IT8050073A1

IT8050073A1 - PROCEDIMENTO PER PRODURRE ACIDO D(-)-β-IDROSSI-ISOBUTIRRICO.

Info

Publication number: IT8050073A1
Application number: IT1980A50073A
Authority: IT
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Ind
Priority date: 1979-11-06
Filing date: 1980-11-04
Publication date: 1982-05-04
Also published as: GB2063873A; ES496563A0; IT8050073A0; US4310635A; CH647806A5; GB2063873B; DE3041224C2; IE50473B1; IE802291L; FR2468646B1; NL192833C; NL192833B; NL8006026A; FR2468646A1; ES8200400A1; IT1188962B; DE3041224A1

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "PROCEDIMENTO PER PRODURRE ACIDO D(-)-?-IDROSSI-ISOBUTIRRICO"

RIASSUNTO

Viene riferito un procedimento in cui acido D-(-)-?-?drossi -isobutirrico viene prodotto per via fermentativa da acido isobutirrico od acido me tacrilico mediante azione stereoselettiva si microorganismi aventi la capacit? d? convertire acido isobutirrico od acido metacrilico ad acido D(-)-?idrossi-isobutirrico in un ambiente acquoso e dall'ambiente acquoso viene ricavato l'acido idrossi-isobutirrico -

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per produrre acido D(-)-3-idrossi-isobutirrico (qui in seguito citato con D-FIBA), Pi? specificamente, la presente invenzione si riferisce ad un procedimento per produrre vantaggiosamente D-HIBA sfruttando la capacit? speciale di microorga nismi a produrre un composto otticamente attivo me diante sintesi asimmetrica.

D-HIBA ? uno di utili intermedi per la sintesi di sostanze fisiologicamente attive aventi atomi di carbonio asimmetrici quali medicine esemplificate da l-(D-3-mercapto-2-metilpropanoil)-L-prolina , un anti-ipertensivo .

Come metodi per la produzione di acido ?-idrossiisobutirrico (qui in seguito citato con HIBA), ? no ta una sintesi chimica da formaldeide ed etil-abromopropionato mediante la reazione di Reformatsky, per esempio (E.E. Blaise and I. Herman : Ann. Chim. et phys. 12., 371, 1969); tuttavia, HIBA ottenuto me diante questo metodo ? la forma DL(+) otticamente inattiva. Questo metodo ? pertanto svantaggioso per la produzione di HIBA otticamente attivo in quanto sono richiesti ulteriori complicati procedimenti di risoluzione chimica, in cui viene usato un reagente costoso quale chinina per ottenerlo (J.Retey e F.Lynen: Biochemische Zeitschrift, 342, 256-271, 1965)? Un metodo per ottenere D-HIBA mediante sintesi chimica senza risoluzione ottica ? riferito da M. Sprecher and D.B. Sprinson (Journal of Biological chemistry, 241, 860, 1966); tuttavia, il materiale di partenza in questo metodo, acido treo-3-met L-aspartico , ? molto costoso ed i procedimenti di sintesi sono eccessivamente complicati- D'altro canto, ? stato pre sentato un metodo per produrre un M BA otticamente attivo mediante fermentazione impiegando Pseudomonas putide (Charles T. Geodhue and James R. Schaeffer : Biotechnology and Bioengineering 13, 203, 1971); tuttavia HIBA prodotto mediante questo metodo ? la forma L(+).

Non si ? avuto finora alcun procedimento industrialmente vantaggioso per produrre D-HIBA. E' sta to notato che procedimenti microbici che utilizzano caratteristiche di catalisi stereospecifich? di microorganismi hanno spesso dimostrato di essere pi? van taggiosi per la produzione di composti otticamente attivi che la risoluzione chimica di composti racemic?. E' stato ora trovato che esistono microorganismi che hanno la capacit? di convertire acido isobutirr?co (qui in seguito citato con IBA) oppure acido metacrilico (qui in seguito citato con MA) a D-HIBA. In base a questa scoperta ? stata completata la presente invenzione ohe consiste in un procedimento fer mentativo per produrre D-HIBA da IBA , MA od un miscu glio di IBA ed MA.

Nella presente invenzione, un sostrato scelto dal gruppo formato da IBA, MA ed un miscuglio di essi, che ? facilmente accessibile ad un basso prezzo ed in grandi quantit? viene sottoposto all?azione di un microorganismo avente la capacit? di convertire il sostrato a D-HIBA. La conversione del sostrato a D-HIBA mediante catalisi del microorganismo viene effettuata in due maniere. In una maniera, il microorganismo viene coltivato aerobicamente in un ambiente nutriente acquoso contenente il sostrato per cui la propagazione del microorganismo e l?operazione di sottoporre il sostrato all' azione del microorganismo vengono effettuate simultaneamente in un solo stadio. Nell?altra maniera, il microorganismo viene dapprima coltivato in un ambiente nutriente acquoso, poi il sostrato viene aggiunto al brodo di coltura risultante oppure alla sospensione di cellule ottenute dal primo stadio e successivamente il miscuglio viene incubato aerobica mente. Microorganismi impiegati nella presente invenzione convertono il sostrato alla sola forma D(-) di HIBA in resa elevata. Pertanto, secondo la presente invenzione D-HIBA pu? venire prodotto mediante un procedimento semplice a basso costo.

I microorganismi impiegati nella presente invenzione hanno la capacit? di convertire IBA oppure MA in D-HIBA e possono venire scelti facilmente fra colture tipo o ceppi isolati dalla natura mediante i seguenti procedimenti:

IBA oppure MA viene aggiunto, in una quantit? che raggiunge una concentrazione di circa 2% peso/volume. ad un brodo di coltura ottenuto coltivando un ceppo microbico in un ambiente nutriente in cui il ceppo in prova pu? crescere. Il brodo di coltura risultante, regolato a pH 6-9, viene incubato aerobicamente a 25 fino a 35?C per 1 fino a 3 giorni. Dopo l 'incubazione un sale altamente solubile in acqua quale solfato di ammonio e solfato di sodio viene aggiunto al brodo di coltura ed il pH viene abbassato fin sotto 2 per facilitare la estrazione di D-HIBA dal brodo di coltura. Il brodo di coltura viene estratto con un solvente immiscibile con acqua quale etil-acetato. Lo strato di solvente viene evaporato ed essiccato su solfato di sodio anidro e poi la rotazione ottica dell'estratto viene misurata in una soluzione metanolica. Campioni d? estratto mostranti levorotazione vengono scelti ed applicati su una lastra con strato sottile di gel di silice. Se un campione mostra la medesima mobilit? dello HIBA, il microorganismo impiegato per preparare il campione quasi sempre ? capace di convertire IBA oppure MA a D-HIBA. Per confermare la produzione di P-HIBA il campione di estratto viene ulteriormente purificato mediante cromatograf?a in colonna su gel

d? s?lice e la struttura del preparato purificato viene determinata mediante analisi strumentale come NMB,

IR e cosi via. A causa dei risultati ottenuti in

questo esame di microorganismi producenti D-HIBA

la maggior parte del brodo di coltura di cui un estratto in solvente mostra levorotazione contiene

D-HIBA . Pertanto, questo metodo di esame ? semplice e rende molto facile scoprire microorganismi capaci di produrre D-HIBA da IBA oppure MA.

Tutti i microorganismi che producono D-HIBA

scelti mediante il precedente metodo di prova possono venire impiegati nella presente invenzione:

per esempio vengono impiegati microorganismi appartenenti ai seguenti generi: Candida, Torulopsis Trygonopsis, Saccharoayces , Pichia, Debaryomyces Wingea, Bhodosporidium , Asperg?llus, Choanephora,

e Zygorhynchus.

Fra i microorganismi appartenenti ai generi illustrati sopra vengono impiegati nella presente invenzione, ad esempio, i seguenti ceppi:

Candida rugosa IFO 0750 Candida rugosa IFO 0591, Candida parapsilosis IFO 0708, Candida utilis IFO 0396, Torulopsis candida IFO 0380, Trygonopsis variabilis

IFO 0671, Saccharomyces cerev?siae IAM 4294, Saccharomycas rouxii IFO 0493, Pichia membranaefaciens IAM 4904, Debaryomyces ha nsenii IFO 0026 , Wingea robertsii IFO 1277, Rhodospor?dium toruloides IFO 0559, Aspergillus niger ??M 2532, Choanephora circinanus HUT 1524 e Zygorhynchus moelleri HUT 1305.

Per sottoporre il sostrato all?azione del microorganismo sono disponibili due maniere . In una manie ra, il microorganismo viene coltivato aerobicamente in un ambiente acquoso contenente il sostrato dallo inizio della coltivazione, per cui D-HIBA si accumula nell'ambiente simultaneamente alla propagazione del microorganismo. Bell' altra maniera, il procedimento consiste in due stadi, cio? coltivare il microorganismo e sottoporre il sostrato all'azione del microorganismo . Il primo stadio del procedimento a due stadi pu? venire effettuato coltivando il microorganismo in un ambienta nutriente acquoso. Il secondo stadio del procedimento a due stadi pu? venire effettuato aggiungendo il sostrato ad un brodo di coltura ottenuto nel primo stadio oppure ad una sospensione di cellule ottenute nel primo stadio con successiva incubazione del miscuglio risultante in maniera aerobica. La sospensione di cellule viene preparata separando cellule da un brodo d? coltura del microorgani amo mediante centrifugazione e cosi via seguita da sospensione delle cellule in un ambiente acquoso appropriato quale una soluzione tampone al fosfato acquosa. Poich? enzimi di microorganismi sono implicati nella reazione del procedimento della presente in venzione, le cellule separate possono anche venire sottoposte a vari trattamenti quali essiccamento ed omogenei zzazione ecc. prima della sospensione nel l'ambiente per promuovere la reazione enzimatica.

Pertanto, l'impiego di cellule trattate in varie maniere deve venire considerato compreso nel campo della presente invenzione.

Per la coltura del microorganismo pu? venire usato qualsiasi ambiente in cui il microorganismo impiegato sia in grado di crescere. L'ambiente con tiene usualmente una sorgente dicarbonio, una sorgeri te di azoto e, se necessario, una sorgente minerale, e cosi via. Esempi di sorgenti d? carbonio nell' am biente comprendono carboidrati quali glucosio, sacca rosio, amido, idrolisati e melasse; acidi organici quali acido acetico, acido fumarico ed acido lattico; alcoli quali metanolo, etanolo e propanolo; ed inoltre idrocarburi liquidi quali n-paraffine ed olefine, olii e grassi, glicerolo e cos? via che possono venire assimilati dai microorganismi impiegati. Come sorgente di azoto nell'ambiente vengono impiegati campo sti inorganici od organici quali solfato di ammonio, cloruro di ammonio, fosfato di ammonio , acqua ammonia cale, urea, amminoacidi, peptone ed idrolisati di pr? te?na di semi di sola. Come componenti minerali nell'ambiente possono venire impiegati sali di acidi inorgani ci di potassio, magnesio zinco, ferro, manganese, rame o calcio. Se necessario, pu? venire aggiunto all'ambiente estratto di lievito, estratto di carne, coro steep liquor, vitamine oppure sostanze af fini ad acidi nucleici quali adenina e guanina.

Per quanto riguarda condizioni di coltura non esiste alcuna differenza particolare fra ? preceden ti due metodi. La coltura del microorganismo pu? ve nire effettuata in qualsiasi condizione che permetta la crescita del microorganismo ma preferibilmente ad un pH da circa 4,0 e circa 9,5 e ad una temperatura da circa 20? C a circa 40?C. Nel precedente pr?, cedimento a due stadi ? efficace , per promuovere la reazione nel secondo stadio, introdurre quegli enzimi del microorgani smo che catalizzano la conversione del sostrato a D-HIBA, mediante aggiunta di una piccola quantit? del sostrato all ?ambiente nel primo stadio, la incubazione del secondo stadio nel precedente procedimento a due stadi pu? venire eseguita, di preferenza, ad un pH da circa 6,0 a circa 9,5 ed una temperatura da circa 20?C a circa 40?C.

Per l'isolamento di D-HIBA dal brodo di coltura o miscuglio di reazione , possono venire impiegati me todi usuali per la estrazione e purificazione di un acido organico quali estrazione con solvente e scambio di ioni. Un esempio di un efficace metodo di ricavo mediante estrazione con solvente ? mostrato appresso: il brodo di coltura o miscuglio di reazione viene acidificato con un acido minerale come gli aci d? solforico e cloridrico, ad esso viene aggiunto un sale inorganico come solfato di ammonio e solfato di sodio, se necessario , per aumentare la forza ionica del brodo o miscuglio e poi viene estratto con un solvente immiscibile con acqua quale butanolo, metilisobut?lchetone ed etilacetato. Si ottiene D-HIBA grezzo mediante evaporazione dello strato di solvente fino a secco. Il preparato di D-HIBA cos? ottenuto pu? venire ulteriormente purificato mediante croma

tografia in colonna impiegando gel di silice, ecc.

per dare D-HIBA di elevata purezza.

Illustrano in maggior dettaglio la presente in venzione gli esempi che seguono.

Esempio 1

Candida rugosa IFO 0750, Candida rugosa IFO 0591, Candida parapsilosis IFO 0708, Candida utilis IFO 0396, Torulopsis candida IFO 0380, Trygonopsis variabilis IFO 0671, Saccharomyces cerevisiae IAM 4274, Saccharorayces rouxii IFO 0493, Pichia membranaefaciens IAM 4904, Debaryomyces hansenii IFO 0026, Wingea robertsii IFO 1277, Rhodosporidium toruloides IFO 0559, Aspergillus niger IAM 2532, Choanephora circinanus HUT 1324, and Zygorhynchus moelleri HUT 1305 vengono inoculati ciascuno in un ambiente comprendente 40 g di glucosio, 5 g di estratto di lievito,

3 g di peptone, 1 g di estratto di carne e 20 g di

IBA oppure 20 g di MA o 20 g di un miscuglio costi

tuito da quantit? uguali (in peso) di IBA ed MA. I microorganismi vengono coltivati ciascuno in un fer mentatore a vaso da 3 litri a 30?C , pH 7,5, agitamento a 500 giri per minuto, ed aerazione 1 vol./vol.min. per 24 ore. Poi il pH viene innalzato ad 8,5 e la

coltura viene continuata per altre 48 ore. Il bro

do di coltura cos? ottenuto viene acidificato con acido solforico fino a dare pH 2,0, saturato con solfato di ammonio ed estratto con etilacetato in una quantit? uguale in volume a quella del brodo di coltura. L'estratto, essiccato su solfato di so dio anidro, viene concentrato sotto pressione ridot ta. La sostanza oleosa concentrata, sciolta in una piccola quantit? di benzolo, viene applicata ad una colonna riempita di gel di silice. La eluizione vie ne effettuata dapprima con benzolo-acetone (9 : 1. in volume) per separare IBA oppure MA invariato, e poi con benzolo-acetone (3 : 1 in volume) per elu?re D-HIBA. Frazioni contenenti D-HIBA vengono unite e concentrate sotto pressione ridotta per dare un liquido viscoso. Il liquido cos? ottenuto viene idea tificato come ?I?? mediante gascromatografia, TLC su gel di silice (cromatografica in strato sottile) , spettro NMS, ecc. La rotazione ottica di ciascun pr? dotto viene misurata e d? il risultato di

13-18? (C-3 , metanolo) , che mostra che MBA cos? pr? dotto da ciascun microorganismo ? la forma D(-). Le rese di D-HIBA preparate mediante il metodo sopra descritto sono mostrate nella tabella 1.

TABELLA 1

Esempio 2

I medesimi ceppi usati nell'esempio 1 vengono inoculati ciascuno in un litro di un ambiente costi

tuito da 20 g di glucosio, 5 g di estratto di lievi

to, 1 g di IBA oppure 1 g di MA , oppure 1 g di un miscuglio costituito da quantit? uguali (in peso)

di IBA ed M?. I microorganismi vengono coltivati ciascuno in un fermentatore a vaso da 3 litri a 30?C, pH 6,0, agitamento 500 giri per minuto ed aera zione 1 vol./vol.per minuto per 20 ore. Poi al brodo di coltura risultante vengono aggiunti 30 g di IBA, MA oppure 30 g di un miscuglio costituito da quanti t? uguali (in peso) di IBA ed MA. Il brodo di coltu ra, regolato a pH 8,5, ? stato incubato per 72 ore. Dopo l?incubazione, il miscuglio di reazione viene trattato nella medesima maniera descritta nell'esempio 1 per dare D-HXBA. Il campo della rotazione ottica di D-BIBA cos? ottenuto ? il medesimo che nell 'esempio 1. Le rese di D-HXBA sono mostrate nella tabella 2.

TABELLA 2

Esempio 3

I medesimi ceppi usati nell'esempio 1 vengono inoculati ciascuno in 1 litro di un ambiente compren

dente 20 g di glucosio, 5 g di estratto di lievito,

3 g di peptone, 3 g di estratto di carne; 1 g di IBA oppure 1 g di MA oppure 1 g di un miscuglio costitu?

to da quantit? uguali (in peso) di IBA ed MA. I microorganismi vengono coltivati ciascuno in un fermentatore a vaso da 3 litri a 30?C , pH 6,0, agitamento 500 giri per minuti ed aerazione 1 vol. /vol. per minuto per 24 ore. Le cellule vengono raccolte mediante centrifugazione dal brodo di coltura cos? ottenuto , lavate per due volte con una soluzione salina a 0,9% e sospese in un tampone al fosfato 1/15 molare (pH 8,5). Alla sospensione di cellule vengono aggiunti 30 g di IBA, MA oppure 30 g di un miscuglio di IBA ed MA (IBA : MA - 1 : 1 in peso) e 30 g di glucosio. Il miscuglio risultante viene incubato a pH 8 ,5 per 48 ore. Dopo l 'incubazione, il miscuglio di reazione viene trattato nella mede sima maniera descritta nell'esempio 1 per dare

D-HIBA. Il campo di rotazione ottica di D-HIBA cos? ottenuto ? lo stesso che nell'esempio 1. Le rese d? D-HIBA sono mostrate nella tabella 3

Claims

RIVENDICAZIONI

1. Procedimento per produrre acido D(-)-?idrossi-isobutirrico comprendente le operazioni di sottoporre un sostrato scelto dal gruppo formato da acido isobutirrico, acido metacrilico ed un miscu glio di acido isobutirrico ed acido metacrilico alla azione di un microorganismo avente la capacit? di con vertire il sostrato ad acido D(-)-?-idrossiisobutirrico in un ambiente acquoso e ricavare acido D(-)-?-idrossiisobutirrico dall ' ambiente.

2. Procedimento della riv.l , in cui il microorga nismo appartiene ad un genere scelto dal gruppo forma to dai generi ;

Candida, Torulopsis, Trygonopsis , Saccharomyces, Debaryomyces , Wingea, Rhodosporidium, Aspergillus, Pichia Choanephora, e Zygorhynchus .

3. Procedimento della riv. l , . in cui il microorga nismo appartiene ad una specie scelta dal gruppo formato da Candida rugosa, Candida parapsilosis , Candida utilis , Torulopsis candida, Trygonopsis variabilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces rouxii, Pichia membranaef aciens , Debaryomyces hansenii , Wingea robertsii, Rhodosporidium toruloides , Aspergillus niger, Choanephora circinanus , e Zygorhynchus moelleri .

4. Procedimento della riv.l , 2 oppure 3 , in cui il microorganismo viene coltivato aerobicamente in

un ambiente acquoso contenente il sostrato.

5. Procedimento della riv.4 , in cui la coltura viene effettuata ad un pH fra circa 4 e circa 9 ,5

ed una temperatura, da circa 20?C a circa 40?C.

6. Procedimento della riv.1 , 2 oppure 3 , in cui il sostrato viene aggiunto ad un brodo di coltura ottenuto coltivando il microorganismo in un ambien te acquoso e poi il miscuglio risultante viene incu bato aerobicamente.

7- Procedimento della riv.6, in cui una piccola quantit? di acido isobutirrico acido metacrilico od un miscuglio di acido isobutirrico ed acido metacri lico viene aggiunto all'ambiente acquoso quando il microorganismo venga coltivato per produrre enzimi del microorganismo.

8. Procedimento della riv.6, in cui il microorgani smo viene coltivato ad un pH da circa 4,0 a circa 9,5 ed una temperatura da circa 20?C a circa 40?C ed il miscuglio viene incubato ad un pH da circa 6,0 a circa 9,5 ed una temperatura da circa 20 a circa 40?C.

9- Procedimento della riv.l, 2 oppure 3, in cui il sostrato viene aggiunto ad una sospensione di cel lule preparata separando cellule da un brodo di coltura ottenuto mediante coltura del microorganismo in un ambiente acquoso seguita da sospensione delle cel. lule in un ambiente acquoso dopo di che il miscuglio risultante viene incubato aerobicamente.

10. Procedimento della riv.9, in cui una piccola quantit? di acido isobut?rrico, acido metacrilico od un miscuglio di acido isobutirrico ed acido me tacrilico viene aggiunta all'ambiente acquoso quando il microorganismo venga coltiva per produrre enzimi del microorganismo.

11. Procedimento della riv.9, in cui il microorganismo viene coltivato ad un pH da circa 4,0 a cir ca 9,5 ed una temperatura da circa 20?C a circa 40?G ed il miscuglio viene incubato ad un pH da circa 6,0 a circa 9,5 ed una temperatura da circa 20 a circa 40?C.

12. Procedimento della riv.l, 2 oppure 3, in cui acido D(-)-3?idrossi-isobutirrico viene ricavato dall'ambiente acquoso mediante estrazione con un solvente immiscibile con acqua.

13. Procedimento della riv.12, in cui il solvente immiscibile con acqua ? butanolo, metilisobutilchetone oppure etil-acetato.