K₂HPO₄ ３
ｇ、硫安４ｇ、MgSO₄・7H₂O 0.6ｇ、ZnSO₄・
7H₂O10mg、FeSO₄・7H₂O10mg、酵母エキス２ｇ
を水１に溶解し、PH7.0に調整した。上記培地
100mlを500ml容坂口フラスコに分注し、120℃で
15分間オートクレーブにて滅菌した。同滅菌フラ
スコ中にニコチン溶液を4mMになるように添加
した後、あらかじめ栄養培地で30℃、48時間培養
した種培養液１mlを接種した。30℃で30時間培養
した後集菌して乾燥菌体として4.8ｇを得た。同
菌体１ｇ中にCoQ₁₀は0.91mg含有されていた。従
つて培養液１当り4.3mgのCoQ₁₀が生産された
ことになる。得られた乾燥菌体より実施例１と同
様の方法によりCoQ₁₀の結晶1.8mgを得た。 一方、ニコチンを添加しない上記培地で、前記
と同様の方法により、乾燥菌体として4.0ｇを得
た。この菌体１ｇ中にはCoQ₁₀が0.58mg含まれて
いた。得られた乾燥菌体より前記と同様の方法に
より、CoQ₁₀の結晶0.9mgを得た。 この結果から、CoQ₁₀の生成、蓄積に及ぼすニ
コチンの効果を比較すると、培地にニコチンを添
加したことによりCoQ₁₀は培養液１当り約86％
増加し、乾燥菌体１ｇ当りでは約56％増加した。
従つて、CoQ₁₀の生産におけるニコチンの効果は
明確に認められた。 実施例 ５ 実施例４と同様の培地組成の培地100mlを500ml
容坂口フラスコに分注し、120℃で15分間オート
クレーブにて滅菌後、フラボバクテリウム・カプ
シユラタムIFO−12533を植菌し、30℃で24時間
培養した。別に、上記と同様の培地５を10容
ジヤーフアメンターに仕込み同時にニコチン酸
3mMを添加して、上記の培養物を種菌として300
ml接種した。培養温度30℃、通気量10／分、撹
拌速度400rpmにて12時間培養後、遠心分離にて
集菌し、乾燥菌体として19.4ｇを得た。この乾燥
菌体１ｇ中にはCoQ₁₀が1.90mg含有されていた。
従つて培養液当り36.8mgのCoQ₁₀が生産されたこ
とになる。得られた乾燥菌体より実施例１と同様
の方法により、CoQ₁₀の結晶10.8mgを得た。これ
はニコチン酸を添加しないときと比較すると培養
液当り約180％の増加であり、乾燥菌体１ｇ当り
では約170％の増加であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、培地中のニコチン濃度と収穫菌体中
のCoQ₁₀含有量との関係を示すグラフであり、第
２図は培地中のニコチン酸濃度、そして第３図は
培地中のニコチンアミド濃度と収穫菌体中の
CoQ₁₀含有量との関係を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ フラボバクテリウム属に属し、補酵素Q₁₀生
   産能を有する微生物の培養にあたり、培地中に３
   位置換ピリジン誘導体を添加培養することによつ
   て補酵素Q₁₀を著量に蓄積せしめ、これを採取す
   ることを特徴とする補酵素Q₁₀の製造法。 ２ ３位置換ピリジン誘導体がニコチン、ニコチ
   ン酸及びニコチンアミドから成る群より選ばれた
   少なくとも１種以上の化合物であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の補酵素Q₁₀の製
   造法。 ３ フラボバクテリウム属に属し、補酵素Q₁₀生
   産能を有する微生物がフラボバクテリウム・カプ
   シユラタム（Flavobacterium capsulatum）
   IFO―12533である特許請求の範囲第１項または
   第２項記載の補酵素Q₁₀の製造法。