NL8006026A

NL8006026A - Werkwijze voor het bereiden van d(-)-beta-hydroxyiso- boterzuur.

Info

Publication number: NL8006026A
Application number: NL8006026A
Authority: NL
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Ind
Priority date: 1979-11-06
Filing date: 1980-11-04
Publication date: 1981-06-01
Also published as: DE3041224A1; IT8050073A1; ES8200400A1; NL192833B; IT8050073A0; CH647806A5; ES496563A0; GB2063873A; DE3041224C2; GB2063873B; FR2468646B1; IE802291L; FR2468646A1; NL192833C; IT1188962B; US4310635A; IE50473B1

Description

* α " fi vo 113¾ ft

Betr.: Werkwijze voor het "bereiden van D (-) - jö-hydr oxyi s oboter zuur.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het "bereiden van D(-)-^hydroxyisoboterzuur (verder D-HIBA genoemd). Meer in het "bijzonder heeft de uitvinding "betrekking op een werkwijze voor het op een voordelige wijze "bereiden van D-HIBA., waarbij gebruik wordt genaakt van 5 het bijzonder vermogen van microorganismen cm optisch actieve verbindingen door asymmetrische synthese te produceren.

D-HIBA is een bruikbaar tussenprodukt voor het bereiden van fysiologisch actieve materialen met asymmetrische koolstofatomen, zoals medicijnen, waarvan het antihypertensieve l-(D-3-mercapto-2-methyl-propa-10 noyl)-L-proline een voorbeeld is.

Als werkwijzen voor de bereiding van β -hydroxyisoboterzuur (verder aangeduid als HIBA), is b.v. de chemische synthese uit formaldehyde en ethyliA-broampropionaat door de Reformatsky-reactie bekend (E.E. Blaise en I. Herman : Ann. Chim. et phys. 17, 371» 1969); het volgens deze 15 werkwijze verkregen HIBA is echter de optisch inactieve DL(-)vorm. Deze werkwijze is derhalve nadelig voor de bereiding van optisch actief HIBA omdat gecompliceerde chemische seheidingswerkwijzen waarbij een duur reagens, zoals chinine gebruikt wordt, verder vereist zijn om het te kunnen verkrijgen (J. Retey en F. Lynen: Biochemische Zeitschrift, 20 3l2, 256-271, 1965)· Een werkwijze voor het verkrijgen van D-HIBA door chemische synthese zonder optische scheiding is beschreven door M.Sprecher en D.B. Prinson (Journal of Biological chemistry, 2hl, 868, 1966); het uitgangsmateriaal bij deze werkwijze, threo-3-methyl-L-aspartinezuur, is echter zeer duur en de synthetische procedures zijn buitengewoon ge-25 compliceerd. Anderzijds is een werkwijze voor het bereiden van optisch actief HIBA door fermentatie onder toepassing van Pseudcmonas putide voorgesteld (Charles T. Geodhue en James H. Schaeffer: Biotechnology and Bioengineering 13, 203, 1971); het door deze werkwijze geproduceerde HIBA is echter de L(+)vorm.

30 Er bestaat derhalve geen industrieel voordelige werkwijze voor de bereiding van D-HIBA. De uitvinders hebben opgemerkt, dat microbiologische werkwijzen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de stereospecifieke katalyse-eigenschappen van microorganismen, vaak veel voordeliger zijn gebleken voor de bereiding van optisch actieve verbindingen dan de che-35 mische scheiding van racemische verbindingen. De uitvinders hebben nu ge- q η n a n o a -2- vonden, dat er microorganismen "bestaan die het vermogen bezitten cm iso-hoterzuur (verder aangeduid als IM) of methacrylzuur (verder aangeduid als MA.) cm te zetten in D-HIBA. Gebaseerd op deze vondst hebben de uitvinders de uitvinding voltooid, welke een fermentatieve methode voor de 5 bereiding van D-HIBA uit IBA, MA of een mengsel van IBA en MA behelst.

Volgens de uitvinding wordt een substraat, gekozen uit de groep IBA, MA en een mengsel daarvan, dat gemakkelijk tegen lage kosten en in grote hoeveelheden kan worden verkregen, onderworpen aan de werking van een mier oor ganisme met het vermogen cm het substraat cm te zetten in 10 D-HIBA. Omzetting van het substraat in D-HIBA door katalyse vaxhet micro-organisme wordt pp twee wijzen uitgevoerd. Volgens de ene wijze wordt het microörganisme aëroob in een waterig voedingsmedium, dat het substraat bevat, gekweekt waardoor de vermenigvuldiging van het microörganisme en de onderwerping van het substraat aan de werking van het microorganisme 15 gelijktijdig in een trap worden uitgevoerd. Volgens de andere wijze wordt het microörganisme eerst in een waterig voedingsmedium gekweekt, vervolgens het substraat aan de verkregen cultuurvloeistof of aan de in de eerste trap verkregen cellensuspensie toegevoegd, en wordt het mengsel daarna aëroob geincubeerd. Microorganismen die volgens de uitvinding 20 worden gebruikt, zetten het substraat in alleen de D(-‘—)vorm van HIBA cm in hoge opbrengst; aldus kan volgens de uitvinding D-HIBA volgens een eenvoudige werkwijze tegen geringe kosten worden bereid.

Volgens de uitvinding toegepaste microorganismen hebben het vermogen cm IBA of MA om te zetten in D-HIBA en kunnen gemakkelijk uitge-25 kweekte typen of uit de natuur geïsoleerde stammen worden geselecteerd door de volgende werkwijzen: IBA of MA wordt in een hoeveelheid waarmede een concentratie van ongeveer 2% v/v wordt bereikt, toegevoegd aan een cultuurvloeistof, die verkregen is door een microbe stam te kweken in een voedingsmedium waarin 30' de teststam kan groeien. De verkregen cultuurvloeistof, ingesteld op een pH 6-9, wordt gedurende 1-3 dagen bij 25-35°C aëroob geincubeerd. Na incubatie wordt een zeer goed in water oplosbaar zout, zoals ammonium-sulfaat en natriumsulfaat, aan de cultuurvloeistof toegevoegd en de pH tot beneden 2 verlaagd om extractie van D-HIBA uit de cultuurvloeistof 35 te vergemakkelijken. De cultuurvloeistof wordt met een niet met water 8006026

Jr ** -3- mengbaar oplosmiddel, zoals ethylacetaat, geëxtraheerd. De oplosmi ddel-laag wordt verdaagt en gedroogd hoven watervrij natriumsulfaat, waarna de optische rotatie van het extract in een methanoloplossing wordt gemeten. Extractmonsters die linksdraaiïng (levorotatie) vertonen worden ge-5 selecteerd en op een silicageldunnelaagplaataangebracht. Wanneer een monster dezelfde mobiliteit als HIM vertoont, heeft het voor de bereiding vaahet monster toegepaste microörganisme vrijwel steeds het vermogen cel IM of MA in D-HIM cm te zetten. Om de bereiding van D-HIM te bevestigen, wordt het extractmonster verder door kolcmchromatografie over sili-10 ca-gel gezuiverd en wordt de structuur van het gezuiverde preparaat door instrumentele analyse, zoals HMR, IE enz. vastgesteld. Gezien de resultaten die bij deze selectering van D-HIM producerende microorganismen zijn verkregen, bevatten de meeste cultuurvloeistoffen waarvan een op-losmiddelextract levorotatie vertoont, D-HIM. Deze selectieprocedure 15 is derhalve eenvoudig en maakt het zeer gemakkelijk cm microorganismen te vinden, die in staat zijn cm D-HIM te prdduceren uit IM of MA.

Alle D-ΗΓΜ producerende microorganismen, die door de bovenstaand beschreven selectieprocedure zijn geselecteerd, kunnen volgens de uitvinding worden toegepast; microorganismen die tot de volgende genera 20 behoren, kunnen b.'v. worden toegepast: Candia, Torulopsis, Trygonopsis, : Saccharcmyces, Pichia, Debaryamyces, Wingea, Bhodosporidium, Aspergillus, Choanephora en Zygorhynchus.

Van de tot de bovenstaand vermelde genera behorende microorganismen worden b.v. de volgende stammen volgens de uitvinding toegepast: 25 Candida rugosa IFO 0750, Candida rugosa IFO 0591* Candida para- psilosis IF0 0708, Candida utilis IF0 0396» Torulopsis Candida IF0 0380, Trygonopsis variabilis IF0 0671, Saccharcmyces cerevisiae IAM ^27^» Saccharcmyces rouxii IFO 0U93, Pichia membranaefaciens IAM i+90U, De-barycmyces hansenii IF0 0026, Wingea robertsii IF0 1277, Ehodosporidium 30 toruloides IF0 0559, Aspergillus niger IAM 2532, Choanephora circinanus HUT 132It, en Zygorhynchus moelleri HUT 1305·

Opmerking: IFO: Institute-"for Fermentation,

Osaka; Juso Hishinomachi, Higashi-yodogawa-ku, 35 Osaka, Japan.

8006026 -U- IAM : Institute of Applied Microbiology,

Universiteit van Tokyo; 1-chome, Yayoi, Kunkyo-ku,

Tokyo, Japan.

HUT : Faculty of Engineering, 5 Hiroshima Universiteit, 3-chcme, Senda-machi,

Hiroshima City, Japan.

Het substraat kan op twee manieren aan de werking van het micro-organisme worden onderworpen. Volgens de ene manier wordt het micro-organisme aëroob gekweekt in een waterig medium, dat substraat vanaf het 10 begin van de kweekproeedure bevat, waardoor D-HIBA zich in het medium ophoopt terwijl tegelijkertijd het microorganisme zich vermenigvuldigt. Volgens de andere manier bestaat de werkwijze uit twee trappen, d.w.z. het kweken van het microorganisme en het onderwerpen van het substraat aan de werking van het microorganisme. De eerste trap van deze twee-15 trapswerkwijze kan worden uitgevoerd door het microorganisme in een waterig voedingsmedium te kweken. De tweede trap van deze tweetraps-werkwijze kan worden uitgevoerd door het substraat toe te voegen aan een in de eerste trap verkregm cultuurvloeistof of cellensuspensie, gevolgd door het verkregen mengsel aëroob te incuberen. De cellensus-20 pensie wordt bereid door cellen van een cultuurvloeistof van het microorganisme af te scheiden door centrifugeren, enz., gevolgd door suspenderen van de cellen in een geschikt waterig medium, zoals een waterige fosfaatbufferoplossing. Omdat enzymen van microörganismen bij de reactie van de werkwijze volgens de uitvinding zijn betrokken, kunnen de 25 afgescheiden cellen ook aan verschillende behandelingen, zoals drogen en homogenisatie enz. worden onderworpen, voordat ze in het medium worden gesuspendeerd teneinde de enzymreactie te bevorderen. Derhalve valt het gebruik van cellen die op verschillende wijzen zijn behandeld, eveneens onder de bes chermings omvang.

30 Voor het kweken van het microorganisme kan elk medium, waarin het gebruikte microorganisme kan groeien, worden toegepast. Het medium bevat gewoonlijk een koolstofbron, een stikstofbrcn, en indien nodig een bron voor mineralen enz. Voorbeelden van koolstofbronnen in het medium zijn koolhydraten, zoals glucose, sucrose, zetmeel, hydrolysaten en 35 melasses; organische zuren zoals azijnzuur, fumaarzuur en melkzuur; 8 0 06 0 2 6 4Γ- -5- alcoholen zoals methanol, ethanol en propanol; en verder vloeibare koolwaterstoffen zoals n-paraffinen en alkenen, oliën en vetten, glycerol enz., die door het gebruikte microörganisme kunnen worden geassimileerd. Als stikstofbrcn in het medium kwaaien anorganische of organische ver-5 bindingen, zoals ammoniumsulfaat, ammoniumchloride, ammoniumfosfaat, ammonia, ureum, aminozuren, pepton, en hydrolysaten van sojaboneneiwit worden toegepast. Als mineralen in het medium kunnen anorganische zure-zouten van kalium, magnesium, zink, ijzer, mangaan, koper of calcium worden gebruikt. Indien nodig kan gistextract, vleesextract, maisweek-10 vloeistof, vitaminen, of aan nucelinezuur verbonden materialen, zoals adenine en guanine aan het medium worden toegevoegd.

Wat de kweek omstandigheden betreft, bestaat er geen bijzonder verschil tussen de bovenstaande twee methoden. Het kweken van het micro-organisme kan worden uitgevoerd onder alle omstandigheden die toelaten 15 dat het microorganisme groeit, maar bij voorkeur wordt een pH van ongeveer k,0 tot ongeveer 9,5 en een temperatuur van ongeveer 20 tot ongeveerd ^0°C gebruikt. In de bovenstaand vérmelde tweetrapswerkwijze wordt de reactie in de tweede trap bevorderd door de enzymen van het microorganisme, die de omzetting van het substraat in D-HIBA katalyseren, 20 te induceren door een kleine hoeveelheid van het substraat aan het medium in de eerste trap toe te voegen. Incubatie van de tweede trap in de bovenstaand vermelde tweetrapswerkwijze kan bij voorkeur worden uitgevoerd bij een pH van ongeveer 6,Ottot ongeveer 9,5 en een temperatuur van ongeveer 20 tot ongeveer U0°C.

25 Voor het isoleren van D-HIBA uit de cultuurvloeistof of het reac- tiemengsel, kunnen gebruikelijke werkwijzen voor het extraheren en zuiveren van een organisch zuur, b.v. een cplosmiddelextractie en ionenuitwisseling, worden toegepast. Een voorbeeld van een efficiënte win-ningsmethode door oplosmiddelextractie wordt thans gegeven. De cul-30 tuurvloeistof of reactiemengsel wordt aangezuurd met een organisch zuur, zoals zwavelzuur of zoutzuur, een anorganisch zout, zoals ammoniumsul-faat en natriumsulfaat worden daaraan indien nodig toegevoegd om de ion-sterkte van de vloeistof of het mengsel te verhogen, en met een met water niet mengbaar oplosmiddel, zoals butanol, methylisobutylketon en 35 ethylacetaat wordt geëxtraheerd. Ruw D-HIBA wordt door droogdampen van de 8006026 -6- oplosmiddellaag verkregen. Het aldus verkregen D-Hiba-preparaat kan verder worden gezuiverd door kolanchramatografie onder toepassing van silica-gel enz., waarbij D-HIBA van hoge zuiverheid wordt verkregen.

De uitvinding wordt aan de hand van de voorbeelden nader toege- 5 licht.

Voorbeeld I:

Candida rugosa IFO 0750, Candida rugosa IFO 0591, Candida para-psilosis IFO 0708, Candida utilis IFO 0396, Torulopsis Candida IFO 03Ö0, Trygonopsis variabilis IFO 0671, Saccharcmyces cerevisiae IAM H27^, 10 Saccarcmyces rouxii IFO 0^93, Pichia membranaefaciens IAM i+90U, De- barycmyces hansenii IFO 0026, Wingea robertsii IFO 1277, Rhodospóridium toruloides IFO 0559, Aspergillus niger IAM 2532, Choanephora circinanus HUT 132U, en Zygorhynchus moelleri HJT 1305 werden elk geënt in een medium dat i+0 g glucose, 50 g gistextract, 3 g pept on, 1 g vleesextr act; en 15 20 g IBA of 20 g MA of 20 g van een mengsel van gelijke gewichtshoeveel- heden IBA en MA bevatte. De microorgaaismen werden elk in een 3 liter gistbeker bij 30°C, een pH van 7,5, agitatie met 500 tpm, en beluchting 1 w gedurende 2k uur gekweekt. Daarna werd de pH tot 8,5 verhoogd en de kweek gedurende nog eens U8 uren voortgezet. De aldus verkregen cul-20 tuurvloeistof werd met zwavelzuur aangezuurd tot een pH van 2,0, met ammoniumsulfaat verzadigd en met ethylacetaat in een gelijke volume-hoeveelheid als de cultuurvloeistof geëxtraheerd. Het extract werd boven watervri'j: natriumsulf aat gédroogd en onder verminderde druk ge-concentreerd. Het geconcentreerde olieachtige materiaal, werd opgelost 25 in een kleine hoeveelheid benzeen en op een kolom gebracht die met silica-gel was verpakt. De elutie werd eerst met benzeen-acetan (volumeverhou-ding 9:l) voor het verwijderen van ongewijzigd IBA of MA, en vervolgens met benzeen-acetan (volumeverhouding 3:l) voor het elueren van D-HIBA uitgevoerd. D-HIBA bevattende fracties werden gecombineerd en onder ver-30 minderde druk geconcentreerd, waarbij een viskeuze vloeistof werd verkregen. De aldus verkregen vloeistof werd als HIBA geïdentificeerd door gaschramatografie, silicageldunnelaagchrcmatografie, ÏÏMR-spectra, enz.

De optische rotatie van elk produkt werd gemeten, waarbij als resultaat werd gevonden 13-18° (C=3, methanol) , hetwelk aantocnt dat het door 35 elk mieroorganisme geproduceerde HIBA de D(-)vorm bezat. De opbrengsten aan D-HIBA, verkregen door de bovenstaand beschreven werkwijze, staan in tabel A.

8006026 -7- * ï

TABEL A

Opbrengst aan D-HIBA (g) ---1-,-1- * » substraat i \ ; microörganisme ^ j IBA MA ΙΙΒΑ-βίΑ >— ---------- ------- - —|-[-j- 5 Candicferugosa IFO 0750 i 8,2 7,9 ! 7»8 I j

Candida rugosa IFO 0591 j 6,5 7,8 j 8,^

Candida parapsilosis IFO 0708 ; 5,5 6,2 5»5

Candidautilis IFO 0396 ! 5,U I 8,8 5>3

Torulopsis Candida IFO 0380 j 2,1 1,1 3,6 10 Trygonopsis variabilis IFO 0671 ! 5,8 2,5 2,9

Saccharamyces cerevisiae IAM i+27^ 3,2 1,7 3,3

Saccharamyces rouxii IFO 0^93 U,6 2,0 ^,0

Pichia membranaefaciens IAM U90I+ 7,0 1,3 1,9

Debaryamyces hansenii IFO 0026 9,2 ^,3 7,0 15 Wingea robertsii IFO 1277 1,9 0,8 1,1

Bbodosporidium toruloides IFO 0559 j 2,5 H,0 2,2

Aspergillus niger IAM 2532 | 2,3 2,3 3,5

Choanephora circinanus HUT 132U ; 1,8 1,5 0,6

Zygorhynchus moelleri HUT 1305 1,3 1,1 1,5 20 _______

Voorbeeld II:

Dezelfde stammen als in voorbeeld I verden gebruikt, verden elk geënt in 1 liter van een medium, dat 20 g glucose, 5 g gistextract; 1 g IBA of 1 g MA, of 1 g van een mengsel van gelijke gevichtshoeveel-25 beden IBA en MA bevatte. De microorganismen verden elk gekveekt in een 3 liter gistbéker bij 30°C, pH 6,0, agitatie 500 %m en beluchting 1 wm gedurende 20 uur. Daarna verd 30 g IBA, MA of van een mengsel van gelijke gevichtshoeveelheden IBA en MA aan de verkregen cultuur-vloeistof toegevoegd. De op een pïï van 8,5 ingestelde cultuurvloeistof 30 verd gedurende 72 uren gexncubeerd. Na de incubatie verd het reactie-mengsel qp dezelfde vijze als in voorbeeld I is beschreven behandeld, 8006026 -8- waarbij D-HIBA. werd verkregen. Het aldus verkregen D-HIBA vertoonde dezelfde optische rotatiewaarden als in voorbeeld I. De opbrengsten aan D-HIBA staan in tabel B.

_Tabel B_ 5 Opbrengst aan D-HIBA (g)

substraat m M IBA + M

microorganisme '

Candida rugosa IfO 0T50 8,3 10,2 7»8 10 Candida rugosa IFO 0591 6,1 9 ,1 8,5

Candida parapsilosis IK) 0708 7,7 10,5 9,7

Candida utilis IFO 0396 5,7 6,1 1,7

Torulopsis candidalFO 0380 1,9 1,6 3,3

Trygonopsis variabilis IF0 0671 5,0 1,3 3,6 15 Saccharcmyces cerevisiae IAM l27l 3,2 1,5 3,8

Saccharcmyces rouxii IFO 0l93 1,1 1,8 2,0

Pichia membranaefaciens IAM l90l 1,5 1,7 1*8

Debarycmyces hansenii IFO 0026 8,5 5,9 8,6.

Wingea robertsii IFO 1277 2,2 0,6 3,1 20 Rhodosporidium toruloides IFO 0559 2,1 0,8 2,5

Aspergillus niger IAM 2532 2,3 1,0 1,2

Choanephora circinanus HUT 1321 0,9 0,7 S»5-

Zygorhynchus moelieri HUT 1305 1,8 0,9 2,2 25 Voorbeeld III:

Dezelfde stammen als in voorbeeld I werden gebruikt, werden elk geënt in 1 liter van een medium, dat 20 g glucose, 5 g gistextract,

3 g pepton, 3 g vleesextract; 1 g IBA of 1 g MA of 1 g van een mengsel van gelijke gewichtshoeveelheden IBA en MA bevatte. De microörganismen 30 werden elk gekweekt in een 3 liter fermentatiebeker bij 30°C, pH

6,0, agitatie 500 tpm, en beluchting 1 wm gedurende 2l uur. De cellen werden door centrifugeren van de aldus verkregen cultuurvloeistof verzameld, tweemaal met een 0,9 %-ige pekeloplossing gewassen, en gesuspendeerd in 1/15 M fosfaatbuffer (pH 8,5). Aan de cellensuspensie 35 werd 30 g IBA, MA of 30 g van een mengsel van IBA en MA (in een 1:1 8006026 -9- gewichtsverhouding) alsmede 30 g glucose toegevoegd. Eet verkregen mengsel werd gedurende U8 uur bij een pH van 8,5 geincubeerd. Ha de incubatie werd het reactiemengsel c-p dezelfde wijze als beschrevenin voorbeeld I behandeld, waarbij D-HIBA werd verkregen. Het aldus verkregen 5 D-HIBA vertoonde dezelfde optische rotatiewaarden als in voorbeeld I.

De opbrengsten aan D-HIBA staan in tabel C.

Tabel C

opbrengst aan D-HIBA (O) ^__ substraat |

10 mier oor ganisme IBA MA j IBA+ MA

Candida rugosa IFO 0750 9»^· 9,2 8,8

Candida rugosa IFO 0591 8,3 7,7 9,5

Candida parapsilosis IF0 0708 11,0 9,9 9,3

Candida utilis IF0 0396 6,2 5,9 M

15 Torulopsis Candida HO 0380 2,1 1,5 2,0

Trygonopsis variabilis IF0 0β71 U 5,0 b,6

Saccharamyees cerevisiae IAM ^27^ 2,5 2,1 1,8

Saccharamyees rouxii IFO 0U93 3,6 3,3 b,2

Eichia membranaefaciens IAM ^90^ 7Λ 8,5 8,8 20 Debaryamyces hansenii IF0 0026 6,2 if-,7 5,1

Wingea robertsii IF0 1277 1,5 I i»6 1,3

BhodosporiiHumtoruloides IFO 0559 2,0 | 1,5 1,7

Arpergillus niger IAM 2532 0,7 1,2 ; l,k

Choanephora circinanus HUT 132^ 1,1 1,8 ! 2,2 25 Zygorhynchus moelleri HUT 1305 1,6 2,2 j 1,6 8006026

Claims

1. Werkwijze voor het "bereiden van D(-)-/Vbydroxyisoboterzuur, met het kenmerk, dat men een substraat, gekozen uit de groep isoboterzuur, methacrylzuur en een mengsel van isoboterzuur en methacrylzuur onderwerpt aan de werking van een microorganisme met het vermogen om het substraat 5 cm te zetten in D(-)- ^hydroxyisoboterzuur in een waterig medium en men D(-)-d-hydroxyisoboterzuur uit het medium wint.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het microorganisme behoort tot een genus gekozen uit de groep Candida, Torulopsis, Trygonopsis, Saceharcmyces, Pichia, Debarycmyces, Wingea, Rhodosporidium, *

10 Aspergillus, Choaaephora en Zygorhynchus.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het microorganisme behoort tot een soort, gekozen uit de groep Candida rugosa, Candida parapsilosis, Candida utilis, Torulopsis Candida, Trygonopsis variabilis, Saceharcmyces cerevisiae, Saceharcmyces rouxii, Pichia 15 membranaefaciens, Debaryomyces hansenii, Wingea robertsii, Rhodosporidium toruloides, Aspergillus niger, Chöanephora eircinanus en Zygorhynchus moelleri. U. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 1-3» met het kenmerk, dat het microorganisme aëroob gekweekt wordt in een waterig 20 medium dat het substraat bevat.

5. Werkwijze volgens conclusie h, met het kenmerk, dat het kweken wordt uitgevoerd bij een pH van ongeveer 1+-9,5 en een temperatuur van ongeveer 20-1+0 °C.

6. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 1-3» met het 25 kenmerk, dat het substraat wordt toegevoegd aan een cultuurvloeistof, verkregen door kweken van het microorganisme in een waterig medium, en dat het verkregen mengsel vervolgens aëroob geïncubeerd wordt.

7· Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat een kleine hoeveelheid isoboterzuur, methacrylzuur of een mengsel van isoboterzuur 30 en methacrylzuur aan het waterige medium wordt toegevoegd wanneer het microorganisme wordt gekweekt cm enzymen van het microorganisme te induceren.

8. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het micro-35 organisme wordt gekweekt bij een pH van ongeveer 1+,0-9,5 en een tempera- 8006026 -11- tuur van ongeveer 20-40°C en dat het mengsel geïncubeerd wordt hij een pH van ongeveer 6,0-9,5 en een temperatuur van ongeveer 20-4o°C.

9. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 1-3» met het kenmerk, dat het substraat wordt toegevoegd aan een cellensuspensie, 5 bereid door cellen af te scheiden van een cultuurvloeistof, verkregen door kweken van het mier oor ganisme in een waterig medium, gevolgd door suspenderen van de cellen in een waterig medium, en dat daarna het verkregen- mengsel aëroob wordt geïncubeerd.

10. Werkwijze volgens conclusie 9» met het kenmerk, dat een kleine 10 hoeveelheid isoboterzuur, methacrylzuur of een mengsel van isoboterzuur en methacrylzuur wordt toegevoegd aan het waterige medium wanneer het microörganisme wordt gekweekt, cm enzymen van het microörganisme te induceren.

11. Werkwijze volgens conclusie 9» met het kenmerk, dat het micro-15 organisme wordt gekweekt bij een pH van ongeveer 4,0-9»5 en een temperatuur van ongeveer 20-40°C en dat het mengsel wordt geïncubeerd bij een pH van ongeveer 6,0-9,5 en een temperatuur van ongeveer 20-40°C.

12. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 1-3» met 20 het kenmerk, dat D- (-) - S-hydr oxyi s ob ot er zuur uit het waterige-'medium wordt gewonnen door extractie met een met water niet mengbaar oplosmiddel.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het met water niet mengbare oplosmiddel butanol, methylisobutylketon of 25 ethylacetaat is. ;-o 8 0 06 0 2 6