DE69121135T2 - Herstellung von Vanillin durch biologische Umwandlung von Benzolvorstufen - Google Patents
Herstellung von Vanillin durch biologische Umwandlung von BenzolvorstufenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vanillin durch biologische Umwandlung von Benzol-Vorläufern.
- Vanillin wird derzeit hergestellt entweder durch chemische Synthese oder im naturlichen Zustand durch Extraktion aus Vanilleschoten.
- Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Vanillin zu entwickeln, das einfach zu industrialisieren ist und das die Herstellung eines Vanillins erlaubt, das nach den insbesondere in den Ländern der Europäischen Union in Kraft befindlichen Vorschriften als naturlich angesehen werden kann. Dies ist der Fall bei Produkten, die durch biologische Umwandlung von natürlichen Vorläufern mit Hilfe von Mikroorganismen erhalten werden.
- In einem Artikel in "Agric. Biol. Chem." 41(6), 925-929 (1977), ist der Abbau von Eugenol zu Protokatechusäure durch ein Bakterium beschrieben, in dessen Verlauf Vanillin als Zwischenprodukt-Metabolit erhalten wird.
- In einem Artikel in "J. Sci. Food. Agric.", Band 36 10(985), 925-935, ist der Abbau von Lignin, das einen Ferulasäureester enthält, durch Pycnoporus cinnabarinus beschrieben, ohne daß die Herstellung von Vanillin erwähnt ist.
- Um dies zu erreichen, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Vanillin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Basidiomyceten-Pilz des Genus Pycnoporus oder Varianten und Mutanten davon in einem Kulturmedium kultiviert, dem ein Benzol-Vorläufer von Vanillin Zugegeben worden ist, und daß man das nach der biologischen Umwandlung des genannten Vorläufers als Produkt gebildete Vanillin gewinnt (abtrennt), wobei der Stamm von Pycnoporus wegen seiner metabolischen Eigenschaften, die genannten Vorläufer abzubauen, unter Anreicherung von Vanillin in dem Medium, ausgewählt wird.
- Als Benzol-Vorläufer verwendet man insbesondere Derivate in der 1- Position von 4-Hydroxy-3-methoxy-benzol, wie Vanillinsäure oder Ferulasäure.
- Besonders zweckmäßig verwendet man einen Pilz der Species Pycnoporus cinnabarinus, insbesondere die Stämme CNCM Nr.I-937 und I-938 oder ihre Varianten und Mutanten, welche die metabolische Eigenschaft haben, die Benzol-Vorläufer des Vanillins, wie Ferulasäure, abzubauen unter Anreicherung von Vanillin in dem Medium in einem erhöhten Grad.
- Vorteilhaft verwendet man Vorläufer, die aus natürlichen Pflanzensubstraten stammen, die vorzugsweise reich an den genannten Vorläufern sind. Es können genannt werden die Ferulasäure, die in den Zellmembranen zahlreicher Monokotyledonen und Dikotyledonen vorkommt, beispielsweise in Zuckerrüben-Schalen, einem Nebenprodukt der Zuckerindustrie, oder in den Aleuron Körnern von Getreide oder unterschiedlichen Getreidesorten. Die naturlichen Quellen für Ferulasäure sind daher verhältnismäßig zahlreich. Ein anderer Benzol-Vorläufer natürlichen Ursprungs, der erfindungsgemäß verwendbar ist, ist das Isoeugenol.
- Andererseits können Verbindungen wie p-Hydroxybenzoesäure, p- Hydroxybenzaldehyd, Vanillylalkohol und Stilbene unter anderen verwendet werden.
- Bei einer bevorzugten Art der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Pilz zunächst in einem gerührten flüssigen Medium kultiviert und man gibt den Vorläufer erst zu, nachdem eine beträchtliche Biomasse, welche die für die biologische Umwandlung des genannten Vorläufers optimalen enzymatischen Fähigkeiten besitzt, erhalten worden ist.
- Im Falle der Kultur des Pilzes Pycnoporus cinnabarinus gibt man somit vorteilhaft den Vorläufer zu, wenn die erforderliche Biomasse erhalten worden ist beispielsweise nach drei Tagen unter den Kultivierungsbedingungen des Mediums der weiter unten detailliert beschriebenen Anlage 2.
- Wenn man den Vorläufer zu Beginn der Kultivierung zugibt, ist zwar eine biologische Umwandlung in Vanillin festzustellen, jedoch in viel geringeren Ausbeuten.
- Bei einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht das Inokulum, mit dessen Hilfe der Pilz in das Kulturmedium inokuliert wird, aus Mycel-Fragmenten oder Sporen oder aus Vorkulturen dieser Inokula.
- Man kann Vorläufer in einer Menge einführen, die bis zu 500 g/ml Kulturmedium gehen kann.
- In dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet man mindestens 15 Mycel-Fragmente auf 100 ml Kulturmedium und 10&sup5; bis 10&sup7; Sporen/ml Medium. Der pH-Wert des Kulturmediums kann zwischen 2,5 und 6,5 liegen. Die Inkubationstemperatur der Kulturen kann zwischen 25 und 40ºC liegen.
- Vorteilhaft gewinnt man (trennt man ab) das Vanillin, wenn der Vorläufer in dem Kulturmedium nicht mehr nachweisbar ist und vor seiner biologischen Umwandlung in Vanillylalkohol.
- Um das Vanillin zu gewinnen (abzutrennen), kann man es nach dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren aus Kulturmedien mit Lösungsmitteln extrahierten und anschließend eine Destillation durchführen, man kann aber auch eine fraktionierte Kristallisation oder eine industrielle präparative Chromatographie durchführen, wobei man direkt von Kulturmedien ausgeht.
- Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der Vorläufer portionsweise oder kontinuierlich zugegeben werden und das Vanillin kann ebenfalls portionsweise oder kontinuierlich gewonnen (abgetrennt) werden.
- Unter den Kultivierungsbedingungen des Mediums des Anhangs 2, wie sie weiter unten im einzelnen beschrieben sind, gewinnt man (trennt man ab) das Vanillin 4 oder 5 Tage nach der Zugabe des Vorläufers.
- Weitere Charakteristika und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung unter Bezugnahme auf die Fig. 1 bis 5 hervor.
- Figur 1 repräsentiert die biologische Umwandlung der Vanillinsäure, die bei der Inokulierung zugegeben worden ist;
- Figur 2 repräsentiert die biologische Umwandlung der Vanillinsäure, die der 3-tägigen Kultur zugegeben worden ist;
- Figur 3 repräsentiert die biologische Umwandlung der Vanillinsäure in Vanillin und Vanillylalkohol;
- Figur 4 repräsentiert die biologische Umwandlung der Ferulasäure, die bei der Inokulation zugegeben worden ist;
- Figur 5 repräsentiert die biologische Umwandlung der Ferulasäure, die der 3-tägigen Kultur zugegeben worden ist.
- Vanillinsäure bzw. Ferulasäure
- Vanillyl-Alkohol
- Vanillin
- Biomasse
- A.V. = Vanillinsäure
- Alc.V. = Vanillyl-Alkohol.
- Ein fadenförmiger Basidiomyceten-Pilz wird vorher in einem gerührten flüssigen Medium kultiviert zur Herstellung einer großen Biomasse, welche die enzymatischen Fähigkeiten hat, die für eine biologische Umwandlung sowie für eine ausreichende Ausbeute erforderlich sind. Nach mehrtägiger Kultivierung wird der sterile Vorläufe aseptisch zugegeben. Das Verschwinden des Vorläufers (Ferulasäure oder Vanillinsäure) und die biologische Umwandlung in Vanillyl- Alkohol und in Vanillinsäure (bei Ferulasäure) werden durch H.P.L.C.-Analyse verfolgt.
- Es werden zwei Basidiomyceten des Genus Pycnoporus cinnabarinus verwendet, die am 10. April 1990 bei der Collection National de Culture de M icroorganisme des Instituts Pasteur (CNCM) unter den Nr.1-937 und 1-938 hinterlegt worden sind.
- Es sind drei Inokulum-Typen möglich: es handelt sich dabei jeweils um Sporen oder Mycelfragmente oder um ihre Vorkultur.
- In einer Roux-Phiole werden 250 ml eines sporenbildenden Mediums (die Zusammensetzung ist in der Anlage 1 angegeben) mit Mycel-Fragmenten einer Kultur auf einem Agar-Medium inokuliert. Die Inkubation wird drei Wochen lang bei 37ºC durchgeführt. Während dieses Zeitraums entwickelt sich das Mycel auf der Agar-Oberfläche unter Bildung von Konidien (Sporen). Diese Sporen werden von der Oberfläche der festen Kultur durch Rühren mit Glaskugeln, die in steriles physiologisches Wasser eintauchen, entfernt. Die so erhaltene Sporensuspension wird durch Glaswolle filtriert, um alle großen Mycelfragmente zu elirninieren. Die Auszählung wird in einer Thoma-Zelle durchgeführt. Man kann dann das Inokulum der Kulturen quantifizieren durch Verwendung eines bekannten Volumen-Aliquots dieser Lösung.
- Hefeextrakt 3g/l
- Malzextrakt 3g/l
- Bacto-Pepton 5g/l
- Glucose 10g/l
- Agar 15g/l
- Biotin (0,001 %ige sterile Lösung) 0,5ml/l
- Salzlösung (1) 20ml/l
- Na&sub3;-Citrat.2H&sub2;O 125 g/l
- KH&sub2;PO&sub4;(wasserfrei) 250 g/l
- NH&sub4;NO&sub3; (wasserfrei) 10g/l
- MgSO&sub4;.7H&sub2;O 10g/l
- Oligoelement-Lösung (2) 5 ml/l
- Citronensäure.H&sub2;0 sog"
- Zinksulfat 50 g/l
- Kupfersulfat 2,5 g"
- Mangansulfat 0,5g/l
- Borsäure 0,5 g/l
- Na&sub2;MoO&sub4;.2H&sub2;O 0,5 g/l
- Fe(NH&sub4;)&sub2;(SO&sub4;)&sub2;.6H&sub2;O 10g/l
- Ein festes Medium (20 g/l Malzextrakt - 15 g/l Agar - 2 g/l Hefeextrakt) in einer Petrischale wird zentral inokuliert durch ein Mycelfragment einer Kultur auf einem Agarmedium. Die Inkubation wird bei 37ºC durchgeflihrt, bis das Mycel die Oberfläche vollständig bedeckt. Dann werden Fragmente dieses Mycels als Inokulum verwendet; die Mycel-Fragmente werden mit einer Lochstanze mit einem Durchmesser von etwa 4 mm ausgeschnitten.
- Eine Inkubation der Sporen oder Mycelfragmente wird in einem Volumen des Mediums (5 bis 10 % des Endvolumens der Kultur) durchgeführt und anschließend als Inokulum verwendet.
- In einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben werden 100 Medium verwendet, das üblicherweise enthält insbesondere eine tierische oder pflanzliche Kohlenstoffquelle, Mineralsalze und Vitamine (eine detaillierte Zusammensetzung des verwendeten Kulturmediums ist in der Anlage 2 angegeben). Man inokuliert entweder mit Mycel-Fragmenten (15 bis 30 pro Kultur) oder mit Sporen in einer Menge von 2.10&sup5; Sporen/ml Medium. Die Kulturen werden bei 37ºC inkubiert, mit 120 UpM und mit einer Amplitude von 6 cm in Rotation versetzt.
- Maltose 20g/l
- Diammoniumtartrat 1,8415 g/l
- KH&sub2;PO&sub4; 0,2 g/l
- CaCl&sub2;.2H&sub2;O 0,0132 g/l
- MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0,5 g/l
- Hefeextrakt 0,5 g/l
- Thiaminhydrochlorid 2,5mg/l
- Sterilisierung durch Behandlung in einem Autoklaven: 20 min bei 120ºC
- Nach 72-stündiger Kultivierung werden sterile Ferulasäure oder Vanillinsäure in einer Menge von 0,3 g/l Kultur zugegeben. Die Ferulasäure und die Vanillinsäure werden verwendet:
- - entweder in Form von in einem Autoklaven behandelten Kistallen,
- - oder in Form eines Salzes in Wasser (beispielsweise das Na&spplus;-, K&spplus;- oder NH&spplus;&sub4;-Salz) und sterilisiert durch Filtrieren (Porosität 0,2 µm).
- Jeden Tag ab der Zugabe des Vorläufers entnnnmt man in steriler Weise 1,5 ml jeder Kultur. Dieses Aliquot wird durch eine mit Methanol vorbehandelte hydrophobe Membran (Porosität 0,2 µm) filtriert und es wird eine H.P.L.C.- Analyse des Filtrats durchgeführt.
- - Inverse Phase: Bondapack C18-Kolonne
- - Lösungsmittel: 0,01 % CH&sub3;COOH in H&sub2;O/Methanol
- - UV-Messung bei 280 nm
- - injiziertes Proben-Volumen: 10 bis 150 µl
- - Vanillylalkohol: 10 min
- - Vanillinsäure: 14min
- - Vanillin: 16min
- - Ferulasäure: ismin
- Diese Messung erfordert die "Opferung" der Kultur; die unter diesen Bedingungen erhaltenen Ergebnisse entsprechen nicht einer echten Kinetik, da es nicht die gleiche Kultur ist, die wahrend der Studie verfolgt wird.
- Die Kulturen von 100 ml werden über eine vorher gewogene Glasfasermembran filtriert. Die gesammelt Biomasse wird 24 h lang auf 100ºC gebracht. Man bestimmt das entsprechende Trockenmaterial durch Wiegen.
- Beispiel mit dem Stamm Nr.I-937 (die gleichen Ergebnisse wurden mit dem Stamm Nr.1-938 erhalten).
- Zugabe des Vorläufers bei der Inokulation (vgl. Fig. 1)
- Man stellt einen schnellen und vollständigen Verbrauch der Vanillinsäure innerhalb von 3 bis 4 Tagen der Kultivierung fest. Die Mikroben-Biomasse nimmt zu bis zum letzten Tag der Analyse. Die Vanillin-Synthese wird ab dem 2. Tag nachgewiesen und die angereichterte Vanillin-Menge wächst bis zum letzten Tag der Untersuchung. Die maximale molare Umwandlungs-Ausbeute in Vanillin ist gering: 3,8 %.
- Der Vorläufer wird der 3 Tage alten Kultur zugegeben (vgl. Fig. 2)
- Der Verbrauch der Vanillinsäure erfolgt schneller als in dem vorhergehenden Fall: innerhalb von 2 Tagen erreicht die Vorläufer-Konzentration 0 mg/l. Die mikrobielle Biomasse nimmt wenig zu nach dem Tag der Zugabe der Vanillinsäure. Die Vanillin-Synthese erfolgt praktisch sofort ünd man erreicht einen maximalen Gehalt 2 Tage nach der Zugabe. Nach diesem Tag verschwindet das Vanillin aus dem Medium sehr schnell. In diesem Fall ist die maximale molare Umwandlungsausbeute in Vanillin höher als vorher: 35,1 %.
- Der Vorläufer wird der 3 Tage alten Kultur zugegeben (vgl. Fig. 3)
- Die Bedingungen der biologischen Umwandlung sind die gleichen wie vorher; die Konzentrationen an Vanillinsäure und Vanillin sind daher ähnlich: die Konzentration an Vanillin ist maximal, wenn die Konzentration an Vorläufer 0 mg/l erreicht. Die Ergebnisse der Zugabe des Vanillylalkohols lassen vermuten, daß das Vanillin in seinen Alkohol umgewandelt worden ist. Das Verschwinden des Alkohols wird tatsächlich um etwa 24 h verschoben gegenüber demjenigen des Vanillins und seine Konzentration nimmt beträchtlich zu, wenn das Vanillin aus dem Kulturmedium verschwindet. Eine der Möglichkeiten, die Produktion zu optimieren, besteht darin, diese Reduktion zu blockieren, was zur Bildung von Vanillylalkohol auf Kosten des Vanillins führt. Die maximale molare Umwandlungsausbeute in Vanillin ist mit dem oben angegebenen Wert vergleichbar: 31 %.
- Der Vorläufer wird bei der Inokulation zugegeben (vgl. Fig. 4)
- Wie im Fall der Zugabe der Vanillinsäure bei der Inokulation nimmt die Biomasse bis zum letzten Tag der Untersuchung beträchtlich zu. Der Abbau der Ferulasäure ist nach 4 bis 5 Tagen vollständig. Man stellt eine Synthese von Vanillinsäure und Vanillin fest, die Ausbeuten sind jedoch zienilich gering (maximale molare Umwandlungsausbeute in Vanillin: 0,2 %).
- Der Vorläufer wird der 3 Tage alten Kultur zugegeben (vgl. Fig. 5)
- In diesem Fall der Zugabe zu der drei Tage alten Kultur verschwindet die Ferulasäure innerhalb von 3 Tagen vollständig aus dem Medium. Man stellt die gleichzeifige Synthese von Vanillinsäure und Vanillin fest. Wie für die Vanillinsäure ist die Vanillinmenge maximal, wenn die Konzentration an Vorläufer gegen Null geht. Die maximale molare Umwandlungsausbeute in Vanillin beträgt 20,5 %.
Claims (10)
1. Verfahren zur Herstellung von Vanillin, dadurch gekennzeichnet,
daß man den Basidiomyceten-Pilz des Genus Pycnoporus oder Varianten und
Mutanten davon in einem Kulturmedium kultiviert, dem ein Benzol-Vorläufer
des Vanillins zugegeben worden ist, und das durch biologische Umwandlung aus
dem Vorläufer gebildete Vanillin gewinnt (abtrennt), wobei der Pycnoporus-
Stamm ausgewahlt wird wegen semer metabolischen Eigenschaft, die genannten
Vorläufer abzubauen, unter Anreicherung von Vanillin in dem Medium.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem
Pilz um die Species Pycnopors cinnabarinus handelt.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2,
daß der Vorläufer aus naturlichen Pflanzensubstraten stammt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der
Benzolvorläufer die Ferulasäure ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß der Pilz zunächst in einem gerührten flüssigen Medium kultiviert
wird und daß man den Vorläufer erst zugibt, nachdem eine beträchtliche
Biomasse erhalten worden ist, die für die biologische Umwandlung des Vorläufers
optimale enzymatische Fähigkeiten besitzt.
6. Verfahren nach Anspruchs, dadurch gekennzeichnet, daß der Vorläufer
dem Kulturmedium erst nach mindestens dreitägiger Kultivierung von Pycnopors
cinnabarinus zugegeben wrid.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß der Pilz in das Kulturmedium inokuliert wird durch ein Inokulum,
das besteht aus Mycelfragmenten oder aus Sporen oder mit Vorkulturen dieser
Inokula.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man das Vanillin gewinnt (abtrennt), wenn der Vorläufer in dem
Kultunnedium nicht mehr nachweisbar ist und vor der biologischen
Umwandlung des Vanillins in Vanillylalkohol.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Zugabe des Vorläufers und die Gewinnung (Abtrennung)
des Vanillins portionsweise oder kontinuierlich durchführt.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Pilzstämme Pycnopors cinnabarinus CNCM Nr. I-937 und
CNCM I-938 oder ihre Varianten und Mutanten verwendet, welche die
metabolische Eigenschaft haben, die Benzol-Vorläufer des Vanillins wie Ferulasäure
abzubauen unter Anreicherung von Vanillin in dem Medium.
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