JPS6155955B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物による補酵素Q₁₀の製造法に
関する。さらに詳しくは、本発明は、シユードモ
ナス属に属する新菌株であるシユードモナスC1
―36（微工研菌寄第5209号）を培養しそしてかく
して得られる菌体より補酵素Q₁₀を採取する方法
に関する。

補酵素Q₁₀は下記の構造式で示される化合物で
あり、生体内では電子伝達系の一要素として、極
めて重要な役割を果している。

本物質が各種疾病に対して秀れた薬理作用を示
すことはすでに明らかとされている。しかしなが
ら、補酵素Q₁₀の製造のためにこれを動物の心臓
筋肉等から抽出することは、原料が高価なうえに
大規模生産が困難である。また合成法については
相当の工程数を要ししかも収率も限られているた
めに完全には満足できるものではない。この点、
微生物を用いる補酵素Q₁₀の製造法は経済的にか
なりの魅力のあるものである。

発酵法としては従来、ロードラルラ、スポロボ
ロマイセス、カンデイダ、トルロプシスに属する
酵母、ノイロスポラ、アスペルギルスに属する糸
状菌、シユードモナス、アグロバクテリウム、ロ
ードスピリラム、ロードシユードモナスに属する
細菌に補酵素Q₁₀が含有されることが知られてい
るが、その生成量は極めて低く、およそ工業的規
模で補酵素Q₁₀を生産するにはほど遠い。

本発明の目的は、シユードモナス属の新菌株を
用いることにより、極めて能率よく補酵素Q₁₀を
得る方法を提供しようとするものである。本菌株
を用いた場合は、補酵素Q₁₀の生成量が従来技術
に比して高い上、酵母と同様に集菌効率が極めて
高いという特性を有する。

本発明の方法は、新菌株シユードモナスC1―
36（微工研菌寄第5209号）を培地に培養し、生成
した菌体より補酵素Q₁₀を採取する方法である。

まず、本発明に用いるシユードモナスC1―36
の菌学的性質を述べる。

(a) 形態 細胞の大きさ 0.8〜1.0×1.5〜2.0μ 細胞の多形性なし 運動性あり、極鞭毛１本 胞子なし グラム陰性桿菌 抗酸性なし (b) 培地における生育状態 肉汁寒天平板、肉汁寒天斜面および肉汁液体
での生育は全て微弱であるが、コロニーはピン
クで円形、周縁は全縁、隆起は滑らかな中央凸
状。

肉汁ゼラチン穿刺培養では微弱に生育する
が、液化能なし。

リトマスミルク アルカリ性 (c) 生理学的性質 硝酸塩還元性 陽性 脱窒反応 陰性 メチルレツドテスト 陰性 VPテスト 陽性 インドール 生成せず 硫化水素 生成せず デンプン液化能 なし クエン酸の利用 Koserの培地、Christensen
の培地共に陰性 窒素源として硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、硝酸ナトリウムを利用 色素 非水溶性色素産性 ウレアーゼ 陽性 チトクロームオキシダーゼ 陽性 カタラーゼ 陽性 生育PH5.5〜7.5（最適PH6.5） 生育温度 20〜37℃（最適温度30℃） 酸素要求性 好気性 Ｏ―Ｆテスト（Hugh Leifson法による）
０ (d) 糖類の利用性と酸およびガスの生成の有無 Ｌ―アラビノース、グリセリンを利用し、酸
を生成する。ガスの生成は認められない。

Ｄ―キシロース、Ｄ―グルコース、Ｄ―ガラ
クトースを利用するが酸を生成しない。ガスの
生成は認められない。

Ｄ―マンノース、Ｄ―フラクトース、麦芽
糖、シヨ糖、トレハロース、Ｄ―ソルビツト、
Ｄ―マンニツト、イノシツトおよびデンプンは
利用しない。

(e) その他の性質 プロパノールを利用して生育し、酸を生成す
る。

炭素源として上記以外にコハク酸、フマル
酸、クエン酸、酢酸、乳酸、メタノール、エタ
ノール、ブタノール、プロピレングリコール、
トリメチレングリコール、アラニン、アスパラ
ギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミ
ン酸およびセリンを利用する。

ラフイノース、ラムノース、イヌリン、デキ
ストリン、酒石酸、グリコレート、マレイン
酸、蓚酸、リンゴ酸、プロピオン酸、グリシ
ン、フオルムアルデヒド、プロピオンアルデヒ
ドおよびベンゼンは利用しない。

以上の菌学的性質から〓バージーズ・マニユア
ル・オブ・デイタミナテイブ・バクテリオロジ
ー〓第７版及び第８版の分類の基準にしたがつ
て、既知の菌株との異同を検討した結果、本発明
において使用する菌株はシユードモナス属に属す
るものと認められるが、同属中に近縁なものを見
出せない。なお、本菌株と類似しているものとし
ては、特開昭52―47990号に記載されてシユード
モナスN842があるが、補酵素Q₁₀の生産能力が
N842と比較して本菌株は格段に優れており、そ
して酢酸、セリン、マレイン酸、プロパノール等
の炭素源の利用性において大きく相違している。

以上の結果から、本発明者らは本菌株を新菌株
と認め、シユードモナスC1―36と命名した。

本発明における培養培地は特に制限するところ
はなく、たとえば、炭素源としては、グルコース
等の含水炭素、クエン酸等の有機酸、グリセリン
等のアルコール類が使用でき、窒素源として硫酸
アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、アンモニウム
ガス等、無機物としてリン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、その他必
要に応じて微量金属塩等、さらに生育促進物質と
してアミノ酸、ビタミン、大豆蛋白加水分解物、
酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸等を使用すれ
ばよい。

培養に当つては、PH５〜８で20〜40℃において
約２〜10日間程度、好気的に振盪または撹拌培養
する。培養液から常法により遠心法または過法
などで菌体を分離する。ここで得られた菌体中に
は、補酵素Q₁₀が豊富に含有されているので、本
菌体を適当に処理後、菌体と共に補酵素Q₁₀を栄
養剤、医薬、飼料に供することもできる。

また補酵素Q₁₀の単離のための出発物質である
菌体は、生菌体または乾燥菌体、菌体処理物のい
ずれでも使用できる。補酵素Q₁₀の単離の方法の
一例を示すと、まずけん化するために、メタノー
ル、苛性ソーダ、ピロガロールの混液を菌体含有
液に添加し、60〜90℃にて１〜５時間、還流加熱
抽出する。次いで、得られる抽出液をｎ―ヘキサ
ン等の溶媒で抽出し、溶媒層を水洗し、脱水およ
び濃縮し、これをシリカゲル等のカラムに添加
し、そしてベンゼンなどで展開すると、補酵素
Q₁₀が溶出する。この画分を濃縮乾固し、必要に
応じて多孔質重合体によるカラムクロマトグラフ
イー等により更に精製した後、エタノール可溶部
分を冷却放置すると、赤黄色の補酵素Q₁₀の粗結
晶が得られ、さらに再結晶を繰返すと、補酵素
Q₁₀の純粋な結晶が得られる。包接化合物による
分離、分子蒸溜等を行うことも効果的である。

実施例 １ グルコース２％、ペプトン１％およびイースト
エキス１％（PH6.5）を含有する水性培地15に
シユードモナスC1―36（微工研No.5209）を同じ
組成の培地300mlで48時間培養した培養液を種菌
として接種し、30容ジヤーフアーメンターを用
いて30℃で毎分15の空気通気して70時間撹拌培
養して遠心分離により湿菌体ペーストを得た。こ
のものは乾燥菌体として90ｇであり、乾重量１ｇ
当り12.5mgの補酵素Q₁₀を含んでいた。

得られた湿菌体を水300ml、メタノール２、
ピロガロール40ｇおよび苛性ソーダ300ｇと混合
しそして85℃で１時間加熱還流した。放冷後、２
のｎ―ヘキサンで２回抽出し、ｎ―ヘキサン層
を取り、水洗後芒硝で乾燥し、そして濃縮乾固し
た。

乾固物のアセトン可溶部分をとり、アセトンを
留去し、そして残渣をｎ―ヘキサンに溶解する。
この溶液をシリカゲルカラムを用いてエーテル―
ｎ―ヘキサン混合物で展開し、そして補酵素Q₁₀
を含む画分を採取する。この画分を濃縮乾固し、
残渣を多孔質重合体カラムに負荷し、メタノール
―アセトン混合物で展開しそして補酵素Q₁₀を含
む画分を採取する。この溶出液より溶媒を留去し
且つ残渣を少量のエタノールに溶解して冷所に放
置すると補酵素Q₁₀の粗結晶が析出した。エタノ
ールから再結晶を３回繰返して補酵素Q₁₀の結晶
420mgを得た。

本結晶のｎ―プロパノール／水（４：１）およ
びジメチルホルムアミドをそれぞれ展開溶媒とし
て用いて逆相ペーパークロマトグラフイー（２
回）およびアセトン／水（95：５）を展開溶媒と
する逆相薄層クロマトグラフイーを行なつたがい
ずれの場合も単一スポツトを与えた。質量、紫外
吸収、赤外吸収、核磁気共嗚スペクトルおよび融
点についても標品の補酵素Q₁₀のそれらと一致し
た。

実施例 ２ グルコース２％、KH₂PO₄0.1％、K₂HPO₄0.1
％、NH₄Cl0.5％、MgSO₄・7H₂0.01％、
Na₂SO₄0.05％およびコーンステイープリカー0.5
％（PH6.5）を含有する水性培地15に実施例１
と同様の方法でシユードモナスC1―36（微工研
No.5209）を培養した。培養時間は80時間とし、そ
の際培養中のPH低下はアンモニア水でPH6.5に調
整した。培養後遠心分離により菌体を分離し、そ
して菌体ペーストを得た。このものは乾燥菌体と
して115ｇであり、この菌体には乾重量１ｇ当り
9.2mgの補酵素Q₁₀が含まれていた。菌体より実施
例１に示した方法で抽出および精製を行つて純粋
な補酵素Q₁₀380mgを得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シユードモナスC1―36を培地に培養し、そ
   して生成した菌体より補酵素Q₁₀を採取すること
   を特徴とする補酵素Q₁₀の製造法。