JPS6310996B2

JPS6310996B2 -

Info

Publication number: JPS6310996B2
Application number: JP55114701A
Authority: JP
Inventors: Yohei Natori; Tomohisa Nagasaki
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1980-08-22
Filing date: 1980-08-22
Publication date: 1988-03-10
Also published as: JPS5739788A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は補酵素Q₁₀の製造方法に関する。さら
に詳しくは本発明はシユードモナス属に属する微
生物をペプトン、酵母エキス、NZ−アミン、カ
ザミノ酸またはコーンステイープリカーを添加し
た培地に培養して補酵素Q₁₀の生成を増加せしめ
るかまたは補酵素Q₁₀の生成を増加せしめると共
に副生する他の補酵素Ｑ同族体の生成を抑制して
容易に補酵素Q₁₀を採取することよりなる補酵素
Q₁₀の製造方法に関する。補酵素Q₁₀は下記の構造式で示される化合物で
ありそして生体内では電子伝達系の一要素として
極めて重要な役割を果している。この物質が各種疾病に対してすぐれた薬理作用
を示すことはすでに知られている。しかしながら
この物質を商業的に製造することは簡単ではな
い。これを動物の心臓筋肉等から抽出することは
原料が高価なうえに大規模生産が困難である。ま
た合成法による場合には収率が低く、工業的に満
足できるものではない。この点、微生物を用いる
補酵素Q₁₀の製造はその方法によつては経済的な
ものとなりうるものである。発酵法については従来ロードトルラ、スポロボ
ロマイセス、カンデイダ、トルロプシスに属する
酵母、ノイロスポラ、アスペルギルスに属する糸
状菌、シユードモナス、アグロバクテリウム、ロ
ードスピリラム、ロードシユードモナスに属する
細菌等に補酵素Q₁₀が含有されることが知られて
いるが、その生産量は極めて低くおよそ工業的規
模で補酵素Q₁₀を生産するにはほど遠い。本発明者等はシユードモナス属に属する細菌お
よびその変異株を用いてその増殖培地に添加して
単位菌体当りの補酵素Q₁₀の含量を無添加の場合
に比して顕著に増大させる化合物について種々検
討した結果、生育培地に添加したペプトン、酵母
エキス、NZ−アミン、カザミノ酸およびコーン
ステイープリカーが単位菌体あたりの補酵素Q₁₀
の含量を顕著に増大させ、しかも他の補酵素Ｑ同
族体の副生量を低下させるという知見を得た。本
発明は上記の知見に基づいてさらに研究を重ねた
結果完成されたものである。本発明に使用する微生物はシユードモナス属に
属し補酵素Q₁₀生産能を有する細菌であればよい
が、特にシユードモナスC1−36（微工研菌寄第
5209号、特公昭61−55955号公報（特願昭54−
124727号）参照）またはシユードモナスN842（微
工研菌寄第3154号、特開昭52−47990号参照）ま
たはその変異株シユードモナスN842−M16（微工
研菌寄第3155号、特公昭61−30554号公報（特願
昭53−150513号）参照）などは補酵素Q₁₀を高収
率で生産するので好ましい。本発明における培養培地は特に制限するところ
はなく、たとえば、炭素源としてはグルコース等
の炭水化物、クエン酸等の有機酸、メタノール、
グリセリン等のアルコール類が使用でき、窒素源
としては硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニ
ウム、燐酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ア
ンモニウムガス等、無機物として燐酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩その
他必要に応じて微量金属塩等、さらに生育促進物
質としてビタミン等を使用できる。培養に当つては、PH５〜８で20〜40℃において
約２〜10日間好気的に振盪または撹拌培養する。添加物の添加量は培養液に対して１〜10％
（ｗ／ｖ）好ましくは１〜５％（ｗ／ｖ）である。本発明で使用する添加物は培養開始時かまたは
菌体増殖時に添加すると効果が認められるが特に
対数増殖期（培養開始後24時間前後）の添加が好
ましい。添加方法は一度に添加するかまたは発酵
状態に応じて分割して添加する。本発明で使用する酵母エキスは市販の製品かあ
るいは酵母菌体より常法により熱水抽出したもの
のいずれでも使用できる。またペプトン、カザミ
ノ酸、コーンステイープリカー等は任意の市販の
製品を使用することが可能である。培養終了後、培養液から菌体を遠心または過
により常法で分離する。ここで得られた菌体中に
は補酵素Q₁₀が豊富に含有されているので、この
菌体を適当に処理後そのまま栄養剤、医療または
飼料に供することもできる。また補酵素Q₁₀の単離が所望される場合には出
発物質としての菌体は生菌体または乾燥菌体ある
いは菌体処理物のいずれでも使用できる。補酵素
Q₁₀の単離の方法の一例としては、まずけん化す
るためにメタノール、苛性ソーダ、ピロガロール
の混液を菌体含有液に添加し、60〜90℃において
１〜２時間還流加熱する。次いで不溶物を分離し
た後、液相をｎ−ヘキサン等の溶媒で抽出する。
溶媒層を水洗および脱水後、濃縮する。濃縮物を
シリカゲル等のカラムに添加し、ベンゼンなどで
展開すると補酵素Q₁₀が溶出する。所望の画分を
濃縮凝固しそしてエタノール可溶部分を冷却放置
すると赤黄色の補酵素Q₁₀の粗結晶が得られる。
さらに再結晶を繰り返すと補酵素Q₁₀の純粋な結
晶が得られる。包接化合物による分離、分子蒸留
等を行うことも効果的である。補酵素Q₁₀の同定はUVスペクトル、融点測定、
アセトン／水（95：５）を展開溶媒とする逆相薄
層クロマトグラフイー、NMR、マススペクトル
等により標準品と比較することにより行つた。つぎに本発明を実施例により具体的に説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。実施例１グルコース２％、KH₂PO₄0.1％、K₂HPO₄0.1
％、NH₄Cl0.05％、MgSO₄・7H₂O0.01％、
Na₂SO₄0.05％およびコーンステイープリカー0.5
％を含有する培地15に、シユードモナスC1−
36をグルコース２％、ペプトン１％およびイース
トエキス１％（PH6.5）を含有する培地300ml中で
48時間培養した培養液を種菌として接種する。30
容ジヤーフアーメンターを用いて30℃で毎分15
の空気を通気して撹拌培養した。PHはアンモニ
ア水により6.5に調節した。培養１日目に培地の
３％に相当する量のコーンステイープリカーを添
加して更に３日間培養した。培養終了後遠心分離
により湿菌体ペーストを得た。このものは乾燥菌
体として61ｇであり、乾燥菌体１ｇ当り23.6mgの
補酵素Q₁₀が含まれていた。これは培養液１当
り108mgの補酵素Q₁₀に相当する。得られた湿菌
体を水300ml、メタノール２、ピロガロール40
ｇおよび水酸化ナトリウム300ｇと混合し、85℃
で１時間加熱還流した。放冷後２のｎ−ヘキサ
ンで２回抽出し、ｎ−ヘキサン層をとり、水洗後
芒硝で乾燥しそして濃縮乾固した。乾固物のアセ
トン可溶部をとり、アセトンを留去しそして残渣
をｎ−ヘキサンに溶解する。この溶液をシリカゲ
ルカラムを用いてエーテル／ｎ−ヘキサン混合物
で展開しそして補酵素Q₁₀を含む画分を採取す
る。この画分を更に多孔質重合体カラムを用いて
精製し、この溶出液より溶媒を留去し、そして残
渣を少量のエタノール溶解して冷所に放置すると
補酵素Q₁₀の結晶が析出した。エタノールから再
結晶を３度繰返して補酵素Q₁₀の結晶710mgを得
た。一方、上記培地で培養途中でコーンステイープ
リカーを添加しないでシユードモナスC1−36を
前記と同様の方法で培養および処理して湿菌体ペ
ーストを得た。このものは乾燥菌体として75ｇで
あり、菌体１ｇ当り13.8mgの補酵素Q₁₀が含まれ
ていた。これは培養液１当り補酵素Q₁₀69mgに
相当する。菌体より実施例１と同様の方法で抽出
精製を行つて補酵素Q₁₀結晶330mgを取得した。以上の結果について補酵素Q₁₀の生成および蓄
積に及ぼすコーンステイープリカーの効果を比較
すると、培養途中で培地にコーンステイープリカ
ーを添加したことにより補酵素Q₁₀は培養液１
当り約57％増加し、また菌体１ｇ当りでは約71％
増加した。従つて補酵素Q₁₀の生産におけるコー
ンステイープリカーの効果が明確に認められた。
またコーンステイープリカーを添加しない場合に
は補酵素Q₁₀以外の補酵素Ｑ同族体は補酵素Ｑの
約12％存在したが、コーンステイープリカーを培
養１日目に添加することにより７％まで低下し
た。実施例２実施例１の培地よりNH₄Clを除去した代りに
ペプトン１％を添加した培地20mlにシユードモナ
スN842−M16株を植え付け試験管内で30℃にお
いて４日間振盪培養した。この培養により得られ
た補酵素Q₁₀の定量値は培地１当り18.5mgであ
り、乾燥菌体１ｇ当りの補酵素Q₁₀は3.8mgであつ
た。ペプトンを添加しない上記培地でシユードモ
ナスN842−M16を上記と同様の方法で培養した。
この培養により得られた補酵素Q₁₀の定量値は培
地１当り15.9mgであり、そして乾燥菌体１ｇ当
り3.5mgであつた。上記実施例２の方に従つて、コーンステイープ
リカーを培養開始時から添加した場合と、培養第
１日目（対数増殖期）で添加した場合の補酵素
Q₁₀の収率および補酵素Ｑ同族体の収率を比較し
た。培養菌としてシユードモナスC1−36を用い
た。結果は次のとおりであつた。

【表】上記比較試験の結果から明らかなように、コー
ンステイープリカーを培養第１日目に培養液に加
えた場合は、培養開始時から加えていた場合に比
較して補酵素Q₁₀の収量が約70％以上（培養液１
中の収量）多く、かつ他の補酵素Ｑ同族体の副
生量が少ない。実施例３実施例１の培地よりNH₄Clを除去した培地20
mlにシユードモナスN842−M16株を植え付け試
験管内で30℃において振盪培養した。培養１日目
にペプトン３％を添加して更に３日間培養した。
得られた補酵素Q₁₀の定量値は培地１当り24.3
mgであり、そして乾燥菌体１ｇ当りでは4.9mgで
あつた。ペプトンを添加しないで培養した場合の
定量値は実施例２のそれと同じであつた。また上
記培地でペプトンを添加しないで培養した場合、
補酵素Q₁₀以外の補酵素Ｑの含有率は11％であつ
たが、ペプトン添加によりそれは５％まで低下し
た。実施例４実施例１の培地よりNH₄Clを除去した培地20
mlにシユードモナスN842−M16株を植え付け試
験管内で30℃において振盪培養した。培養１日目
にカザミノ酸１％を添加して更に３日間培養し
た。得られた補酵素Q₁₀の定量値は培地１当り
23.5mgであり、そして乾燥菌体１ｇ当りでは4.3
mgであつた。カザミノ酸を添加しないでシユード
モナスN842−M16を培養した場合の定量値は１
当り15.1mgであり、乾燥菌体１ｇ当り3.2mgで
あつた。また上記培地でカザミノ酸を添加しない
で培養した場合の補酵素Q₁₀以外の補酵素Ｑの含
有率は10％であるのに対してカザミノ酸添加によ
りそれは６％まで低下した。実施例５実施例１の培地よりNH₄Clを除去した培地20
mlにシユードモナスN842−M16株を植え付け試
験管内で30℃において振盪培養した。培養１日目
に酵母エキス1.5％を添加して更に３日間培養し
た。得られた補酵素Q₁₀の定量値は培地１当り
20.8mgであり、そして乾燥菌体１ｇ当りでは4.5
mgであつた。酵母エキスを添加しないで培養した
場合の定量値は実施例２のそれと同じであつた。
また上記培地で酵母エキスを添加しないで培養し
た場合、補酵素Q₁₀以外の補酵素Ｑの含有率は11
％であつたが、酵母エキス添加によりそれは5.5
％まで低下した。実施例６実施例１の培地よりNH₄Clを除去した培地20
mlにシユードモナスN842−M16株を植え付け試
験管内で30℃において振盪培養した。培養１日目
にNZ−アミン1.5％を添加して更に３日間培養し
た。得られた補酵素Q₁₀の定量値は培地１当り
20.3mgであり、そして乾燥菌体１ｇ当りでは4.8
mgであつた。NZ−アミンを添加しないで培養し
た場合の定量値は実施例２のそれと同じであつ
た。また上記培地でNZ−アミンを添加しないで
培養した場合、補酵素Q₁₀以外の補酵素Ｑの含有
率は11％であつたが、NZ−アミン添加によりそ
れは6.1％まで低下した。

Claims

【特許請求の範囲】

１菌体内に補酵素Q₁₀の蓄積生成能を有するシ
ユードモナス属の細菌をペプトン、酵母エキス、
NZ−アミン、カザミノ酸およびコーンステイー
プリカーから選ばれた少くとも１種類の添加物を
存在せしめた培地に培養しそして生成した菌体よ
り補酵素Q₁₀を採取することからなり、前記添加
物が培養液に対して１〜10％（ｗ／ｖ）の量であ
り、かつ培地への前記添加物の添加が細菌の対数
増殖期に行なわれることを特徴とする、補酵素
Q₁₀の製造方法。