NL192833C

NL192833C - Werkwijze voor het bereiden van een beta-hydroxyisoboterzuur.

Info

Publication number: NL192833C
Application number: NL8006026A
Authority: NL
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Ind
Priority date: 1979-11-06
Filing date: 1980-11-04
Publication date: 1998-03-04
Also published as: NL8006026A; IE50473B1; IE802291L; DE3041224A1; ES8200400A1; IT1188962B; GB2063873B; IT8050073A1; CH647806A5; FR2468646A1; DE3041224C2; NL192833B; IT8050073A0; FR2468646B1; ES496563A0; US4310635A; GB2063873A

Description

1 192833

Werkwijze voor het bereiden van een β-hydroxiisoboteizuur

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een β-hydroxiisoboterzuur, waarbij men een substraat, bestaande uit isoboterzuur, methacrylzuur of een mengsel van isoboterzuur en 5 methacrylzuur in een waterig medium, onderwerpt aan de inwerking van een micro-organisme dat in staat is om deze verbindingen om te zetten in β-hydroxiisoboterzuur en men het β-hydroxiisoboterzuur uit het medium wint.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit de Franse octrooiaanvrage 2.008.078, die betrekking heeft op het omzetten van isoboterzuur in een β-hydroxiisoboterzuur met behulp van één van de volgende micro-10 organismen:

Pseudomonas putida. Pseudomonas fluorescens, Arthrobacter crystallopietes, Mycobacterium species en Arthrobacter oxidans.

Hierbij wordt de L(+)vorm van β-hydroxiisoboterzuur verkregen.

Verder is het blijkens Chemical Abstracts 91,120049y (1979) bekend dat Pseudomonas putida ook in 15 staat is om methacrylzuur om te zetten in de L(+)vorm van β-hydroxiisoboterzuur.

Het doel van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een werkwijze voor de bereiding van D(-)^-hydroxiisoboterzuur (verder D-HIBA genoemd), met gebruik van micro-organismen. De uitvinding wordt derhalve gekenmerkt, doordat men een micro-organisme toepast dat genoemde verbindingen omzet in β-hydroxiisoboterzuur in de D(-)-vorm en het D^-hydroxiisoboterzuur uit het medium wint.

20 D-HIBA is een bruikbaar tussenproduct voor het bereiden van fysiologisch actieve materialen met asymmetrische koolstofatomen, waarvan het antipypertensieve medicijn N-(D-(3-mercapto-2-methyl-propanoyl)]-L-proline een voorbeeld is.

Als werkwijzen voor de bereiding van β-hydroxiisoboterzuur (verder aangeduid als HIBA), is bijvoorbeeld de chemische synthese uit formaldehyde en ethyl-a-broompropionaat door de Reformatsky-reactie bekend 25 (E.E. Blaise en I. Herman: Ann. Chim. et Phys. 17, 371, (1909); het volgens deze werkwijze verkregen HIBA is echter het optisch inactieve racemische mengsel. Om hieruit D-HIBA te isoleren zijn gecompliceerde chemische scheidingswerkwijzen nodig waarbij een duur reagens, zoals kinine gebruikt wordt. Deze werkwijze is daardoor commercieel niet aantrekkelijk (J. Retey en F. Lynen: Biochemische Zeitschrift, 342, 256-271, (1965). Een werkwijze voor het verkrijgen van D-HIBA door chemische synthese zonder optische 30 scheiding is beschreven door M. Sprecher en D.B. Prinson [Journal of Biological Chemistry, 241. 868-871, (1966)]; het uitgangsmateriaal bij deze werkwijze, threo-3-methyl-L-asparaginezuur, is echter zeer duur en de synthetische procedures zijn buitengewoon gecompliceerd.

Er bestaat derhalve geen industrieel voordelige werkwijze voor de bereiding van D-HIBA. De uitvinders hebben opgemerkt, dat microbiologische werkwijzen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de stereospecifieke 35 werking van enzymen van micro-organismen, vaak veel voordeliger zijn gebleken voor de bereiding van optisch actieve verbindingen dan de chemische scheiding van racemische verbindingen. De uitvinders hebben nu gevonden, dat er micro-organismen bestaan die in staat zijn om isoboterzuur (verder aangeduid als IBA) of methacrylzuur (verder aangeduid als MA) om te zetten in D-HIBA. Gebaseerd op deze vondst betreft de uitvinding een fermentatieve methode voor de bereiding van D-HIBA uit IBA, MA of een mengsel 40 van IBA en MA.

Opgemerkt wordt dat IBA, MA of een mengsel daarvan gemakkelijk tegen lage kosten en in grote hoeveelheden kan worden verkregen. Micro-organismen die volgens de uitvinding worden gebruikt, zetten het substraat in alleen de D-(-)-vorm van HIBA om in hoge opbrengst, waardoor D-HIBA op eenvoudige wijze tegen geringe kosten wordt bereid.

45 Volgens de uitvinding toegepaste micro-organismen kunnen gemakkelijk uit in cultuurverzamelingen aanwezige stammen of uit de natuur geïsoleerde stammen op de volgende manier worden geselecteerd.

IBA of MA in een hoeveelheid waarmede een concentratie van ongeveer 2% w/v wordt bereikt, toegevoegd aan een cultuurvloeistof waarin de te onderzoeken micro-organisme-stam is gekweekt. Daarna wordt de cultuurvloeistof, ingestleld op een pH 6-9, gedurende 1-3 dagen bij 25-35°C onder beluchting 50 geïncubeerd. Na deze incubatie wordt een zeer goed in water oplosbaar zout, zoals ammoniumsulfaat of natriumsulfaat, aan de cultuurvloeistof toegevoegd en de pH tot beneden 2 verlaagd om extractie van D-HIBA uit de cultuurvloeistof te vergemakkelijken. De cultuurvloeistof wordt vervolgens met een niet met water mengbaar oplosmiddel, zoals ethylacetaat, geëxtraheerd. Het extract wordt gedroogd boven watervrij natriumsulfaat en het oplosmiddel door afdampen verwijderd. Vervolgens wordt de optische rotatie van een 55 oplossing van het extract in methanol gemeten. Extractmonsters die linksdraaiing (levorotatie) vertonen worden geselecteerd en op een silicageldunneiaagplaat aangebracht. Wanneer bij dunne-laag-chromatografie een monster dezelfde mobiliteit als HIBA vertoont, heeft het voor de bereiding van het 1SZ833 2 monster toegepaste micro-organisme vrijwel steeds het vermogen om IBA of MA in D-HIBA om te zetten.

Om de aanwezigheid van D-HIBA in het extract te bevestigen, wordt de in het extractmonster aanwezige verbinding verder door kolomchromatografie over silicagel gezuiverd en wordt de structuur van deze gezuiverde verbinding door instrumentele analyse, zoals NMR, IR enz. vastgesteld. Gezien de resultaten die 5 bij deze selectering van D-HIBA producerende micro-organismen zijn verkregen, bevatten de meeste cultuurvloeistoffen waarvan een oplosmiddelextract levorotatie vertoont, D-HIBA. Deze selectieprocedure is derhalve eenvoudig en maakt het zeer gemakkelijk om bij micro-organismen vast te stellen of zij in staat zijn om D-HIBA te produceren uit IBA of MA.

De D-HIBA producerende micro-organismen, die door de bovenstaande selectieprocedure waren 10 geselecteerd, en volgens de uitvinding kunnen worden toegepast, bleken tot de volgende genera te behoren: Candida, Torulopsis, Trigonopsis, Saccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Wingea, Rhodospori-dium, Aspergillus, Choanephora en Zygorhynchus.

Van de tot de bovenstaand vermelde genera behorende micro-organismen worden bijvoorbeeld de volgende stammen volgens de uitvinding toegepast: 15 Candida rugosa IFO 0750, Candida rugosa IFO 0591, Candida parapsilosis IFO 0708, Candida utilis IFO 0396, Torulopsis Candida IFO 0380, Trigonopsis variabilis IFO 0671, Saccharomyces cerevisiae IAM 4274, Saccharomyces rouxii IFO 0493, Pichia membranaefaciens IAM 4904, Debaryomyces hansenii IFO 0026, Wingea robertsii IFO 1277, Rhodosporidium toruloides IFO 0559, Aspergillus niger IAM 2532, Choanephora circinanus HUT 1324 en Zygorhynchus moelleri HUT 1305.

20 Deze stammen zijn onder de vermeide nummers voor het publiek verkrijgbaar bij de volgende instituten. IFO: Institute for Fermentation, Osaka; Juso Nishinomachi, Higashi-yodogawa-ku, Osaka, Japan.

IAM: Institute of Applied Microbiology, Universiteit van Tokyo; 1-chome, Yayoi, Kunkyo-ku, Tokyo, Japan.

HUT: Faculty of Engineering, Hiroshima Universiteit, 3-chome, Senda-machi, Hiroshima City, Japan.

25 Het substraat kan op twee manieren aan de werking van het micro-organisme worden onderworpen.

Volgens de ene manier wordt het micro-organisme aëroob gekweekt in een waterig medium, dat substraat vanaf het begin van de kweekprocedure bevat, waardoor D-HIBA zich in het medium ophoopt terwijl tegelijkertijd het micro-organisme zich vermenigvuldigt. Volgens de andere manier bestaat de werkwijze uit twee trappen, d.w.z. het kweken van het micro-organisme en het onderwerpen van het substraat aan de 30 werking van het gekweekte micro-organisme. De tweede trap van deze tweetrapswerkwijze kan worden uitgevoerd door het substraat toe te voegen aan een in de eerste trap verkregen cultuurvloeistof of cellensuspensie, waarna het verkregen mengsel onder beluchting wordt geïncubeerd. De ceilensuspensie wordt bereid door cellen van het micro-organisme uit de cultuurvloeistof af te scheiden bijvoorbeeld door centrifugeren, waarna de cellen in een geschikt waterig medium, zoals een waterige fosfaatbufferoplossing, 35 worden gesuspendeerd. Omdat enzymen van de micro-organismen verantwoordelijk zijn voor de reactie van de werkwijze, kunnen de afgescheiden cellen ook aan verschillende behandelingen die de enzymen niet desactiveren, zoals drogen en homogenisatie enz. worden onderworpen, voordat ze in het medium worden gesuspendeerd teneinde de enzymreactie te bevorderen. Derhalve valt het gebruik van cellen die met behoud van de enzymactiviteit op verschillende wijzen zijn behandeld, eveneens onder de beschermingsom-40 vang.

Voor het kweken van het micro-organisme kan elk medium, waarin het gebruikte micro-organisme kan groeien, worden toegepast. Het medium bevat gewoonlijk een koolstofbron, een stikstofbron, en indien nodig een bron voor mineralen. Voorbeelden van koolstofbronnen in het medium zijn koolhydraten, zoals glucose, saccharose, zetmeel, hydrolysaten en melasses; organische zuren zoals azijnzuur, fumaarzuur en 45 melkzuur; alcoholen zoals methanol, ethanol en propanol; en verder vloeibare koolwaterstoffen zoals n-paraffinen en alkenen; oliën en vetten en glycerol, die door het gebruikte micro-organisme kunnen worden geassimileerd. Als stikstofbron in het medium kunnen anorganische of organische verbindingen, zoals ammoniumsulfaat, ammoniumchloride, ammoniumfosfaat, ammonia, ureum, aminozuren, pepton, en hydrolysaten van sojaboneneiwit worden toegepast. Als mineralen in het medium kunnen anorganische zure 50 zouten van kalium, magnesium, zink, ijzer, mangaan, koper of calcium worden gebruikt. Indien nodig kan gistextract, vleesextract, maïsweekwater, vitaminen, of bestanddelen van nucleïnezuur, zoals adenine en guanine aan het medium worden toegevoegd.

Wat de kweekomstandigheden betreft, bestaat er geen bijzonder verschil tussen de bovenstaande twee methoden. Het kweken van het micro-organisme kan worden uitgevoerd onder alle omstandigheden die 55 toelaten dat het micro-organisme groeit, maar bij voorkeur wordt een pH van 4,0 tot 9,5 en een temperatuur van 20 tot 40°C gebruikt. Bij de tweetrapswerkwijze wordt de reactie in de tweede trap bevorderd door de enzymen van het micro-organisme, die de omzetting van het substraat in D-HIBA katalyseren, te induceren 3 192833 door een kleine hoeveelheid van het substraat aan het medium in de eerste trap toe te voegen. De tweede trap in de tweetrapswerkwijze wordt bij voorkeur uitgevoerd bij een pH van ongeveer 6,0 tot ongeveer 9,5 en een temperatuur van ongeveer 20 tot ongeveer 40°C.

Voor het isoleren van D-HIBA uit de cultuurvloeistof of het reactiemengsel kunnen gebruikelijke 5 werkwijzen worden toegepast. Hieronder volgt een voorbeeld van een efficiënte winningsmethode door oplosmiddelextractie. De cultuurvloeistof of het reactiemengsel wordt aangezuurd met een anorganisch zuur, zoals zwavelzuur of zoutzuur, een anorganisch zout, zoals ammonïumsulfaat en/of natriumsulfaat, wordt daaraan indien nodig toegevoegd om de ionensterkte van de vloeistof of het mengsel te verhogen, en vervolgens wordt met een met water niet mengbaar oplosmiddel, zoals butanol, methylisobutylketon en 10 ethylacetaat geëxtraheerd. Ruw D-HIBA wordt door droogdampen van de oplosmiddellaag verkregen. Het aldus verkregen D-HIBA-preparaat kan verder worden gezuiverd door kolomchromatografie onder toepassing van silicagel enz., waarbij D-HIBA van hoge zuiverheid wordt verkregen.

De uitvinding wordt aan de hand van de voorbeelden nader toegelicht.

15 Voorbeeld I

Candida rugosa IFO 0750, Candida rugosa IFO 0591, Candida parapsilosis IFO 0708, Candida utilis IFO 0396, Torulopsis Candida IFO 0380, Trigonopsis variabilis IFO 0671, Saccharomyces cerevisiae IAM 4274, Saccharomyces rouxii IFO 0493, Pichia membranaefaciens IAM 4904, Debarvomyces hansenii IFO 0026, Wingea roberts» IFO 1277, Rhodosporidium toruloides IFO 0559, Aspergillus niger IAM 2532, Choanephora 20 circinanus HUT 1324 en Zygorhynchus moelleri HUT 1305 werden elk geënt in 1 liter van een medium dat 40 g glucose, 50 g gistextract, 3 g pepton, 1 g vleesextract; en 20 g IBA of 20 g MA of 20 g van een mengsel van gelijke gewichtshoeveelheden IBA en MA bevatte. De micro-organismen werden elk in een fermentatievat van 3 liter bij 30°C, een pH van 7,5, onder roeren met 500 omw/min, en een beluchting met 1 v/vm gedurende 24 uur gekweekt. Daarna werd de pH tot 8,5 verhoogd en het kweken gedurende nog 25 eens 48 uren voortgezet. De aldus verkregen cultuurvloeistof werd met zwavelzuur aangezuurd tot een pH van 2,0, met ammoniumsulfaat verzadigd en met ethylacetaat in een gelijke volumehoeveelheid als de cultuurvloeistof geëxtraheerd. Het extract werd met watervrij natriumsulfaat gedroogd en onder verminderde druk ingedampt. Het geconcentreerde olieachtige materiaal werd opgelost in een kleine hoeveelheid benzeen en op een kolom gebracht die gevuld was met silicagel. De elutie werd eerst met benzeen-aceton 30 (volumeverhouding 9:1) voor het verwijderen van ongewijzigd IBA of MA, en vervolgens met benzeen- aceton (volumeverhouding 3:1) voor het elueren van D-HIBA uitgevoerd. D-HIBA bevattende fracties werden samengevoegd en onder verminderde druk ingedampt, waarbij een viskeuze vloeistof werd verkregen. De aldus verkregen vloeistof bleek HIBA te zijn, zoals werd aangetoond door gaschromatografie, silicageldun-nelaagchromatografie en NMR-spectra. De optische rotatie van elk van de verkregen producten werd 35 gemeten, waarbij als resultaat steeds werd gevonden [a]2z5-13—18° (C=3, methanol), hetwelk aantoont dat het door elk micro-organisme geproduceerde HIBA de D(-)-vorm bezat. De opbrengsten aan D-HIBA, verkregen door de hierboven beschreven werkwijze, staan in tabel A.

TABEL A

40 -

Opbrengst aan D-HIBA (g)

Micro-organisme/Substraat IBA MA IBA+MA

45 Candida rugosa IFO 0750 8,2 7,9 7,8

Candida rugosa IFO 0591 6,5 7,8 8,4

Candida parapsilosis IFO 0708 5,5 6,2 5,5

Candida utilis IFO 0396 5,4 8,8 5,3

Torulopsis Candida IFO 0380 2,1 1,1 3,6 50 Trigonopsis variabilis IFO 0671 5,8 2,5 2,9

Saccharomyces cerevisiae IAM 4274 3,2 1,7 3,3

Saccharomyces rouxii IFO 0493 4,6 2,0 4,0

Pichia membranaefaciens IAM 4904 7,0 1,3 1,9

Debarvomyces hansenii IFO 0026 9,2 4,3 7,0 55 Wingea robertsii IFO 1277 1,9 0,8 1,1

Rhodosporidium toruloides IFO 0559 2,5 4,0 2,2 I MOM 4 TABEL A (vervolg)

Opbrengst aan D-HIBA (g)

5 Micro-organisme/Substraat IBA MA IBA+MA

Aspergillus niger IAM 2532 2,3 2,3 3,5

Choanephora circinanus HUT 1324 1,8 1,5 0,6

Zygorhynchus moelleri HUT 1305 1,3 1,1 1,5 10 -

Voorbeeld II

Dezelfde stammen als in voorbeeld I werden gebruikt, werden elk geënt in 1 liter van een medium, dat 20 g glucose, 5 g gistextract; 1 g IBA of 1 g MA, of 1 g van een mengsel van gelijke gewichtshoeveelheden IBA 15 en MA bevatte. De micro-organismen werden elk gekweekt in een fermentatievat van 3 liter bij 30°C, pH

6,0, onder roeren met 500 omwentelingen per minuut en een beluchting met 1 v/m gedurende 20 uur. Daarna werd 30 g IBA, 30 g MA of 30 g van een mengsel van gelijke gewichtshoeveelheden IBA en MA aan de verkregen cultuurvloeistof toegevoegd. De op een pH van 8,5 ingestelde cultuurvloeistof werd gedurende 72 uren bij 30°C geïncubeerd. Na de incubatie werd uit het reactiemengsel op dezelfde wijze als in 20 voorbeeld I is beschreven D-HIBA gewonnen. Het aldus verkregen D-HIBA vertoonde dezelfde optische rotatiewaarde als in voorbeeld I. De opbrengsten aan D-HIBA staan in tabel B.

TABEL B

25 Opbrengst aan D-HIBA (g)

Micro-organisme/Substraat IBA MA IBA+MA

Candida rugosa IFO 0750 8,3 10,2 7,8 30 Candida rugosa IFO 0591 6,1 9,4 8,5

Candida parapsilosis IFO 0708 7,7 10,5 9,7

Candida utilis IFO 0396 5,7 6,1 4,7

Torulopsis Candida IFO 0380 1,9 1,6 3,3

Trigonopsis variabilis IFO 0671 5,0 4,3 3,6 35 Saccharomyces cerevisiae IAM 4274 3,2 1,5 3,8

Saccharomyces rouxii IFO 0493 4,4 1,8 2,0

Pichia membranaefaciens IAM 4904 4,5 1,7 1,8

Debaryomyces hansenii IFO 0026 8,5 5,9 8,6

Wingea roberts» IFO 1277 2,2 0,6 3,1 40 Rhodosporidium toruloides IFO 0559 2,4 0,8 2,5

Aspergillus niger IAM 2532 2,3 1,0 1,2

Choanephora circinanus HUT 1324 0,9 0,7 0,5

Zygorhynchus moelleri HUT 1305 1,8 0,9 2,2 45

Voorbeeld III

Dezelfde stammen als in voorbeeld I werden gebruikt, werden elk geënt in 1 liter van een medium, dat 20 g glucose, 5 g gistextract, 3 g pepton, 3 g vleesextract; 1 g IBA of 1 g MA of 1 g van een mengsel van gelijke gewichtshoeveelheden IBA en MA bevatte. De micro-organismen werden elk gekweekt in een fermentatie-50 vat van 3 liter bij 30°C, pH 6,0, onder roeren met 500 omw/min en een beluchting met 1 v/vm gedurende 24 uur. De cellen werden door centrifugeren uit de aldus verkregen cultuurvloeistof afgescheiden, tweemaal met een 0,9%-ige pekeloplossing gewassen, en gesuspendeerd in 1/15 M fosfaatbuffer (pH 8,5). Aan de cellensuspensie werd 30 g IBA, 30 g MA of 30 g van een mengsel van IBA en MA (in een 1:1 gewichtsverhouding) alsmede 30 g glucose toegevoegd. Het verkregen mengsel werd gedurende 48 uur bij 30°C en 55 een pH van 8,5 geïncubeerd. Na de incubatie werd uit het reactiemengsel op dezelfde wijze als beschreven in voorbeeld I, D-HIBA gewonnen. Het aldus verkregen D-HIBA vertoonde dezelfde optische rotatiewaarde als in voorbeeld I. De opbrengsten aan D-HIBA staan in tabel C.

Claims

5 192633 TABEL C Opbrengst aan D-HIBA (g) 5 Micro-organisme/Substraat IBA MA IBA+MA Candida rugosa IFO 0750 9,4 9,2 8,8 Candida rugosa IFO 0591 8,3 7,7 9,5 Candida parapsilosis IFO 0708 11,0 9,9 9,3 10 Candida utilis IFO 0396 6,2 5,9 4,4 Torulopsis Candida IFO 0380 2,1 1,5 2,0 Trigonopsis variabilis IFO 0671 4,4 5,0 4,6 Saccharomyces cerevisiae IAM 4274 2,5 2,1 1,8 Saccharomyces rouxii IFO 0493 3,6 3,3 4,2 15 Pichia membranaefaciens IAM 4904 7,4 8,5 8,8 Debarvomyces hansenii IFO 0026 6,2 4,7 5,1 Wingea robertsii IF01277 1,5 1,6 1,3 Rhodosporidium toruloides IFO 0559 2,0 1,5 1,7 Aspergillus niger IAM 2532 0,7 1,2 1,4 20 Choanephora circinanus HUT 1324 1,1 1,8 2,2 Zygorhynchus moelleri HUT 1305 1,6 2,2 1,6 25

1. Werkwijze voor het bereiden van een β-hydroxiisoboterzuur, waarbij men een substraat, bestaande uit isoboterzuur, methacrylzuur of een mengsel van isoboterzuur en methacrylzuur in een waterig medium, onderwerpt aan de inwerking van een micro-organisme dat in staat is om deze verbindingen om te zetten in β-hydroxiisoboterzuur en men het β-hydroxiisoboterzuur uit het medium wint, met het kenmerk, dat men een 30 micro-organisme toepast dat genoemde verbindingen omzet in β-hydroxiisoboterzuur in de D(-)-vorm en het D-p-hydroxiisoboterzuur uit het medium wint.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het micro-organisme onder beluchting gekweekt wordt in een waterig medium dat het substraat bevat.

3. Werkwijze volgens één van de conclusies 1-2, met het kenmerk, dat het substraat wordt toegevoegd aan 35 een cultuurvloeistof, verkregen door kweken van het micro-organisme in een waterig medium, of aan een cellensuspensie, bereid door cellen af te scheiden uit de genoemde cultuurvloeistof en in een waterig medium te suspenderen en dat het verkregen mengsel vervolgens onder beluchting geïncubeerd wordt.