JPH0371119B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は補酵素Q₁₀の製造法に関する。さらに
詳しくは本発明はシユードモナス属に属する細菌
を特定の脂肪族カルボン酸を存在せしめた培地中
で培養して補酵素Q₁₀の生成を増加せしめしかも
その際有利に副生する他の補酵素Ｑ同族体の副生
を抑制して容易に補酵素Q₁₀を採取する補酵素
Q₁₀の製造法に関する。 補酵素Q₁₀は下記の構造式で示される化合物で
ありそして生体内では電子伝達系の一要素として
極めて重要な役割を果している。 この物質が各種疾病に対してすぐれた薬理作用
を示すことはすでに知られている。しかしながら
この物質を商業的に製造することは簡単ではな
い。これを動物の心臓筋肉等から抽出することは
原料が高価なうえに大規模生産が困難である。ま
た合成法による場合には収率が低く、工業的に満
足できるものではない。この点、微生物を用いる
補酵素Q₁₀の製造はその方法によつては経済的な
ものとなりうるものである。 発酵法については従来ロードトルラ、スポロボ
ロマイセス、カンデイダ、トルロプシスに属する
酵母、ノイロスポラ、アスペルギルスに属する糸
状菌、シユードモナス、アグロバクテリウム、ロ
ードスピリラム、ロードシユードモナスに属する
細菌等に補酵素Q₁₀が含有されることが知られて
いるが、その生成量は極めて低くおよそ工業的規
模で補酵素Q₁₀を生成するにはほど遠い。 本発明者等は、シユードモナス属に属する細菌
およびその変異株を用いて、その増殖培地に添加
して単位菌体当りの補酵素Q₁₀の含量を無添加の
場合に比して著しく増大させる化合物について
種々検討した結果、ロイシン、イソロイシンまた
はバリンの存在下に培養すると単位培地当りの補
酵素Q₁₀の生産量および単位菌体当りの補酵素
Q₁₀の含量を著しく増大させしかもその際他の補
酵素Ｑ同族体の副生を低下させるという知見を得
た。本発明は上記の知見に基づいてさらに研究を
重ねた結果完成されたものである。 本発明に使用する微生物はシユードモナス属に
属し補酵素Q₁₀生産能を有する細菌であればよい
が、特にシユードモナスC1−36（微工研菌奇第
5209号、特願昭54−124727号参照）、シユードモ
ナスN842（微工研菌奇第3154号、特願昭50−
122452号参照）またはその変異株シユードモナス
N842−M16（微工研菌奇第3155号、特願昭53−
150513号参照）などは補酵素Q₁₀を高収率で生産
するので好ましい。 本発明における培養培地は特に制限するところ
はなく、たとえば炭素源としてはグルコース等の
炭水化物、クエン酸等の有機酸、メタノール、グ
リセリン等のアルコール類が使用でき、窒素源と
して硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、塩化アンモニウム、アン
モニアガス等、無機物として燐酸塩、マグネシウ
ム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩その他必
要に応じて微量金属塩等、さらに生育促進物質と
してビタミン等を添加してもよい。 培養に当つてはPH５〜８で20〜40℃において約
２〜19日間好気的に振蘯または攪拌培養する。本
発明で使用する添加物は培養開始時かまたは菌体
増殖時に添加すると効果が認められるが、特に対
数増殖期（培養開始後24時間前後）の添加が好ま
しい。添加方法は一度に添加するかまたは発酵状
態に応じて分割して添加できる。添加物の添加量
は培養液に対して0.05〜２％（ｗ／ｖ）、好まし
くは0.1〜0.5％（ｗ／ｖ）量である。 培養終了後、培養液から菌体を遠心または過
により常法で分離する。ここで得られた菌体中に
は補酵素Q₁₀が豊富に含有されているので、この
菌体を適当に処理後そのまま栄養剤、医療または
飼料に共することもできる。 また補酵素Q₁₀の単離が所望される場合には出
発物質としての菌体は生菌体または乾燥菌体ある
いは菌体処理物のいずれでも使用できる。補酵素
Q₁₀の単離の方法の一例としては、まずけん化す
るためにメタノール、苛性ソーダおよびピロガロ
ールの混液を菌体含有液に添加し、60〜90℃にお
いて１〜２時間還流加熱する。次いで不溶物を分
離した後、液相をｎ−ヘキサン等の溶媒で抽出す
る。溶媒層を水洗および脱水後濃縮する。濃縮物
をシリカゲル等のカラムに添加し、ベンゼンなど
で展開すると補酵素Q₁₀が溶出する。所定の画分
を濃縮乾固し、そしてエタノール可溶部分を冷却
放置すると赤黄色の補酵素Q₁₀の粗結晶が得られ
る。さらに再結晶を繰返すと補酵素Q₁₀の純粋な
結晶が得られる。包接化合物による分離、分子蒸
留等を行うことも効果的である。 補酵素Q₁₀の同定はUVスペクトル、融点測定、
アセトン／水（95：５）を展開溶媒とする逆相薄
層クロマトグラフイー、NMR、マススペクトル
等により標準品と比較することにより行つた。 つぎに本発明を実施例により具体的に説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。 実施例 １ グルコース２％、KH₂PO₄ 0.05％、K₂HPO₄
0.1％、MgSO₄・7H₂Ｏ 0.01％、Na₂SO₄
0.05％およびコーンステイープリカー１％を含有
する培地20mlにシユードモナスC1−36を植え付
けそして試験管内で30℃において振蘯培養した。
培養１日目にロイシン0.2％を添加して更に３日
間培養した。得られた補酵素Q₁₀の定量値は培地
１当り95mgであり、また乾燥菌体１ｇ当り21.4
mgであつた。 上記培地でロイシンを添加しないで培養した場
合の補酵素Q₁₀の定量は培地１当り64.8mgであ
り、そして乾燥菌体１ｇ当り12.8mgであつた。ロ
イシン添加により培地１当りの生産量は約47
％、そしてまた菌体１ｇ当りの生産量は約67％増
加した。 また補酵素Q₁₀以外の補酵素Ｑ同族体はロイシ
ン無添加の場合には12％であつたが、ロイシン添
加により７％まで低下した。 実施例 ２ 実施例１の培地に実施例１と同様の条件でシユ
ードモナスC1−36を植え付け培養した。培養１
日目にイソロイシン0.1％を添加して更に３日間
培養した。得られた補酵素Q₁₀の定量値は培地１
当り104.2mgであり、そして乾燥菌体１ｇ当り
22.3mgであつた。 上記培地でイソロイシン無添加の場合は補酵素
Q₁₀以外の補酵素Ｑ同族体の含有率は11％であつ
たがイソロイシン添加により補酵素Q₁₀以外の補
酵素Ｑ同族体の含有率は６％まで低下した。 実施例 ３ 実施例１と同じ培地にシユードモナスN842−
M16を植え付けて実施例１と同様の方法で培養し
た。培養１日目にバリン0.2％を添加して更に３
日間培養した。得られた補酵素Q₁₀の定量値は培
地１当り26mgでありそして乾燥菌体１ｇ当り
6.5mgであつた。 一方上記培地でバリンを添加しないで培養した
場合の補酵素Q₁₀の定量値は培地１当り16mgで
ありそして乾燥菌体１ｇ当り3.4mgであつた。上
記培地でバリンを添加しないで培養した場合には
補酵素Q₁₀以外の補酵素Ｑ同族体の含有率は９％
であつたが、バリンを添加した場合にはそれは５
％まで低下した。 実施例 ４ グルコース２％、Na₂SO₄ 0.05％、MgSO₄・
7H₂Ｏ 0.01％、KH₂PO₄ 0.1％、K₂HPO₄ 0.1
％およびコーンスチープリカー１％を含有する培
地20mlを試験管に入れ、シユードモナスN842−
M16を植菌しそして30℃で振盪培養する。培養１
日目に後記の添加物を記載の濃度で添加して更に
３日間振盪培養する。培養後、培養液（20ml）を
遠心分離して菌体を回収し、この菌体にアルカリ
性メタノール溶液（メタノール80ml、水20ml、
NaOH16ｇおよびピロガロール３ｇの混液）３
mlを加えそして60℃で２時間かん化する。不けん
化物をヘキサンで抽出し、ヘキサンを除去した後
エタノールを加えて溶液とする。このエタノール
溶液について275nmにおける酸化型および還元型
の吸光度を測定し、標品CoQ₁₀の検量線を用いて
総CoQ生産量を計算する。また高速液体クロマト
グラフイーによりCoQ₁₀の含有比を求め、総CoQ
生産量とCoQ₁₀含有比よりCoQ₁₀生産量と乾燥菌
体当りのCoQ₁₀含有率を計算する。なお乾燥菌体
収量は660nmの濁度より計算した。結果を次表に
示す。 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 菌体内に補酵素Q₁₀の蓄積能を有するシユー
   ドモナス属に属する細菌をロイシン、イソロイシ
   ンまたはバリンの存在下に培地中で培養しそして
   生成した菌体より補酵素Q₁₀を採取することを特
   徴とする、補酵素Q₁₀の製造法。 ２ 前記添加物が培養液に対して0.05〜２％
   （ｗ／ｖ）の量で添加される特許請求の範囲第１
   項記載の製造法。 ３ 前記添加物が細菌の対数増殖期に培地に添加
   される特許請求の範囲第１項記載の製造法。