DE69833516T3 - Verfahren zur Herstellung von Vanillin - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Vanillin aus Ferulasäure. Gemäß diesem Verfahren wird eine Kultur, vorzugsweise eine untergetauchte oder überschwemmte Kultur, von einem Bakterium der Ordnung Actinomycetales und der Familie Streptomycetaceae mit dem Substrat Ferulasäure inkubiert, um fermentativ Vanillin zu erzeugen. Das Produkt Vanillin wird aus der Fermentationsbrühe gewonnen durch ein ausgelegtes Extraktionsverfahren, das auch die Trennung und Gewinnung von wertvollen Fermentationsnebenprodukten ermöglicht, um das analytisch und sensorisch gereinigte Produkt Vanillin und insbesondere das Nebenprodukt Guajakol zu erhalten.
• Bei der Verwendung von Aroma- oder Geschmacksverbindungen, ist es immer wichtiger, dass die Aroma- oder Geschmacksverbindungen als „natürlich” bezeichnet werden können. Gemäß den europäischen und US-Regulierungen bedeutet dies, dass die Verbindung erhalten werden muss durch physikalische, enzymatische oder mikrobiologische Verfahren und nur aus Materialien von pflanzlicher oder tierischer Herkunft. Zahlreiche Forschungsaktivitäten während der letzten Dekade waren daher fokussiert auf die Verwendung von erneuerbaren, billigen und natürlichen Rohmaterialquellen für die fermentative Herstellung von Vanillin. In Publikationen und in Patenten wurde jedoch bisher nur sehr selten von kommerziell attraktiven volumetrischen oder ausgiebigen Ausbeuten berichtet.
• Guajakol ist ein phenolisches Molekül von einem rauchigen Typ, das signifikant zu dem charakteristischen Aroma oder Geschmack von Vanilleextrakten beiträgt. Es wird daher oft in Kombination mit Vanillin für Aromen oder Geschmäcke vom Vanillintyp verwendet. Die fermentative Herstellung von natürlichem Guajakol wurde jedoch bisher noch nicht beschrieben.
• In den letzten 10 Jahren wurden mehrere Patentanmeldungen angemeldet, die die mikrobielle oder enzymatische Herstellung von Vanillin betreffen. Im Allgemeinen wird ein geeigneter Vorläufer in Vanillin transformiert durch einen Mikroorganismus oder ein Enzym. Vorgeschlagene Vorläufer sind Eugenol, Isoeugenol, Ferulasäure, Curcumin oder Benzoe-Siam-Harze. In der Regel sind die Transformationsausbeuten extrem gering. Beispiele sind z. B. Haarman & Reimer ( EP 0 405 197 A1 ), die eine Herstellung von 18 mgl^–1 beanspruchen, ausgehend von 0,2 gl^–1 Eugenol unter Verwendung der Mikroorganismen Serratia, Klebsiella oder Enterobacter. Diese Transformation benötigt außerdem 13 Tage. Pernod-Ricard ( EP 0 453 368 A ) beanspruchen 46 mgl^–1 Vanillin, die in 6 Tagen durch Pycnoporus Fermentation aus Ferulasäure erhalten werden. In dieser Reihe beanspruchen auch Kraft General Foods ( US 5 128 253 ) 210 mgl^–1 Vanillin aus Ferulasäure innerhalb von 54 Tagen. Um diesen Titer zu erhalten, musste ein Reduktionsmittel zugegeben werden, da ansonsten die Bildung von Vanillin nicht stattfinden würde und nur Vanillinsäure gebildet werden würde. Die WO 96/08576 A beschreibt ein Verfahren zum Erhalt von Vanillinsäure durch Bioumsetzung von Ferulasäure. Takasago ( JP 227890/1993 ) stellte Mutanten von Pseudomonas-Stämmen her, die blockiert sind im Abbauweg von Vanillin. Daher konnte ausgehend von 1 gl^–1 Ferulasäure 0,28 gl^–1 Vanillin erhalten werden. Die bislang einzige Anwendung, die ökonomisch attraktive volumetrische oder ausgiebige Ausbeuten von Vanillin in einem Fermentationsverfahren berichtet, wurde veröffentlicht von Haarman & Reimer ( EP 0 761 817 A2 ). Sie identifizierten zwei Stämme der Gattung Amycolatopsis, die in der Lage sind, Vanillin zu akkumulieren bis zu einer Konzentration von 11,5 gl^–1 in der Fermentationsbrühe nach dem Zuführen oder Füttern von Ferulasäure.
• Schließlich kann festgestellt werden, dass große Mengen an Vanillin nicht leicht gebildet werden in mikrobiellen Systemen. Dies liegt hauptsächlich an der zellulären Toxizität von Vanillin, die bei Konzentrationen oberhalb von 1 gl^–1 das Wachstum der Vanillin erzeugenden Mikroorganismen verhindert. In mikrobiellen Systemen wird in der Regel der jeweilige Alkohol oder die jeweilige Säure gefunden und nicht Vanillin. Dieser toxische Effekt oder diese toxische Wirkung von Vanillin wurde überwunden durch die Verwendung von Enzymen (Quest, EP 0 542 348 A2 ). Ein Behandeln von Isoeugenol mit Lipoxygenase führte zu 10 bis 15 gl^–1 Vanillin bei einer Ausbeute von 10 bis 15%. Viel geringere Konzentrationen wurden erhalten, wenn Eugenol (0,3 bis 0,5 gl^–1 in einer Ausbeute von 0,3 bis 0,5%) verwendet wurde, und bezüglich Ferulasäure wird von keinem Umsatz berichtet. Das Verfahren, das Lipoxygenase einsetzt, ist kaum attraktiv unter dem ökonomischen Gesichtspunkt.
• Eine weitere Maßnahme, um die Toxizität dieser Verbindung zu umgehen, ist die mikrobielle Herstellung von Coniferylaldehyd, das Vanillin bildet bei einer thermischen Behandlung, siehe BASF (Offenlegungsschrift, DE 36 04 874 A ). Ähnlich ist aus das immobilisierte Zellsystem, wie es beschrieben ist in der aktuellen Orsan Patentanmeldung ( WO 96/34971 ), in der Vanillin akkumuliert wird bis zu einer Konzentration von 1 gl^–1. Ein möglicher ökonomischer Nutzen der Verwendung von immobilisierter Biomasse wird verursacht durch das Recycling oder Wiedergewinnen des Biokatalysators.
• Viele Veröffentlichungen behandeln den jeweiligen metabolischen Weg oder Stoffwechselablauf ausgehend von Eugenol, Isoeugenol oder Ferulasäure. Im Allgemeinen wird Vanillin für eine Zwischenverbindung gehalten im Abbauweg dieser Verbindungen. Zwei Veröffentlichungen können zitiert werden, welche die Rolle von Vanillin bei dem Abbau von Ferulasäure zeigen. Toms and Wood, Biochemistry 9 (1970) 337–343, kultivierten Pseudomonas sp. auf Ferulasäure und klärten den Abbauweg auf. Obwohl Vanillin nicht in dem Kulturüberstand gefunden wurde, gab es einen Beweis dafür, dass Vanillin eine Zwischenverbindung ist, da Vanillinsäure nachgewiesen werden konnte. Ausgehend von Ferulasäure wurde Vanillin in Kulturen von Streptomyces setonii (Sutherland et al., Can. J. Microbiol. 29 (1983) 1253 bis 1257) erhalten. Kein Hinweis wurde gegeben hinsichtlich der Menge, aber es wurden nur Spuren gefunden, als das Experiment wiederholt wurde.
• Ferulasäure als ein Substrat für Biotransformationen ist reichlich erhältlich aus verschiedenen natürlichen Quellen. Die Säure tritt oft in der Form eines Glucosids in Pflanzenmaterialien, wie Holz, Zuckerrübenmelasse, Kleie von Mais, Reis und anderen Typen von Gräsern, auf. Sie kann aus den entsprechenden Glycosiden in diesen Produkten isoliert werden durch gut bekannte Hydrolyseverfahren, z. B. unter Verwendung von Enzymen, und kann als Rohmaterial oder gereinigtes Material verwendet werden. Eine britische Quelle ( GB 2 301 103 A1 ) beschreibt z. B. den enzymatischen Abbau von Ferulasäure enthaltendem Pflanzenmaterial durch eine Ferulasäureesterase, um die freie Säure zu erhalten.
• Die vorliegende Erfindung ist in den beigefügten Ansprüchen definiert.
• Das vorliegende neue mikrobiologische Verfahren mit hoher Ausbeute für die Herstellung oder Erzeugung von Vanillin umfasst ein Kultivieren eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces (Ordnung der Actinomycetales, Familie Streptomycetaceae) und insbesondere eines Bakteriums, das zu Streptomyces setonii gehört, zuerst in einer Nährbrühe, wobei die Kultivierungsdauer etwa 5 bis 40 Stunden beträgt und andauert, bis die Kohlenstoffquelle Glucose (fast) verbraucht ist, dann ein Zugeben des Substrats Ferulasäure in dem Bereich von etwa 5 bis 40 gl^–1 der Fermentationsbrühe, entweder kontinuierlich oder chargenweise (Batchverfahren). Nach einem ungefähren Inkubations (Biotransformations)zeitraum von etwa 5 bis 50 Stunden wird die Substratumsetzung in Vanillin und mehrere Nebenprodukte vervollständigt. Die Ferulasäure wird verbraucht, und Vanillin wird akkumuliert bis zu etwa 8 bis 16 gl^–1 in der Fermentationsbrühe. Typische Nebenprodukte der Ferulasäurebiotransformation sind Vanillinalkohol, Vanillinsäure, Guajakol, para-Vinylguajakol und 2-Methoxy-4-ethylphenol.
• Eine nachfolgende Produktgewinnung besteht aus der Entfernung der Biomasse, geeigneterweise gefolgt von einer Zweistufenextraktion mit einem geeigneten organischen Lösemittel, vorzugsweise Methyl-tert.-butylether. Eine erste Extraktion wird ausgeführt bei einem pH > von etwa 9, vorzugsweise bei einem pH von 10 bis etwa 11 in der wässrigen Phase, um selektiv Nebenprodukte zu extrahieren, wie das sensorisch hochwirksame Guajakol. Dann wird das wässrige Raffinat „angesäuert” bis auf neutrale pH Werte, um selektiv das Produkt Vanillin zu extrahieren. Eine Reinigung des rohen Vanillinextrakts kann schließlich durchgeführt werden durch Anwendung bekannter Umkristallisationsverfahren. Guajakol kann aus dem Rohextrakt durch Destillation gereinigt werden.
• Das mikrobiologische Verfahren und das Extraktionsverfahren, die beschrieben sind, sind nützlich für eine ökonomisch attraktive Herstellung von natürlichem Vanillin sowie von Nebenprodukten aus Ferulasäure gemäß dem folgenden biochemischen Weg: Weg des Ferulasäureabbaus, z. B. durch Streptomyces setonii

  
• Das erhaltene Vanillin (Verbindung 2) sowie das Nebenprodukt Guajakol (Verbindung 3) sind beides bekannte Aroma- oder Geschmacks- und Duftverbindungen. Ihre Verwendung und Anwendung sind dem Fachmann bekannt. Durch Verwendung wirksamer und ausgeglichener Mengen dieser Verbindungen ist es möglich, die organoleptischen Eigenschaften von aromatisierten Verbrauchsgütern, wie Getränken, Molkereiprodukten, Bäckerei- oder Backwaren, Eiscreme und dergleichen zu verbessern oder zu erweitern oder steigern. Fermentativ hergestelltes Vanillin und Guajakol sind insbesondere wertvoll in beliebigen Zusammensetzungen vom Vanilletyp und Fruchtaromen oder Fruchtgeschmäckern, wobei nur natürliche Inhaltsstoffe benötigt werden.
• Wie oben dargelegt, wurden nun exakte Fermentationsbedingungen, kombiniert mit einem wirksamen Produktgewinnungsverfahren, aufgefunden, um eine Herstellung mit hoher Ausbeute von sensorisch und analytisch gereinigtem Vanillin zu ermöglichen sowie die Aroma- oder Geschmacksverbindung Guajakol als Nebenprodukt mit großer Wirkung zu erhalten. Diese Bedingungen basieren auf der Kultivierung des Bakteriums Streptomyces setonii in einem geeignetem Kulturmedium oder Nährboden und der nachfolgenden Zugabe des Substrats Ferulasäure in Überschusskonzentrationen, d. h. ca. 5 bis ca. 40 g/l, um Vanillin in hohen volumetrischen Ausbeuten in der Fermentationsbrühe zu erhalten.
• Am meisten geeignet ist innerhalb der Spezies Streptomyces setonii der kommerziell erhältliche Stamm ATCC 39116.
• Das Substrat Ferulasäure ist durch die Formel (1) definiert. Gemäß dem neuen Verfahren wird ein Ferulasäurematerial mit einem Ferulasäuregehalt von vorzugsweise mehr als 10% als Substrat verwendet. Die Natur der verbleibenden Verbindungen ist abhängig von der Quelle oder dem Ursprung.
• Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung wird das Kultivieren des Bakteriums ausgeführt in einem wässrigen Medium oder Nährboden in Gegenwart von üblichen Nährstoffsubstanzen. Ein geeignetes Kulturmedium enthält eine Kohlenstoffquelle, eine organische oder anorganische Stickstoffquelle, anorganische Salze und Wachstumsfaktoren.
• Für das Kulturmedium wird vorzugsweise Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet, z. B. in einer Konzentration von etwa 5 bis 50 gl^–1, vorzugsweise etwa 20 bis 35 gl^–1. Ein Hefeextrakt ist eine brauchbarere Quelle für Stickstoff, Phosphate, Wachstumsfaktoren und Spurenelemente können zugegeben werden, z. B. bei einer bevorzugten Konzentration von etwa 2 bis 20 gl^–1, am meisten bevorzugt etwa 5 bis 10 gl^–1. Außerdem können Magnesiumionen, z. B. Magnesiumsulfat, in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 5 gl^–1, vorzugsweise bei etwa 0,5 bis 1 gl^–1, zugegeben werden.
• Die Kulturbrühe wird hergestellt und in einem Bioreaktor sterilisiert und wird dann geimpft mit einem Stamm von Streptomyces setonii, um die Wachstumsphase zu starten oder initiieren. Eine geeignete Dauer der Wachstumsphase beträgt etwa 5 bis 40 h, vorzugsweise 15 bis 35 h, und am meisten bevorzugt etwa 20 bis 30 h.
• Spezifikationen von weiteren Verfahrensbedingungen sind:

  pH-Bereiche:	etwa 7 bis etwa 9
  Temperaturbereich:	etwa 30 bis etwa 45°C
  Luftzufuhr:	bevorzugt für dieses aerobe Verfahren
  Rühren:	ist bevorzugt.

• Nach der Beendigung der Wachstumsphase wird der pH-Wert der Fermentationsbrühe auf etwa 8,5 verschoben und das Substrat Ferulasäure der Kultur zugeführt. Eine geeignete Menge an Substratzuführung beträgt 5 bis 40 gl^–1 der Fermentationsbrühe, vorzugsweise etwa 15 bis 30 gl^–1, am meisten bevorzugt 20 bis 25 gl^–1. Das Substrat wird entweder als festes Material oder als wässrige Lösung oder Suspension zugeführt. Die Gesamtmenge an Substrat wird entweder in einer Stufe, in zwei oder mehreren Zuführstufen oder kontinuierlich zugeführt.
• Die Biotransformationsphase startet mit dem Beginn der Substratzuführung und dauert etwa 5 bis 50 h, vorzugsweise 10 bis 30 h und ganz besonders bevorzugt 15 bis 25 h, nämlich bis das gesamte Substrat in das Produkt und die Nebenprodukte überführt ist.
• Es wird angenommen, dass eine Überschusskonzentration der zugeführten Ferulasäure hauptsächlich verantwortlich ist für die hohe volumetrische Ausbeute an Vanillin, wie nach dem beendeten Substratumsatz beobachtet wird. Außerdem wird auch angenommen, dass die Verfahrensbedingungen, die oben angegeben sind, verantwortlich sind für die Akkumulation oder Ansammlung des wertvollen Materials Guajakol.
• Nach der beendeten Biotransformationsphase wird die Biomasse aus der Fermentationsbrühe abgetrennt durch ein beliebiges gut bekanntes Verfahren, wie Zentrifugation oder Membranfiltration und dergleichen, um eine zellenfreie Fermentationsbrühe zu erhalten.
• Da die Biotransformation das hydrophile Substrat Ferulasäure in ziemlich hydrophobe Substanzen, wie Vanillin und Guajakol überführt, kann die gesamte volumetrische Produktivität des Fermentationssystems erhöht werden durch Anwendung von einem beliebigen in situ Produktgewinnungsverfahren. Für diesen Zweck kann z. B. eine Extraktionsphase zugegeben werden zu der Fermentationsbrühe unter Verwendung beispielsweise eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösemittels, eines Pflanzenöls oder eines beliebigen festen Extraktionsmittels, z. B. eines Harzes, vorzugsweise neutralen Harzes, wie Amberlite XAD 4 oder XAD 7 oder dergleichen. Eine solche in situ Produktgewinnungsmethode kann ein Fortsetzen der Bildung von Vanillin und Guajakol ermöglichen, auch nachdem die Wasserlöslichkeitskonzentrationen erreicht worden sind.
• Aus dieser Fermentationsbrühe können nun Vanillin und die Nebenprodukte selektiv durch zwei verschiedene Extraktionsverfahren extrahiert werden:
  Kontinuierliche Flüssig-Flüssig-Extraktion a) oder chargenweise Extraktion b) sind geeignet.
• a) Auf der Basis einer Extraktion, die abhängig ist von dem pH-Wert, kann eine wirksame Isolierung von Vanillin und auch von Guajakol durchgeführt werden. In einer ersten Stufe kann Guajakol extrahiert werden aus einer wässrigen Fermentationsbrühe. Für diese Stufe wird vorzugsweise ein Gegenstromextraktionsverfahren verwendet, vorzugsweise in einem Extraktor, mit Hilfe eines organischen wasserunlöslichen Lösemittels. Beispiele von solchen Lösemitteln sind Ester von C₁-C₃-Säuren mit C₁-C₄-Alkoholen, Ether, insbesondere Methyl-tert.-butylether (MTBE). Der pH liegt vorzugsweise zwischen 10 bis 11, insbesondere pH 10,8 bis 11. Vanillin wird danach extrahiert aus dem wässrigen Raffinat der Guajakolextraktion bei pH-Werten von etwa 5 bis 8, vorzugsweise etwa 6 bis etwa 7,5, besonders bevorzugt zwischen etwa 6,9 bis etwa 7,1. Bei Arbeiten mit Vanillinkonzentrationen von etwa 8 bis etwa 16 g/l arbeitet die Gegenstromextraktion am geeignetsten in einem Verhältnis von Zuführung/Lösemittel von etwa 2,5 bis 3:1, insbesondere etwa 2,6:1.
• b) Bei höheren Konzentrationen von Vanillin in der wässrigen Phase, z. B. nach einer Konzentration der Fermentationsbrühe mit Hilfe einer Wasserverdampfung, ist eine entsprechende zweistufige chargenweise Extraktion bei verschiedenen pH-Werten und mit den Lösemitteln, die oben vorgeschlagen wurden, geeignet und bevorzugt.
Die Vorteile des neuen Verfahrens können wie folgt zusammengefasst werden:
• (1) Fermentationsbedingungen sind verfügbar, welche die Akkumulation oder Sammlung von Vanillin in der Fermentationsbrühe von Streptomyces setonii zu wirtschaflich attraktiven Konzentrationen (etwa 8 bis 16 gl^–1) ermöglichen.
• (2) Das Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Herstellung von Vanillin und Guajakol, d. h. zwei Produkten von hohem Wert bei der natürlichen Aroma- oder Geschmacksherstellung.
• (3) Das Fermentationsverfahren ist von geringer technischer Komplexität und verwendet Rohmaterialien von leicht zugänglichen Quellen.
• Beispiel 1
• Eine Vorkultur oder Präkultur von Streptomyces setonii wurde in einem Schüttelkolben bei einem pH von 7,2, 37°C, 190 U/min 24 h lang gezüchtet. Das Schüttelkolbenmedium enthielt 5 gl^–1 Glucose, 4 gl^–1 Na₂HPO₄, 1 gl^–1 KH₂PO₄, 10 gl^–1 Hefeextrakt und 0,2 gl^–1 MgSO₄.
• Ein Bioreaktor wurde mit 10 l eines Mediums gefüllt, das 32 gl^–1 Glucose, 8 gl^–1 Hefeextrakt, 0,8 gl^–1 MgSO₄ und 0,2 gl^–1 Antischaummittel (Dow Corning AF 1520) enthielt. Nach einer thermischen Sterilisation wurde der Reaktor mit der zuvor gezüchteten Schüttelkolbenvorkultur geimpft. Die Menge an Impfkeimen, die verwendet wurde, betrug 3%. Die Verfahrensbedingungen waren 37°C, pH 7,2, Luftflussrate 1,0 vvm, 800 U/min. Nach 24 h Wachstumsphase wurde eine verbleibende Glucosekonzentration von 4,6 gl^–1 gemessen. Nachfolgend wurde der pH verschoben auf 8,5 unter Verwendung von NaOH (30%), und 24,5 h nach dem Impfen wurden 2,25 l einer 10% w/w Lösung an Ferulasäure in 0,5 M NaOH zu der Fermentationsbrühe gegeben. Zum Zeitpunkt der Zuführung war die Glucosekonzentration bei 4,0 gl^–1. 3 bis 4 h nach der Zugabe des Vorläufers wurde der Beginn der Biotransformation von Ferulasäure zu Vanillin beobachtet. 17 h nach der Vorläuferzuführung wurden Konzentrationen von 13,9 gl^–1 Vanillin und 0,4 gl^–1 Guajakol in der Fermentationsbrühe gemäß GC gemessen. Zu diesem Zeitpunkt war die Ferulasäure vollständig umgewandelt. Eine Ausbeute von Vanillin von 75 mol% wurde berechnet.
• Das Bioverfahren wurde dann beendet durch Pasteurisation bei 80°C über einen Zeitraum von 15 min. Die Fermentationsbrühe wurde mikrofiltriert (0,2 μm).
• Beispiel 2
• Ein 450 l Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 340 l wurde laufen gelassen gemäß dem Verfahren, das in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben ist.
• Nach einer Wachstumsperiode von 26,5 h wurde der pH verschoben auf 8,5, und eine erste Ferulasäurezuführung, die 4,08 kg betrug, wurde ausgeführt gemäß Beispiel 1. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine verbleibende Konzentration von 7,5 gl^–1 Glucose gemessen. Eine Stunde später wurden weitere 3,57 kg an Vorläufer zugeführt. Die Gesamtmenge an Ferulasäurezugabe betrug 22,5 gl^–1. 25,5 h nach der ersten Vorläuferzuführung wurde eine Vanillinkonzentration von 9,0 gl^–1 gemessen. Die Ferulasäurekonzentration betrug nun 1,75 gl^–1. Eine Ausbeute von Vanillin von 51 mol% wurde erhalten.
• Beispiel 3
• Flüssig-Flüssig-Gegenstromextraktion von Vanillin und Guajakol im technischen Maßstab.
• 7930 kg einer zellfreien membranfiltrierten Fermentationsbrühe, die 7,1 gl^–1 Vanillin und 0,35 gl^–1 Guajakol enthielt, wurde auf einen pH von 11 eingestellt mit NaOH und zuerst extrahiert mit MTBE als Lösemittel in einem gerührten Kammergegenstromextraktor, um das Guajakol zu trennen. Nach einer MTBE-Verdampfung wurden 8 kg Rohextrakt, der MTBE und 33% w/w Guajakol enthielt, gewonnen. Der pH des wässrigen Raffinats dieser alkalischen Extraktion wurde dann verschoben auf 6,9 bis 7,1 mit Chlorwasserstoffsäure und wieder extrahiert mit MTBE in dem gleichen Extraktor, um das Vanillin zu trennen. Aus dieser zweiten Extraktionsstufe wurden 150 kg eines Rohextrakts, der MTBE und 37% w/w Vanillin enthielt, erhalten.
• Die Figur zeigt:
  Einen typischen Chart einer Vanillinherstellungscharge im 10 l Maßstab.
• Δ Vanillinkonzentration [gl^–1]; -∇-Ferulasäurekonzentration [gl^–1]; x Guajakolkonzentration [gl^–1]; -o-pH-Wert; -☐-pO₂-Wert [%]; -x-Glucosekonzentration [gl^–1]. Nach einer 24 h Wachstumsphase wird der pH eingestellt auf 8,5, bevor die Ferulasäure zugeführt wurde. 3 bis 4 h nach der Substratzugabe wurde eine geringe Menge von Vanillin detektiert. Eine Vanillinkonzentration von 13,9 gl^–1 wurde erreicht nach insgesamt 41 h an Fermentation (17 h nach der Ferulasäurezuführung). Zu diesem Zeitpunkt wurde eine Guajakolkonzentration von 0,38 gl^–1 gemessen. Eine Herstellungsrate von 1,10 gl^–1h^–1 Vanillin bzw. 0,04 gl^–1h^–1 für Guajakol wurden berechnet. Nach einer vollständigen Umsetzung von Ferulasäure wurde eine Abnahme der Konzentrationen von Vanillin und Guajakol beobachtet. Quantitative Messungen wurden ausgeführt durch HPLC und GC.

Claims (16)

1. Verfahren zur Herstellung von Vanillin, umfassend: a) Kultivieren eines Bakteriums, das zu Streptomyces setonii gehört, in einem geeigneten Medium über einen Zeitraum von 5 bis 40 Stunden, um eine Fermentationsbrühe zu bilden, und nachfolgend Verschieben des pH der Fermentationsbrühe auf einen pH von etwa 8,5, b) Zugeben des Substrats Ferulasäure zu der Fermentationsbrühe, um eine Konzentration von Ferulasäure von etwa 5 gl^–1 bis etwa 40 gl^–1 zu ergeben, Erzeugen von Vanillin als Hauptreaktionsprodukt der Biotransformation von Ferulasäure, wobei diese Biotransformation 5 bis 50 Stunden lang dauert, Trennen der Biomasse von der Fermentationsbrühe, und c) Extrahieren des Vanillins und, wenn gewünscht, des Nebenprodukts Guajakol aus der Fermentationsbrühe.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Bakterium Streptomyces setonii ATCC 39116 ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei in der Stufe b) eine Fermentationsbrühe gebildet wird, die eine Konzentration von Ferulasäure von 15 bis 30 gl^–1 aufweist.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei in der Stufe b) eine Fermentationsbrühe gebildet wird, die eine Konzentration von Ferulasäure von 20 gl^–1 bis 25 gl^–1 aufweist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Ferulasäure nach der Beendigung der Wachstumsphase zugegeben wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Kulturmedium Glucose umfasst, vorzugsweise in einer Konzentration von 5 bis 50 gl^–1, besonders bevorzugt von 20 bis 35 gl^–1.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Medium einen Hefeextrakt umfasst, vorzugsweise in einer Konzentration von bis zu 20 gl^–1, besonders bevorzugt von 5 bis 10 gl^–1.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Medium Magnesiumionen umfasst, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 5 gl^–1, besonders bevorzugt von 0,5 bis 1 gl^–1.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Stufe a) durchgeführt wird bei einem pH von 7 bis 9.
10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren bei 30 bis 45°C ausgeführt wird.
11. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren unter Belüftung durchgeführt wird.
12. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren ein Rühren umfasst.
13. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Biotransformation 10 bis 30 Stunden dauert, besonders bevorzugt 15 bis 25 Stunden.
14. Verfahren nach einem beliebigen der vorstehenden Ansprüche, wobei in der Stufe c) das Guajakol zuerst durch Erhöhen des pH der Fermentationsbrühe auf > 9 und unter Verwendung eines organischen Lösemittels extrahiert wird.
15. Verfahren nach einem beliebigen der vorstehenden Anspruche, wobei nach der Biotransformation der pH der Fermentationsbrühe nachfolgend auf einen Wert von etwa 7 gebracht wird und das Vanillin mit Hilfe eines organischen Lösemittels extrahiert wird.
16. Verfahren nach einem beliebigen der vorstehenden Ansprüche, wobei Methyl-tert.-butylether das Extraktionslösemittel ist.