CH647806A5 - Verfahren zur herstellung von d(-)-beta-hydroxyisobuttersaeure. - Google Patents

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CH647806A5
CH647806A5 CH8221/80A CH822180A CH647806A5 CH 647806 A5 CH647806 A5 CH 647806A5 CH 8221/80 A CH8221/80 A CH 8221/80A CH 822180 A CH822180 A CH 822180A CH 647806 A5 CH647806 A5 CH 647806A5
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acid
microorganism
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aqueous medium
candida
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CH8221/80A
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Junzo Hasegawa
Masahiro Ogura
Shigeki Hamaguchi
Masami Shimazaki
Hajime Kawaharada
Kiyoshi Watanabe
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Kanegafuchi Chemical Ind
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Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von D( —)-ß-Hydroxyisobuttersäure (die im folgenden auch als D-HIBA bezeichnet wird). Bei diesem Verfahren wird die besondere Fähigkeit von Mikroorganismen, optisch aktive Verbindungen durch asymmetrische Synthese zu erzeugen, ausgenützt.
D( —)-ß-Hydroxyisobuttersäure ist eines der nützlichen
Zwischenprodukte für die Synthese von physiologisch aktiven Substanzen mit asymmetrischen Kohlenstoffatomen, wie Arzneimitteln, z.B. l-(D-3-Mercapto-2-methylpropanoyl)-L-pro-lin, das ein Antihypertensivum ist.
Ein bekannte Verfahren zur Herstellung von ß-Hydroxy-isobuttersäure (die im folgenden auch als HIBA bezeichnet wird) ist die chemische Synthese derselben aus Formaldehyd und a-Brompropionsäureäthylester mit Hilfe der Refor-matsky-Reaktion (E.E. Blaise und I. Herman: Ann. Chim. et phys. 17,371, 1969); jedoch wird mittels dieses Verfahrens die optisch inaktive DL(±)-Form der ß-Hydroxyisobuttersäure erhalten. Dieses Verfahren ist daher nicht vorteilhaft für die Herstellung von optisch aktiver ß-Hydroxyisobuttersäure, da komplizierte Verfahren zur chemischen Aufspaltung in die optischen Antipoden, für die teure Reagentien, wie Chinin, verwendet werden müssen, erforderlich sind, um die optisch aktive ß-Hydroxyisobuttersäure zu erhalten (J. Retey und F. Lynen: Biochemische Zeitschrift 342,256-271, 1965). M. Sprecher und D.B. Sprinson (Journal of Biologica! Chemistry 241, 868, 1966) berichteten über ein Verfahren zur Herstellung von D( —)-ß-Hydroxyisobuttersäure durch chemische Synthese ohne Aufspaltung in die optischen Antipoden; das Ausgangsmaterial für dieses Verfahren, nämlich threo-3-Methyl-L-asparaginsäure, ist jedoch sehr teuer, und die Syntheseverfahren sind ausserordentlich kompliziert. Andererseits wurde auch ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiver ß-Hydroxyisobuttersäure durch Fermentierung unter Verwendung von Pseudomonas putida (Charles T. Geodhue und James R. Schaeffer: Biotechnology and Bioengineering 13, 203, 1971) bekannt; jedoch liegt die nach diesem Verfahren hergestellte ß-Hydroxyisobuttersäure in der L( + )-Form vor.
Somit gab es noch kein industriell vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von D( — )-ß-Hydroxyisobuttersäure. Es ist bereits oft gezeigt worden, dass mikrobielle Prozesse, bei denen die Fähigkeit von Mikroorganismen zur stereospezifischen Katalyse ausgenützt wird, für die Herstellung von optisch aktiven Verbindungen vorteilhafter sind als die chemische Aufspaltung von racemischen Verbindungen in die optischen Antipoden. Es wurde nun gefunden, dass es Mikroorganismen gibt, die Isobuttersäure (die im folgenden auch als IBA bezeichnet wird) oder Methacrylsäure (die im folgenden auch als MA bezeichnet wird) in D( -)-ß-Hydroxyisobut-tersäure überzuführen vermögen. Aufgrund dieser Feststellung wurde nun das erfindungsgemässe Verfahren zur fer-mentativen Herstellung von D( — )-ß-Hydroxyisobuttersäure aus Isobuttersäure oder Methacrylsäure oder einem Gemisch aus Isobuttersäure und Methacrylsäure entwickelt.
Im erfindungsgemässen Verfahren wird Isobuttersäure oder Methacrylsäure oder ein Gemisch aus Isobuttersäure und Methacrylsäure als Substrat verwendet; diese Substrate sind zu niedrigem Preis und in grossen Mengen leicht erhältlich. Sie werden der Einwirkung von Mikroorganismen unterworfen, die diese Substrate in D( — )-ß-Hydroxyisobuttersäure überzuführen vermögen. Die katalytische Überführung der Substrate in D( —)-ß-Hydroxyisobuttersäure kann auf zwei Weisen ausgeführt werden. Bei dereinen Ausführungsform wird der Mikroorganismus aerob in einem wässrigen Nährboden gezüchtet, der das Substrat enthält, wodurch die Vermehrung der Mikroorganismen und die Einwirkung des Mikroorganismus auf das Substrat gleichzeitig in einer Stufe erfolgen. Bei der anderen Ausführungsform wird der Mikroorganismus zuerst in einem wässrigen Nährboden gezüchtet; dann wird das Substrat zu der in der ersten Stufe erhaltenen Kulturflüssigkeit oder zu einer Suspension von daraus isolierten Zellen zugesetzt, und anschliessend wird das Gemisch aerob bebrütet. Die erfindungsgemäss verwendeten Mikroorganismen führen das Substrat selektiv und in hoher Ausbeute in die D( — )-Form der ß-Hydroxyisobuttersäure über; daher kann
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D( —)-ß-Hydroxyisobuttersäure erfindungsgemäss mittels eines einfachen Verfahrens mit geringen Unkosten hergestellt werden.
Die erfindungsgemäss verwendeten Mikroorganismen vermögen Isobuttersäure oder Methacrylsäure in D( —)-ß-Hydroxyisobuttersäure überzuführen und können mittels der folgenden Verfahren leicht aus Reinkulturen oder aus der Natur isolierten Stämmen selektiert werden:
Isobuttersäure oder Methacrylsäure wird in einer solchen Menge, dass eine Konzentration von ca. 2% (Gewicht/Volumen) erzielt wird, zu einer Kulturflüssigkeit gegeben, die durch Züchtung eines Mikrobenstammes in einem Nährboden, in dem der Teststamm zu wachsen vermag, erhalten worden ist. Die resultierende Kulturflüssigkeit, die auf pH 6 bis 9 eingestellt worden ist, wird 1 bis 3 Tage lang aerob bei 25 bis 35 °C bebrütet. Nach der Inkubation wird ein Salz mit hoher Wasserlöslichkeit, wie Ammoniumsulfat und Natriumsulfat, zu der Kulturflüssigkeit gegeben und der pH-Wert auf unter 2 herabgesetzt, um die Extraktion von D( —)-ß-Hydroxyisobut-tersäure aus der Kulturflüssigkeit zu erleichtern. Die Kulturflüssigkeit wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Äthylacetat, extrahiert. Die Lösungsmittelschicht wird eingedampft und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, worauf die optische Drehung des Extraktes in einer methanolischen Lösung bestimmt wird. Extraktproben, die Linksdrehung zeigen, werden ausgewählt und auf eine Kieselgeldünnschichtplatte aufgebracht. Wenn eine Probe die gleiche Beweglichkeit zeigt wie ß-Hydroxyisobuttersäure, vermag der zur Herstellung der Probe verwendete Mikroorganismus fast immer Isobuttersäure oder Methacrylsäure in D( — )-ß-Hydroxyisobuttersäure überzuführen. Um zu bestätigen, dass D( — )-ß-Hydroxyisobuttersäure erzeugt worden ist, wird die Extraktprobe durch Säulenchromatographie über Kieselgel weiter gereinigt, und die Struktur des gereinigten Präparates wird durch Instrumentenanalyse, wie magnetische Kernresonanz, Infrarot usw., bestimmt. Im Hinblick auf die bei diesem Screening von D( — )-ß-Hydroxy-isobuttersäure erzeugenden Mikroorganismen erhaltenen Resultate enthalten die meisten Kulturflüssigkeiten, aus denen mit Lösungsmitteln ein Extrakt gewonnen wird, der Linksdrehung zeigt, D( —)-ß-Hydroxyisobuttersäure. Daher ist dieses Screening-Verfahren einfach und erleichtert es sehr, Mikroorganismen aufzufinden, die aus Isobuttersäure oder Methacrylsäure D( — )-ß-Hydroxyisobuttersäure zu erzeugen vermögen.
Alle mittels des vorstehenden Screening-Verfahrens selektierten D(-)-ß-Hydroxyisobuttersäure erzeugenden Mikroorganismen können für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet werden; beispielsweise können zu den folgenden Gattungen gehörende Mikroorganismen verwendet werden: Candida, Torulopsis, Trygonopsis, Saccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Wingea, Rhodosporidium, Aspergillus, Choan-ephora und Zygorhynchus.
Von den Mikroorganismen, die zu den oben angegebenen Gattungen gehören, können z.B. die folgenden Stämme für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet werden: Candida rugosa IFO 0750, Candida rugosa IFO 0591, Candida parapsilosis IFO 0708, Candida utilis IFO 0396, Torulopsis candida IFO 0380, Trygonopsis variabilis IFO 0671, Saccharomyces cerevisiae IAM 4274, Saccharomyces rouxii IFO 0493, Pichia membranaefaciens IAM 4904, Debaryomyces hansenii IFO 0026, Wingea robertisii IFO 1277, Rhodosporidium toruloides IFO 0559, Aspergillus niger IAM 2532, Cho-anephora circinanus HUT 1324 und Zygorhynchus moelleri HUT 1305.
Fussnote:
IFO: Institute for Fermentation, Osaka; Juso Nishinoma-chi, Higashi-yodogawa-ku, Osaka, Japan.
IAM: Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo; 1-chôme, Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan.
HUT: Faculty of Engineering, Hiroshima University; 3-chome, Senda-machi, Hiroshima City, Japan.
Das Substrat kann auf zwei verschiedene Weisen der Einwirkung des Mikroorganismus unterworfen werden. Bei der einen Ausführungsform wird der Mikroorganismus aerob in einem wässrigen Medium gezüchtet, das das Substrat von Beginn der Züchtung an enthält, wodurch D( —)-ß-Hydroxy-isobuttersäure sich in dem Medium gleichzeitig mit der Vermehrung des Mikroorganismus anreichert. Bei der anderen Ausführungsform ist das Verfahren zweistufig, das heisst die Züchtung des Mikroorganismus und die Einwirkung des Mikroorganismus auf das Substrat erfolgen nacheinander. Die erste Stufe des zweistufigen Verfahrens kann ausgeführt werden, indem man den Mikroorganismus in einem wässrigen Nährboden züchtet. Die zweite Stufe des zweistufigen Verfahrens kann ausgeführt werden, indem man das Substrat zu einer in der ersten Stufe erhaltenen Kulturflüssigkeit oder zu einer Suspension von in der ersten Stufe erhaltenen Zellen zugibt, worauf man das resultierende Gemisch aerob bebrütet. Die Suspension von Zellen kann hergestellt werden, indem man die Zellen durch Zentrifugieren oder dergleichen aus einer Kulturflüssigkeit des Mikroorganismus abtrennt und die Zellen dann in einem geeigneten wässrigen Medium, wie einer wässrigen Phosphatpufferlösung, suspendiert. Da Enzyme von Mikroorganismen an der Reaktion des erfin-dungsgemässen Verfahrens beteiligt sind, können die abgetrennten Zellen auch verschiedenen Behandlungen, wie Trocknen und Homogenisierung usw., unterworfen werden, ehe sie in dem Medium suspendiert werden, um die Enzymreaktion zu beschleunigen. Daher kommt für das erfindungsgemässe Verfahren die Verwendung von auf verschiedene Weise behandelten Zellen in Betracht.
Jedes beliebige wässrige Medium, in dem der Mikroorganismus zu wachsen vermag, kann für die Züchtung des Mikroorganismus verwendet werden. Das Medium enthält gewöhnlich eine Quelle von Kohlenstoff, eine Quelle von Stickstoff und erforderlichenfalls eine Quelle von Mineralstoffen usw. Beispiele von Kohlenstoffquellen, die in dem Medium vorhanden sein können, sind Kohlehydrate, wie Glucose, Saccharose, Stärke, Hydrolysate und Melasse; organische Säuren, wie Essigsäure, Fumarsäure und Milchsäure; Alkohole, wie Methanol, Äthanol und Propanol; und ferner flüssige Kohlenwasserstoffe, wie n-Paraffine und Olefine, Öle und Fette, Glycerin usw., die von den verwendeten Mikroorganismen assimiliert werden können. Als Stickstoffquellen, die in dem Medium vorhanden sein können, kommen anorganische oder organische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniakwasser, Harnstoff, Aminosäuren, Pepton und Sojabohnenproteinhy-drolysate, in Betracht. Als Mineralstoffe können Kalium-, Magnesium-, Zink-, Eisen-, Mangan-, Kupfer- oder Cal-ciumsalze von anorganischen Säuren verwendet werden. Erforderlichenfalls können dem Medium Hefeextrakt, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Vitamine oder mit Nukleinsäuren verwandte Substanzen, wie Adenin und Guanin, zugesetzt werden.
Hinsichtlich der Züchtungsbedingungen besteht kein besonderer Unterschied zwischen den vorstehend beschriebenen beiden Verfahren. Die Züchtung des Mikroorganismus kann unter beliebigen Bedingungen ausgeführt werden, die es dem Mikroorganismus ermöglichen zu wachsen, vorzugsweise aber bei einem pH-Wert von 4,0 bis 9,5 und einer Temperatur von 20 bis 40 °C. Bei dem vorstehend beschriebenen zweistufigen Verfahren kann die Reaktion in der zweiten Stufe, die die Bildung derjenigen Enzyme des Mikroorganismus verursacht, die die Überführung des Substrates in
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D( —)-ß-Hydroxyisobuttersäure katalysieren, durch Zugabe einer kleinen Menge des Substrates zu dem Medium in der ersten Stufe begünstigt werden. Die Bebrütung in der zweiten Stufe des vorstehenden zweistufigen Verfahrens wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,0 bis 9,5 und einer Temperatur von 20 bis 40 °C ausgeführt.
Übliche Verfahren zur Extraktion und Reinigung einer organischen Säure, wie Extraktion mit Lösungsmitteln und Ionenaustausch, können für die Isolierung der D( —)-ß-Hydroxyisobuttersäure aus der Kulturflüssigkeit oder dem Reaktionsgemisch angewandt werden. Ein Beispiel eines wirksamen Gewinnungsverfahrens durch Extraktion mit einem Lösungsmittel verläuft folgendermassen: Die Kulturflüssigkeit oder das Reaktionsgemisch wird mit einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure oder Salzsäure, angesäuert; ein anorganisches Salz, wie Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat, wird erforderlichenfalls zugesetzt, um die Ionenstärke der Flüssigkeit oder des Gemisches zu erhöhen, und diese(s) wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Butanol, Methylisobutylketon oder Äthylacetat, extrahiert. Durch Eindampfen der Lösungsmittelschicht zur Trockene wird rohe D( — )-ß-Hydroxyisobuttersäure erhalten. Das so erhaltene D(-)-ß-Hydroxyisobuttersäurepräparat kann durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel usw. weiter gereinigt werden, wobei D( —)-ß-Hydroxyiso-buttersäure von hoher Reinheit erhalten wird.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung näher.
Beispiel 1
Candida rugosa IFO 0750, Candida rugosa IFO 0591, Candida parapsilosis IFO 0708, Candida utilis IFO 0396, Torulopsis candida IFO 0380, Trygonopsis variabilis IFO 0671, Saccharomyces cerevisiae IAM 4274, Saccharomyces rouxii IFO 0493, Pichia membranaefaciens IAM 4904, Debaryomyces hansenii IFO 0026, Wingea robertsii IFO 1277, Rhodosporidium toruloides IFO 0559, Aspergillus niger IAM 2532, Choanephora circinanus HUT 1324 und Zygorhynchus moelleri HUT 1305 wurden jeweils in einen Nährboden geimpft, der 40 g Glucose, 5 g Hefeextrakt, 3 g Pepton, 1 g Fleischextrakt und 20 g Isobuttersäure oder 20 g Methacrylsäure oder 20 g eines Gemisches, das aus gleichen Gewichtsmengen Isobuttersäure und Methacrylsäure bestand, enthielt. Die Mikroorganismen wurden jeweils in einem weithalsigen 3-Liter-Fermenter mit flachem Boden bei 30 ° C und pH = 7,5 unter Rühren mit 500 Umdrehungen pro Minute und Belüftung mit einem Volumen Luft pro Volumen Nährboden und pro Minute 24 Stunden lang gezüchtet. Dann wurde der pH-Wert auf 8,5 erhöht, worauf die Züchtung weitere 48 Stunden lang fortgesetzt wurde. Die so erhaltene Kulturflüssigkeit wurde mit Schwefelsäure bis pH = 2,0 angesäuert, mit Ammoniumsulfat gesättigt und mit dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Der über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknete Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Das aus einer öligen Substanz bestehende Konzentrat wurde in einer kleinen Menge Benzol gelöst und auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule aufgebracht. Diese Säule wurde zuerst mit einem Gemisch aus Benzol und Aceton (Volumenverhältnis 9:1) eluiert, um unveränderte Isobuttersäure bzw. Methacrylsäure zu entfernen, und dann mit einem Gemisch aus Benzol und Aceton (Volumenverhältnis 3:1), um D( — ^ß-Hydroxyisobuttersäure zu eluieren. Die D( —)-ß-Hydroxyisobutter-säure enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei eine viskose Flüssigkeit erhalten wurde. Die so erhaltene Flüssigkeit wurde durch Gaschromatographie, Dünnschichtchromatographie über Kieselgel, das magnetische Kernresonanzspektrum usw. als ß-Hydroxyisobuttersäure identifiziert. Die optische Drehung der einzelnen Produkte wurde bestimmt und ergab [a]o 13-18° (C = 3, Methanol), was beweist, dass die so von den einzelnen Mikroorganismen erzeugte ß-Hydroxyisobutter-säure in der D( — )-Form vorliegt. Die mittels des oben beschriebenen Verfahrens erhaltenen Ausbeuten an D( —)-ß-Hydroxyisobuttersäure sind in Tabelle I zusammen-gefasst.
Tabelle I Ausbeute an D-HIBA (g)
Mikroorganismus
Substrat
IBA
MA
IBA + MA
Candida rugosa, IFO 0750
8,2
7,9
7,8
Candida rugosa, IFO 0591
6,5
7,8
8,4
Candida parapsilosis, IFO 0708
5,5
6,2
5,5
Candida utilis, IFO 0396
5,4
8,8
5,3
Torulopsis candida, IFO 0380
2,1
1,1
3,6
Trygonopsis variabilis, IFO 0671
5,8
2,5
2,9
Saccharomyces cerevisiae, IAM 4274
3,2
1,7
3,3
Saccharomyces rouxii, IFO 0493
4,6
2,0
4,0
Pichia membranaefaciens, IAM 4904
7,0
1,3
1,9
Debaryomyces hansenii, IFO 0026
9,2
4,3
7,0
Wingea robertsii, IFO 1277
1,9
0,8
1,1
Rhodosporidium toruloides, IFO 0559
2,5
4,0
2,2
Aspergillus niger, IAM 2532
2,3
2,3
3,5
Choanephora circinanus, HUT 1324
1,8
1,5
0,6
Zygorhynchus moelleri, HUT 1305
1,3
1,1
1,5
Beispiel 2
Die gleichen Stämme, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurden, wurden jeweils in 1 Liter eines Nährbodens geimpft, der 20 g Glucose, 5 g Hefeextrakt und 1 g Isobuttersäure oder lg Methacrylsäure oder 1 g eines Gemisches aus gleichen Gewichtsmengen Isobuttersäure und Methacrylsäure enthielt. Die Mikroorganismen wurden jeweils in einem weithalsigen 3-Liter-Fermenter mit flachem Boden bei 30 °C und pH = 6,0 unter Rühren mit 500 Umdrehungen pro Minute und Belüftung mit 1 Volumen Luft pro Volumen Nährboden und pro Minute 20 Stunden lang gezüchtet. Dann wurden 30 g Isobuttersäure oder Methacrylsäure oder 30 g eines Gemisches aus gleichen Gewichtsmengen Isobuttersäure und Methacrylsäure zu der resultierenden Kulturflüssigkeit zugesetzt. Die auf pH = 8,5 gebrachte Kulturflüssigkeit wurde 72 Stunden lang bebrütet. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsgemisch in der gleichen Weise behandelt, wie in Beispiel 1 beschrieben, um D( — )-ß-Hydroxyisobuttersäure zu isolieren. Die optische Drehung der so erhaltenen D( — )-ß-Hydroxyisobut-tersäure lag im gleichen Bereich wie diejenige der in Beispiel 1 erhaltenen D( —)-ß-Hydroxyisobuttersäure. Die Ausbeuten an D( — )-ß-Hydroxyisobuttersäure sind in Tabelle II zusam-mengefasst.
Tabelle II Ausbeute an D-HIBA (g)
Mikroorganismus Substrat
IBA MA IBA + MA
Candida rugosa, IFO 0750
8,3
10,2
7,8
Candida rugosa, IFO 0591
6,1
9,4
8,5
Candida parapsilosis, IFO 0708
7,7
10,5
9,7
Candida utilis, IFO 0396
5,7
6,1
4,7
Torulopsis candida, IFO 0380
1,9
1,6
3,3
Trygonopsis variabilis, IFO 0671
5,0
4,3
3,6
Saccharomyces cerevisiae, IAM 4274
3,2
1,5
3,8
Saccharomyces rouxii, IFO 0493
4,4
1,8
2,0
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40
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50
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Mikroorganismus
Substrat
IBA
MA
IBA + MA
Pichia membranaefaciens, IAM 4904
4,5
1,7
1,8
Debaryomyces hansenii, IFO 0026
8,5
5,9
8,6
Wingea robertsii, IFO 1277
2,2
0,6
3,1
Rhodosporidium toruloides, IFO 0559
2,4
0,8
2,5
Aspergillus niger, IAM 2532
2,3
1,0
1,2
Choanephora circinanus, HUT 1324
0,9
0,7
0,5
Zygorhynchus moelleri, HUT 1305
1,8
0,9
2,2
Beispiel 3
Die gleichen Stämme, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurden, wurden jeweils in 1 Liter eines Nährbodens geimpft, der 15 20 g Glucose, 5 g Hefeextrakt, 3 g Pepton, 3 g Fleischextrakt und 1 g Isobuttersäure oder 1 g Methacrylsäure oder 1 g eines Gemisches aus gleichen Gewichtsmengen Isobuttersäure und Methacrylsäure enthielt. Die Mikroorganismen wurden jeweils in einem weithalsigen 3-Liter-Fermenter mit flachem 20 Boden bei 30 °C und pH = 6,0 unter Rühren mit 500 Umdrehungen pro Minute und Belüftung mit 1 Volumen Luft pro Volumen Nährboden und pro Minute 24 Stunden lang gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren aus der so erhaltenen Kulturflüssigkeit geerntet, zweimal mit einer 25 0,9%igen Kochsalzlösung gewaschen und in '/ismolarem Phosphatpuffer (pH = 8,5) suspendiert. Zu der Zellensuspension wurden 30 g Isobuttersäure oder Methacrylsäure oder 30 g eines Gemisches aus Isobuttersäure und Methacrylsäure (Gewichtsverhältnis Isobuttersäure zu Methacrylsäure gleich 30 1:1) und 30 g Glucose zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde 48 Stunden lang bei pH = 8,5 bebrütet. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsgemisch in der gleichen Weise behandelt, wie in Beispiel 1 beschrieben, um D( — )-ß-Hydroxyisobuttersäure zu isolieren. Die optische Drehung der so erhaltenen D( —)-ß-Hydroxyisobuttersäure lag im gleichen Bereich wie diejenige der in Beispiel 1 erhaltenen D( - )-ß-Hydroxyisobuttersäure. Die Ausbeuten an D(-)-ß-Hydroxyisobuttersäure sind in Tabelle III zusam-mengefasst.
Tabelle III Ausbeute an D-HIBA (g)
Mikroorganismus Substrat
IBA MA IBA + MA
Candida rugosa, IFO 0750
9,4
9,2
8,8
Candida rugosa, IFO 0591
8,3
7,7
9,5
Candida parapsilosis, IFO 0708
11,0
9,9
9,3
Candida utilis, IFO 0396
6,2
5,9
4,4
Torulopsis candida, IFO 0380
2,1
1,5
2,0
Trygonopsis variabilis, IFO 0671
4,4
5,0
4,6
Saccharomyces cerevisiae, IAM 4274
2,5
2,1
1,8
Saccharomyces rouxii, IFO 0493
3,6
3,3
4,2
Pichia membranaefaciens, IAM 4904
7,4
8,5
8,8
Debaryomyces hansenii, IFO 0026
6,2
4,7
5,1
Wingea robertsii, IFO 1277
1,5
1,6
1,3
Rhodosporidium toruloides, IFO 0559
2,0
1,5
1,7
Aspergillus niger, IAM 2532
0,7
1,2
1,4
Choanephora circinanus, HUT 1324
1,1
1,8
2,2
Zygorhynchus moelleri, HUT 1305
1,6
2,2
1,6
G

Claims (10)

647 806
1. Verfahren zur Herstellung von D( —)-ß-Hydroxyisobut-tersäure, dadurch gekennzeichnet, dass man Isobuttersäure oder Methacrylsäure oder ein Gemisch aus Isobuttersäure und Methacrylsäure als Substrat verwendet, das Substrat in einem wässrigen Medium der Einwirkung eines Mikroorganismus, der das Substrat in D(- )-ß-Hydroxyisobuttersäure überzuführen vermag, unterwirft und D( — )-ß-Hydroxyiso-buttersäure aus dem Medium gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus verwendet, der zu einer der folgenden Gattungen gehört: Candida, Torulopsis, Trygonop-sis, Saccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Wingea, Rhodo-sporidium, Aspergillus, Choanephora und Zygorhynchus.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus verwendet, der zu einer der folgenden Arten gehört: Candida rugosa, Candida parapsilo-sis, Candida utilis, Torulopsis candida, Trygonopsis variabi-lis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces rouxii, Pichia membranaefaciens, Debaryomyces hansenii, Wingea robert-sii, Rhodosporidium toruloides, Aspergillus niger, Choanephora circinanus und Zygorhynchus moelleri.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man den Mikroorganismus in einem wässrigen Medium, das das Substrat enthält, aerob züchtet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung bei einem pH-Wert von 4 bis 9,5 und einer Temperatur von 20 bis 40 °C ausführt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Substrat zu einer Kulturflüssigkeit gibt, die durch Züchtung des Mikroorganismus in einem wässrigen Medium erhalten wurde, und das resultierende Gemisch dann aerob bebrütet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Substrat zu einer Zellensuspension gibt, die durch Abtrennen von Zellen aus einer Kulturflüssigkeit, die durch Züchten des Mikroorganismus in einem wässrigen Medium erhalten wurde, und anschliessendes Suspendieren der Zellen in einem wässrigen Medium hergestellt wurde, und das resultierende Gemisch dann aerob bebrütet.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass man dem wässrigen Medium eine kleine Menge Isobuttersäure oder Methacrylsäure oder eines Gemisches aus Isobuttersäure und Methacrylsäure zusetzt, wenn der Mikroorganismus gezüchtet wird, um die Bildung von Enzymen des Mikroorganismus herbeizuführen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man den Mikroorganismus bei einem pH-Wert von 4,0 bis 9,5 und einer Temperatur von 20 bis 40 °C züchtet und das Gemisch bei einem pH-Wert von 6,0 bis 9,5 und einer Temperatur von 20 bis 40 °C bebrütet.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die D( —)-ß-Hydroxyisobuttersäure aus dem wässrigen Medium durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, vorzugsweise Buta-nol, Methylisobutylketon oder Äthylacetat, gewinnt.
CH8221/80A 1979-11-06 1980-11-05 Verfahren zur herstellung von d(-)-beta-hydroxyisobuttersaeure. CH647806A5 (de)

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