DE69019396T2 - Verfahren zur fermentativen Oxydation reduzierender Disaccharide. - Google Patents
Verfahren zur fermentativen Oxydation reduzierender Disaccharide.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft die fermentative Oxidation von reduzierenden Disacchariden wie Maltose und Lactose unter Verwendung des Mikroorganismus Pseudomonas cepacia. Durch Oxidation dieser Disaccharide können Aldobionsäuren, wie Maltobionsäure oder Lactobionsäure oder deren Salze, hergestellt werden.
- Das US-Patent 3,899,604 offenbart die Verwendung von Maltobionsäure als Nahrungsmittelsäure. Maltobionsäure hat einen mittelsauren Geschmack und trägt auch zur Viskosität von Lebensmittelprodukten, in denen es enthalten ist, bei. Ferner erhöht Maltobionsäure den natürlichen Geruch und Geschmack einiger Lebensmittelprodukte (Geschmacksverbesserer), wie in dem US-Patent 3,829,583 beschrieben ist.
- Chemical Abstracts, Vol. 42, Nr. 6, 1948, Spalte 1938h-1984h berichtet von der Oxidation von Lactose und Maltose von zu Bionsäuren durch Pseudomonas-Mikroorganisinen. In beiden Fällen führt Pseudomonas graveolens die Oxidation bei höchster Geschwindigkeit durch.
- Chemical Abstracts, Vol. 74, Nr. 25, 1971, Abstract Nr. 142296c beschreibt die Oxidation von nicht isomerisierter Lactose mit Lactosedehydrogenase zu Lactobionsäure. Pseudomonas graveolens wird zur Bereitstellung der Dehydrogenase verwendet.
- Das US-Patent 3,862,005 offenbart ein Verfahren zur fermentativen Oxidation von Disacchariden zu Aldobionsäuren mittels des Mikroorganismus Pseudomonas graveolens oder Pseudomonas fragi. Das Verfahren wird ausdrücklich zur Konversion von Maltose in Maltobionsäure beschrieben.
- Dieses Verfahren umfasst u.a. die folgenden drei Stufen, nämlich das Ziehen der Mikroorganismen (Wachstumsphase), die Trennung der gezogenen Zellen von dem Wachstumsmedium (Trennungsstufe) und die Oxidation der Disaccharide mittels der in dem Zellmaterial vorliegenden Enzyme (Produktionsphase). Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die Notwendigkeit des Abtrennens des Zellmaterials aus dem Wachstumsmedium vor der Produktionsphase in einem anderen Medium. Dies ist erforderlich, weil auch während der Wachstumsphase diese Mikroorganismen Disaccharide (beispielsweise Maltose) als Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen.
- Die Erfindung betrifft die fermentative Herstellung von Aldobionsäuren wie Maltobionsäure oder Lactobionsäure durch das Mikroorganismus Pseudomonas cepacia. Dieses Verfahren besteht im wesentlichen aus zwei Phasen, nämlich der Wachstumsphase und der Produktionsphase. Das Wachstumsmedium umfasst verschiedene mineralische Substanzen, die für das Wachstum des Mikroorganismus erforderlich sind, und ferner eine Kohlenstoff- und Energiequelle (beispielsweise Glucose) und ein reduzierendes Disaccharid (beispielsweise Maltose oder Lactose). In der Wachstumsphase wird im wesentlichen Zellmaterial (Biomasse) durch Umwandlung der Glucose gebildet, wobei dieses Zellmaterial das Enzym Dehydrogenase umfasst, welches die Bildung von Aldobionsäure katalysiert. Während der Wachstumsphase werden die vorliegenden Disaccharide nicht als Kohlenstoffquelle verwendet. Diese Disaccharide induzieren die Dehydrogenase, was dazu führt, daß in der Wachstumsphase die Bildung von Aldobionsäuren in einem begrenzten Ausmaß bereits stattfindet.
- Nachdem ausreichend Zellmaterial im Fermenter während der Wachstumsphase gebildet worden ist, wird die Produktionsphase im selben Fermenter durchgeführt, ohne daß es erforderlich wäre, das Zellmaterial zunächst abzutrennen. Zu diesem Zweck wird eine zusätzliche Menge Disaccharid (beispielsweise Maltose oder Lactose) zum Fermentationsmedium hinzugefügt. Ferner wird eine zusätzliche Menge einer Kohlenstoffquelle (beispielsweise Glucose und/oder Hefeextrakt) dem Fermentationsmedium hinzugefügt, um einer starken Zerstörung der Menge des aktiven Zellmaterials im Fermenter während der Produktionsphase vorzubeugen. Während der Produktionsphase wird das Disaccharid nahezu ausschließlich in die entsprechende Aldobionsäure oder deren Salz umgewandelt. Zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignete Mikroorganismen sind die Stämme Pseudomonas cepacia CBS 659.88 und Pseudomonas cepacia CBS 658.88, die beide am 26. Oktober 1988 beim Centraalbureau voor Schimmelcultures of Baarn, Niederlande, hinterlegt worden sind.
- Die Fermentationsbedingungen können innerhalb großer Grenzen variiert werden. Die Fermentationstemperatur liegt vorzugsweise im Bereich von 20 bis 50 ºC, der pH-Wert des Fermentationsmediums liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 8. Während der Fermentation wird der pH-Wert des Fermentationsmediums etwa neutral gehalten, vorzugsweise durch Hinzufügen (Titration) von wässrigen Alkalilösungen, beispielsweise von NaOH oder KOH. Das Fermentationsmedium wird vorzugsweise gerührt und belüftet. Die umzuwandelnden Disaccharide können in reiner Form zugegeben werden.
- Es können jedoch auch Produkte eingesetzt werden, die reich an Disacchariden sind, wie Maltosesirupe oder Stärkehydrolysate, die vergleichsweise viel Maltose enthalten. Die Dauer der Fermentation hängt u.a. von der Menge der gebildeten Biomasse, der Zusammensetzung des Fermentationsmediums und den Fermentationsbedingungen ab. Die Fermentation kann beendet werden durch Entfernung des Zellmaterials aus dem Fermentationsmedium, beispielsweise durch Filtration. Die erzielte Oxidationsausbeute (mol eingesetztes Disaccharid auf mol gebildeter Aldobionsäure) kann zwischen etwa 70 bis 95% liegen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere geeignet zur Herstellung von Maltobionsäure oder deren Salzen aus Maltose enthaltenden Substraten und zur Herstellung von Lactobionsäure oder deren Salzen aus Lactose enthaltenden Substraten. Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert.
- In einem Laborfermenter (Kapazität 2 l; Hersteller Applikon) wird ein Wachstumsmedium zusammengesetzt, das aus den folgenden Bestandteilen besteht:
- Destilliertes Wasser 700 ml
- (H&sub4;)&sub2;SO&sub4; 2,8 g
- K&sub2;HPO&sub4; 0,98 g
- MgSO&sub4;x7H&sub2;O 0,14 g
- Spurenelementlösung 3,5 ml
- Die Lösung der Spurenelemente enthält die folgenden Bestandteile:
- FeCl&sub2;x4H&sub2;O 2 g/l
- H&sub3;BO&sub3; 0,05 g/l
- ZnCl&sub2; 0,05 g/l
- CuCl&sub2; 0,03 g/l
- MnCl&sub2;x4H&sub2;O 0,5 g/l
- (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4;x4H&sub2;O 0,05 g/l
- AlCl&sub3; 0,5 g/l
- CoCl&sub2;xH&sub2;O 0,05 g/l
- NiCl&sub2; 0,05 g/l
- EDTA 0,5 g/l
- HCl (konzentriert) 1 ml/l
- Dieses Wachstumsmedium wurde 20 Minuten lang bei 120 ºC sterilisiert. Dann wurden getrennt sterilisierte wässrige Lösungen von 8 g Glucose und 2 g Maltose hinzugefügt. Nach Abkühlen der Fermentationstemperatur auf 30 ºC wurde der pH-Wert des Mediums auf pH 7 mit wässriger KOH-Lösung eingestellt. Das ganze wurde mit 100 ml einer Vorkultur von Pseudomonas cepacia CBS 659.88 beimpft, die in einem Erlenmeyer mit demselben Medium wie der Hauptkultur gezüchtet worden war. Während der Wachstumsphase wurde eine Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 40 l/h vorgenommen. Nachdem in der Wachstumsphase ausreichend Zellmaterial gebildet worden war, wurden 300 ml einer wässrigen Maltose/Glucose-Lösung (Maltosegehalt 350 g/l; Glucosegehalt 20 g/l) in drei gleichen Portionen hinzugefügt. Während der Produktionsphase wurde die Belüftung auf 60 l/h erhöht. Während der gesamten Fermentation wurde eine Titration mit wässriger KOH-Lösung durchgeführt, um den pH-Wert des Mediums bei etwa 7 zu halten. Die Fermentation wurde 48 Stunden nach Zugabe der Maltose/Glucose-Lösung beendet. Zu diesem Zeitpunkt waren etwa 95 Gew.% der hinzugefügten Maltose in Maltobionsäure umgewandelt worden. Das Zellmaterial wurde aus dem Reaktionsgemisch durch Zentrifugieren entfernt. Zu dem Überstand wurde 1 g/l Filtrationshilfe ("Dicalite" ) und 4 g/l aktiver Kohlenstoff ("Norit SX 2" ) gegeben. Nach einer Stunde Konditionierung bei 40 ºC wurde das Reaktionsgemisch über einen Papierfilter filtriert. Die klare Flüssigkeit wurde durch Verdampfen ("Rotavapor" ) auf 69 Gew.% Trockenmasse (70 º Brix) eingedickt. Die Analyse mittels Dünnschichtchromatographie zeigte, daß das aufgearbeitete Reaktionsgemisch nur Maltobionsäure und Maltose enthielt.
- In den Laborfermenter des Beispiels 1 wurden 100 g Maltose in 700 ml destilliertem Wasser gelöst. Nachdem der pH-Wert der Lösung auf 3 eingestellt worden war, wurde die Lösung 20 Minuten lang bei 110 ºC sterilisiert. Anschließend wurden 500 ml einer sterilisierten wässrigen Lösung hinzugefügt, die die folgenden Wachstumskomponenten enthielt:
- (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 4,2 g
- K&sub2;HPO&sub4; 0,98 g
- KH&sub2;PO&sub4; 0,56 g
- MgSO&sub4;x7H2O 0,14 g
- Spurenelementlösung 3,5 ml
- Hefeextrakt 1,5 g
- Glucose 10,8 g
- Anschließend wurde das Medium auf 30 ºC abgekühlt und der pH-Wert auf 7 mit wässriger NaOH-Lösung eingestellt. Dann wurde die Fermentation durch Hinzufügen von 100 ml Impfmaterial Pseudomonas cepacia CBS 658.88, welches einer Erlenmeyer-Vorkultur entstammte, eingeleitet. Nach 24 und 48 Stunden wurden jeweils 200 ml und 100 ml einer wässrigen Maltose/Glucose-Lösung (Maltosegehalt 600 g/l; Glucosegehalt 30 g/l) hinzugefügt. Während der Fermentation wurde eine Titration mit NaOH-Lösung durchgeführt, um den pH-Wert bei etwa 7 zu halten. Nach 72 Stunden wurde die Fermentation beendet. Das Produkt wurde weiter, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet. Die erhaltene konzentrierte Lösung enthielt 72 % Maltobionsäure, bezogen auf das Trockenmaterial.
- In dem Laborfermenter des Beispiels 1 wurde der Mikroorganismus Pseudomonas cepacia CBS 659.88 kultiviert. Das Medium für die Wachstumsphase hatte die folgende Zusammensetzung:
- (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 8,4 g/l
- K&sub2;HPO&sub4; 2 g/l
- MgSO&sub4;x7H&sub2;O 0,28 g/l
- Hefeextrakt 3 g/l
- Spurenelementlösung 7 ml/l
- Zu 500 ml dieses sterilisierten Mediums wurden 150 ml sterilisierte Glucoselösung hinzugegeben, um eine Glucosekonzentration von 21,6 g/l zu erhalten. Dann wurde die Fermentationstemperatur auf 30 ºC eingestellt. Der pH-Wert des Mediums wurde mit NaOH-Lösung auf 7 eingestellt. Die Fermentation wurde durch Hinzufügen von 100 ml Impfmaterial aus einem Erlenmeyer mit einer Vorkultur von Pseudomonas cepacia CBS 659.88 eingeleitet. Nachdem der Mikroorganismus ausreichend gewachsen war, wurden 750 ml einer wässrigen Lactose/Glucose-Lösung (Lactosegehalt 560 g/l; Glucosegehalt 10 g/l) hinzugefügt. Während der Fermentation wurde eine Filtration mit NaaH-Lösung durchgeführt, um den pH-Wert des Mediums auf etwa 7 zu halten. Die Fermentation wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet. Der Gehalt an Lactobionsäure (in Form des Natriumsalzes) im Endprodukt betrug 85 Gew.%, bezogen auf die Trockenmasse.
Claims (5)
1. Ein Verfahren zur fermentativen Oxidation von
reduzierenden Disacchariden zu Aldobionsäuren, dadurch
gekennzeichnet, daß ein Fermentationsmedium, welches ein
reduzierenden Disaccharid und Wachstumsbestandteile enthält,
unter aeroben Bedingungen mit Zellmaterial behandelt wird,
das durch Ziehen von zur Gattung Pseudomonas cepacia
gehörenden Mikroorganismen erhalten wird, ohne daß das
Zellmaterial vom Wachstumsmedium, in dem es gebildet wurde,
getrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Zellmaterial erhalten wird durch Ziehen des Stamms
Pseudomonas cepacia CBS 659.88.
3. Ein Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Zellmaterial erhalten ist durch Ziehen des Stamms
Pseudomonas cepacia CBS 659.88.
4. Ein Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß Maltobionsäure oder deren Salze durch
fermentative axidation von Maltose enthaltenden Substraten
hergestellt werden.
5. Ein Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß Lactobionsäure oder deren Salze durch
fermentative Oxidation von Lactose enthaltenden Substraten
hergestellt werden.
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