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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur
Herstellung von Vanillin aus Ferulasäure. Gemäß diesem Verfahren wird eine
Kultur, vorzugsweise eine untergetauchte oder überschwemmte Kultur, von einem
beliebigen Bakterium der Ordnung Actinomycetales, vorzugsweise der
Familie Streptomycetaceae mit dem Substrat Ferulasäure inkubiert,
um fermentativ Vanillin zu erzeugen. Das Produkt Vanillin wird aus
der Fermentationsbrühe
gewonnen durch ein ausgelegtes Extraktionsverfahren, das auch die
Trennung und Gewinnung von wertvollen Fermentationsnebenprodukten
ermöglicht,
um das analytisch und sensorisch gereinigte Produkt Vanillin zu
erhalten, und insbesondere das Nebenprodukt Guajakol.
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Bei
der Verwendung von Aroma- oder Geschmacksverbindungen, ist es immer
wichtiger, dass die Aroma- oder Geschmacksverbindungen als „natürlich" bezeichnet werden
können.
Gemäß den europäischen und US-Regulierungen
bedeutet dies, dass die Verbindung erhalten werden muss durch physikalische,
enzymatische oder mikrobiologische Verfahren und nur aus Materialien
von pflanzlicher oder tierischer Herkunft. Zahlreiche Forschungsaktivitäten während der
letzten Dekade waren daher fokussiert auf die Verwendung von erneuerbaren,
billigen und natürlichen
Rohmaterialquellen für
die fermentative Herstellung von Vanillin. In Publikationen und
in Patenten wurde jedoch bisher nur sehr selten von kommerziell
attraktiven volumetrischen oder ausgiebigen Ausbeuten berichtet.
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Guajakol
ist ein phenolisches Molekül
von einem rauchigen Typ, das signifikant zu dem charakteristischen
Aroma oder Geschmack von Vanilleextrakten beiträgt. Es wird daher oft in Kombination
mit Vanillin für Aromen
oder Geschmäcker
vom Vanillintyp verwendet. Die fermentative Herstellung von natürlichem
Guajakol wurde jedoch bisher noch nicht beschrieben.
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In
den letzten 10 Jahren wurden mehrere Patentanmeldungen angemeldet,
die die mikrobielle oder enzymatische Herstellung von Vanillin betreffen.
Im Allgemeinen wird ein geeigneter Vorläufer in Vanillin transformiert
durch einen Mikroorganismus oder ein Enzym. Vorgeschlagene Vorläufer sind
Eugenol, Isoeugenol, Ferulasäure,
Curcumin oder Benzoe-Siam-Harze. In der Regel sind die Transformationsausbeuten
extrem gering. Beispiele sind z.B. Haarman & Reimer (
EP 0 405 197 A1 ), die eine
Herstellung von 18 mgL
–1 beanspruchen, ausgehend
von 0,2 gL
–1 Eugenol
unter Verwendung der Mikroorganismen Serratia, Klebsiella oder Enterobacter.
Diese Transformation benötigt
außerdem
13 Tage. Pernod-Ricard
(
EP 0 453 368 A )
beanspruchen 46 mgL
–1 Vanillin, das erhalten
wird in 6 Tagen durch Pycnoporus Fermentation aus Ferulasäure. In
dieser Reihe beanspruchen auch Kraft General Foods (
US 5 128 253 ) 210 mgL
–1 Vanillin
aus Ferulasäure
innerhalb von 54 Tagen. Um diesen Titer zu erhalten, musste ein
Reduktionsmittel zugegeben werden, da ansonsten die Bildung von
Vanillin nicht stattfinden würde
und nur Vanillinsäure
gebildet werden würde.
Die WO 96/08576 A beschreibt ein Verfahren zum Erhalt von Vanillinsäure durch
Bioumsetzung von Ferulasäure.
Takasago (JP 227890/1993) stellte Mutanten von Pseudomonas-Stämmen her,
die blockiert sind im Abbauweg von Vanillin. Daher konnte ausgehend
von 1 gL
–1 Ferulasäure 0,28
gL
–1 Vanillin
erhalten werden. Die bislang einzige Anwendung, die ökonomisch
attraktive volumetrische oder ausgiebige Ausbeuten von Vanillin
in einem Fermentationsverfahren berichtet, wurde veröffentlicht
von Haarman & Reimer
(
EP 0 761 817 A2 ).
Sie identifizierten zwei Stämme
der Gattung Amycolatopsis, die in der Lage sind, Vanillin zu akkumulieren
bis zu einer Konzentration von 11,5 gL
–1 in
der Fermentationsbrühe
nach dem Zuführen
oder Füttern
von Ferulasäure.
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Schließlich kann
festgestellt werden, dass große
Mengen an Vanillin nicht leicht gebildet werden in mikrobiellen
Systemen. Dies liegt hauptsächlich
an der zellulären
Toxizität
von Vanillin, die bei Kon zentrationen oberhalb von 1 gL
–1 das
Wachstum der Vanillin erzeugenden Mikroorganismen verhindert. In
mikrobiellen Systemen wird in der Regel der jeweilige Alkohol oder
die jeweilige Säure
gefunden und nicht Vanillin. Dieser toxische Effekt oder diese toxische
Wirkung von Vanillin wurde überwunden
durch die Verwendung von Enzymen (Quest,
EP 0 542 348 A2 ). Ein Behandeln
von Isoeugenol mit Lipoxygenase führte zu 10 bis 15 gL
–1 Vanillin mit
einer Ausbeute von 10 bis 15%. Viel geringere Konzentrationen wurden
erhalten, wenn Eugenol (0,3 bis 0,5 gL
–1 in
einer Ausbeute von 0,3 bis 0,5%) verwendet wurde, und von Ferulasäure wird
kein Umsatz berichtet. Das Verfahren, das Lipoxygenase einsetzt,
ist kaum attraktiv unter dem ökonomischen
Gesichtspunkt.
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Eine
weitere Maßnahme,
um die Toxizität
dieser Verbindung zu umgehen, ist die mikrobielle Herstellung von
Coniferylaldehyd, das Vanillin bildet bei einer thermischen Behandlung,
s. BASF (Offenlegungsschrift,
DE 36 04 874 A ). Ähnlich ist aus das immobilisierte
Zellsystem, wie es beschrieben ist in der aktuellen Orsan Patentanmeldung
(WO 96134971), in der Vanillin akkumuliert wird bis zu einer Konzentration
von 1 gL
–1.
Ein möglicher ökonomischer
Nutzen der Verwendung von immobilisierter Biomasse wird verursacht
durch das Recycling oder Wiedergewinnen des Biokatalysators.
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Viele
Veröffentlichungen
behandeln den jeweiligen metabolischen Weg oder Stoffwechselablauf
ausgehend von Eugenol, Isoeugenol oder Ferulasäure. Im Allgemeinen wird Vanillin
für eine
Zwischenverbindung gehalten im Abbauweg dieser Verbindungen. Zwei
Veröffentlichungen
können
zitiert werden, welche die Rolle von Vanillin bei dem Abbau von
Ferulasäure
zeigen. Toms and Wood, Biochemistry 9 (1970) 337–343, kultivierten Pseudomonas
sp. auf Ferulasäure
und klärten
den Abbauweg auf. Obwohl Vanillin nicht in dem Kulturüberstand
gefunden wurde, gab es einen Beweis dafür, dass Vanillin eine Zwischenverbindung
ist, da Vanillinsäure
nachgewiesen werden konnte. Ausgehend von Ferulasäure wurde
Vanillin in Kulturen von Streptomyces setonii (Sutherland et al.,
Can. J. Microbiol. 29 (1983) 1253 bis 1257) erhalten. Kein Hinweis
wurde gegeben hinsichtlich der Menge, aber es wurden nur Spuren
gefunden als das Experiment wiederholt wurde.
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Ferulasäure als
ein Substrat für
Biotransformationen ist reichlich erhältlich aus verschiedenen natürlichen
Quellen. Die Säure
tritt oft in der Form eines Glucosids in Pflanzenmaterialien, wie
Holz, Zuckerrübenmelasse,
Kleie von Mais, Reis und anderen Typen von Gräsern, auf. Sie kann aus den
entsprechenden Glycosiden in diesen Produkten isoliert werden durch
gut bekannte Hydrolyseverfahren, z.B. unter Verwendung von Enzymen,
und kann als Rohmaterial oder gereinigtes Material verwendet werden.
Eine britische Quelle (
GB
2 301 103 A1 ) beschreibt z.B. den enzymatischen Abbau von
Ferulasäure
enthaltendem Pflanzenmaterial durch eine Ferulasäureesterase, um die freie Säure zu erhalten.
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Die
vorliegende Erfindung ist in den beigefügten Ansprüchen definiert.
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Das
vorliegende neue mikrobiologische Verfahren mit hoher Ausbeute für die Herstellung
oder Erzeugung von Vanillin umfasst ein Kultivieren eines Mikroorganismus
der Gattung Streptomyces (Ordnung der Actinomycetales, Familie Streptomycetaceae),
vorzugsweise des Bakteriums Streptomyces setonii, zuerst in einer
Nährbrühe, wobei
vorzugsweise die Kultivierungsdauer etwa 5 bis 40 Stunden beträgt und andauert
bis die Kohlenstoffquelle Glucose (fast) verbraucht ist, dann ein
Zugeben des Substrats Ferulasäure
in dem Bereich von etwa 5 bis 40 gL–1 der
Fermentationsbrühe,
entweder kontinuierlich oder chargenweise (Batchverfahren). Nach
einem ungefähren
Inkubations (Biotransformations) zeitraum von etwa 5 bis 50 Stunden
wird die Substratumsetzung in Vanillin und mehrere Nebenprodukte
vervollständigt.
Die Ferulasäure
wird verbraucht, und Vanillin wird akkumuliert bis zu etwa 8 bis
16 gL–1 in
der Fermentationsbrühe.
Typische Nebenprodukte der Ferulasäurebiotransformation sind Vanillinalkohol,
Vanillinsäure,
Guajakol, para-Vinylguajakol und 2-Methoxy-4-ethylphenol.
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Eine
nachfolgende Produktgewinnung besteht aus der Entfernung der Biomasse,
geeigneterweise gefolgt von einer Zweistufenextraktion mit einem
geeigneten organischen Lösemittel,
vorzugsweise Methyl-tert.-butylether. Eine erste Extraktion wird
ausgeführt
bei einem pH > von
etwa 9, vorzugsweise bei einem pH von 10 bis etwa 11 in der wässrigen
Phase, um selektiv Nebenprodukte zu extrahieren, wie das sensorisch hochwirksame
Guajakol. Dann wird das wässrige
Raffinat „angesäuert" bis auf neutrale
pH Werte, um selektiv das Produkt Vanillin zu extrahieren. Eine
Reinigung des rohen Vanillinextrakts kann schließlich durchgeführt werden
durch Anwendung bekannter Umkristallisationsverfahren. Guajakol
kann aus dem Rohextrakt durch Destillation gereinigt werden.
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Das
mikrobiologische Verfahren und das Extraktionsverfahren, die beschrieben
sind, sind nützlich
für eine ökonomisch
attraktive Herstellung von natürlichem
Vanillin sowie von Nebenprodukten aus Ferulasäure gemäß dem folgenden biochemischen
Weg: Weg
des Ferulasäureabbaus,
z.B. durch Streptomyces setonii
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Das
erhaltene Vanillin (Verbindung 2) sowie das Nebenprodukt Guajakol
(Verbindung 3) sind beides bekannte Aroma- oder Geschmacks- und
Duftverbindungen. Ihre Verwendung und Anwendung sind dem Fachmann
bekannt. Durch Verwendung wirksamer und ausgeglichener Mengen dieser
Verbindungen ist es möglich,
die organoleptischen Eigenschaften von aromatisierten Verbrauchsgütern, wie
Getränken,
Molkereiprodukten, Bäckerei-
oder Backwaren, Eiscreme und dergleichen zu verbessern oder zu erweitern
oder steigern. Fermentativ hergestelltes Vanillin und Guajakol sind
insbesondere wertvoll in beliebigen Zusammensetzungen vom Vanilletyp
und Fruchtaromen oder Fruchtgeschmäckern, wobei nur natürliche Inhaltsstoffe
benötigt
werden.
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Wie
oben dargelegt, wurden nun exakte Fermentationsbedingungen, kombiniert
mit einem wirksamen Produktgewinnungsverfahren, entdeckt, um eine
Herstellung mit hoher Ausbeute von sensorisch und analytisch gereinigtem
Vanillin zu ermöglichen
sowie die Aroma- oder Geschmacksverbindung Guajakol als Nebenprodukt
mit großer
Wirkung zu erhalten. Diese Bedingungen basieren auf der Kultivierung
des Bakteriums der Gattung Streptomyces in einem geeignetem Kulturmedium
oder Nährboden
und der nachfolgenden Zugabe des Substrats Ferulasäure in Überschusskonzentrationen,
d.h. ca. 5 bis ca. 40 g/l, um Vanillin in hohen volumetrischen Ausbeuten
in der Fermentationsbrühe
zu erhalten.
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Am
meisten geeignet ist, wie oben dargelegt, die Spezies Streptomyces
setonii, vorzugsweise der kommerziell erhältliche Stamm ATCC 39116.
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Das
Substrat Ferulasäure
ist durch die Formel (1) definiert. Gemäß dem neuen Verfahren wird
ein Ferulasäurematerial
mit einem Ferulasäuregehalt
von vorzugsweise mehr als 10% als Substrat verwendet. Die Natur
der verbleibenden Verbindungen ist abhängig von der Quelle oder dem
Ursprung.
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Bei
der Ausführung
der vorliegenden Erfindung wird das Kultivieren des Bakteriums ausgeführt in einem
wässrigen
Medium oder Nährboden
in Gegenwart von üblichen
Nährstoffsubstanzen.
Ein geeignetes Kulturmedium enthält
eine Kohlenstoffquelle, eine organische oder anorganische Stickstoffquelle,
anorganische Salze und Wachstumsfaktoren.
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Für das Kulturmedium
wird vorzugsweise Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet, z.B.
in einer Konzentration von etwa 5 bis 50 gL–1,
vorzugsweise etwa 20 bis 35 gL–1. Ein Hefeextrakt ist
eine brauchbarere Quelle für
Stickstoff, Phosphate, Wachstumsfaktoren und Spurenelemente können zugegeben
werden, z.B. bei einer bevorzugten Konzentration von etwa 2 bis
20 gL–1,
am meisten bevorzugt etwa 5 bis 10 gL–1.
Außerdem
können
Magnesiumionen, z.B. Magnesiumsulfat, in einer Konzentration von
etwa 0,1 bis 5 gL–1, vorzugsweise bei
etwa 0,5 bis 1 gL–1, zugegeben werden.
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Die
Kulturbrühe
wird hergestellt und in einem Bioreaktor sterilisiert und wird dann
geimpft mit einem Streptomycesstamm, um die Wachstumsphase zu starten
oder initiieren. Eine geeignete Dauer der Wachstumsphase beträgt etwa
5 bis 40 h, vorzugsweise 15 bis 35 h, und am meisten bevorzugt etwa
20 bis 30 h.
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Spezifikationen
von weiteren Verfahrensbedingungen sind:
| pH-Bereiche: | etwa
7 bis etwa 9 |
| Temperaturbereich: | etwa
30 bis etwa 45 °C |
| Luftzufuhr: | bevorzugt
für dieses
aerobe Verfahren |
| Rühren: | ist
bevorzugt. |
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Nach
der Beendigung der Wachstumsphase wird das Substrat Ferulasäure der
Kultur zugeführt.
Eine geeignete Menge an Substratzuführung beträgt 5 bis 40 gL–1 der
Fermentationsbrühe,
vorzugsweise etwa 15 bis 30 gL–1, am meisten bevorzugt
20 bis 25 gL–1.
Das Substrat wird entweder als festes Material oder als wässrige Lösung oder
Suspension zugeführt.
Die Gesamtmenge an Substrat wird entweder in einer Stufe, in zwei oder
mehreren Zuführstufen
oder kontinuierlich zugeführt.
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Die
Biotransformationsphase startet mit dem Beginn der Substratzuführung und
dauert etwa 5 bis 50 h, vorzugsweise 10 bis 30 h und ganz besonders
bevorzugt 15 bis 25 h, nämlich
bis das gesamte Substrat in das Produkt und die Nebenprodukte überführt ist.
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Es
wird angenommen, dass eine Überschusskonzentration
der zugeführten
Ferulasäure
hauptsächlich
verantwortlich ist für
die hohe volumetrische Ausbeute an Vanillin, wie beobachtet nach
dem beendeten Substratumsatz. Außerdem wird auch angenommen,
dass die Verfahrensbedingungen, die oben angegeben sind, verantwortlich
sind für
die Akkumulation oder Ansammlung des wertvollen Materials Guajakol.
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Nach
der beendeten Biotransformationsphase wird die Biomasse aus der
Fermentationsbrühe
abgetrennt durch ein beliebiges gut bekanntes Verfahren, wie Zentrifugation
oder Membranfiltration und dergleichen, um eine zellenfreie Fermentationsbrühe zu erhalten.
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Da
die Biotransformation das hydrophile Substrat Ferulasäure in ziemlich
hydrophobe Substanzen, wie Vanillin und Guajakol überführt, kann
die gesamte volumetrische Produktivität des Fermentationssystems erhöht werden
durch Anwendung von einem beliebigen in situ Produktgewinnungsverfahren.
Für diesen Zweck
kann z.B. eine Extraktionsphase zugegeben werden zu der Fermentationsbrühe unter
Verwendung eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösemittels,
eines Pflanzenöls
oder eines beliebigen festen Extraktionsmittels, z.B. eines Harzes,
vorzugsweise neutralen Harzes, wie Amberlite XAD 4 oder XAD 7 oder
dergleichen. Eine solche in situ Produktgewinnungsmethode kann ein
Fortsetzen der Bildung von Vanillin und Guajakol ermöglichen
auch nachdem die Wasserlöslichkeitskonzentrationen
erreicht worden sind.
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Aus
dieser Fermentationsbrühe
können
nun Vanillin und die Nebenprodukte selektiv durch zwei verschiedene
Extraktionsverfahren extrahiert werden:
Kontinuierliche flüssig-flüssig Extraktion
a) oder chargenweise Extraktion b) sind geeignet.
- a)
Auf der Basis einer Extraktion, die abhängig ist von dem pH-Wert, kann
eine wirksame Isolierung von Vanillin und auch von Guajakol durchgeführt werden.
In einer ersten Stufe kann Guajakol extrahiert werden aus einer
wässrigen
Fermentationsbrühe.
Für diese
Stufe wird vorzugsweise ein Gegenstromextraktionsverfahren verwendet,
vorzugsweise in einem Extraktor, mit Hilfe eines organischen wasserunlöslichen
Lösemittels.
Beispiele von solchen Lösemitteln
sind Ester von C1-C3-Säuren mit
C1-C4-Alkoholen,
Ether, insbesondere Methyl-tert.-butylether (MTBE). Der pH liegt
vorzugsweise zwischen 10 bis 11, insbesondere pH 10,8 bis 11.
Vanillin
wird danach extrahiert aus dem wässrigen
Raffinat der Guajakolextraktion bei pH-Werten von etwa 5 bis 8,
vorzugsweise etwa 6 bis etwa 7,5, besonders bevorzugt zwischen etwa
6,9 bis etwa 7,1. Ein Arbeiten mit Vanillinkonzentrationen von etwa
8 bis etwa 16 g/l, die Gegenstromextraktion arbeitet am geeignetsten
in einem Verhältnis
von Zuführung/Lösemittel
von etwa 2,5 bis 3:1, insbesondere etwa 2,6:1.
- b) Bei höheren
Konzentrationen von Vanillin in der wässrigen Phase, z.B. nach einer
Konzentration der Fermentationsbrühe mit Hilfe einer Wasserverdampfung,
ist eine entsprechende zweistufige chargenweise Extraktion bei verschiedenen
pH-Werten und mit den Lösemitteln,
die oben vorgeschlagen wurden, geeignet und bevorzugt.
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Die
Vorteile des neuen Verfahrens können
wie folgt zusammengefasst werden:
- (1) Fermentationsbedingungen
sind verfügbar,
welche die Akkumulation oder Sammlung von Vanillin in der Fermentationsbrühe von Streptomyces,
z.B. S. setonii, zu wirtschaflich attraktiven Konzentrationen (etwa 8
bis 16 gL–1)
ermöglichen.
- (2) Das Verfahren ermöglicht
die gleichzeitige Herstellung von Vanillin und Guajakol, d.h. zwei
Produkten von hohem Wert bei der natürlichen Aroma- oder Geschmacksherstellung.
- (3) Das Fermentationsverfahren ist von geringer technischer
Komplexität
und verwendet Rohmaterialien von leicht zugänglichen Quellen.
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Schließlich betrifft
die Erfindung auch das neue Verfahren zur Herstellung von Vanillin
aber anstatt der Verwendung von Streptomyces setonii ATCC 39116,
seiner Enzyme oder beliebigen rekombinanten Mikroorganismen, z.B.
Hefe, die das genetische Material enthaften, das für die Enzyme
kodiert, die relevant sind oder verknüpft sind mit der zellulären Biosynthese
von Vanillin und/oder Guajakol und daher nicht den Mikroorganismen
als solches.
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Beispiel 1
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250
ml Schüttelkolben,
enthaltend 50 ml des folgenden Mediums, wurden zubereitet: 103 gL–1 Saccharose,
4 gL–1 Na2HPO4, 1 gL–1 KH2PO4, 1 gL–1 Hefeextrakt,
0,2 gL–1 NaCl,
0,2 gL–1 MgSO4 und 0,05 gL–1 CaCl2. Der pH wurde auf 7,2 eingestellt unter
Verwendung von NaOH. Ein Schüttelkolben
wurde geimpft mit 2 ml an Vorkultur von Streptomyces setonii ATCC
39116 und bei 37°C,
190 U/min, 16 h lang kultiviert. Am Ende der Wachstumsphase wurden
0,3 g Ferulasäure
(erworben von Aldrich, Katalog Nr. 12.870-8, 99%) zu der Kultur gegeben.
Zu diesem Zweck wurde eine 10% w/w Lösung des Säuresubstrats in 0,5 M NaOH
(End-pH der Lösung
betrug etwa 7,2) zuvor hergestellt und steril filtriert. Der Kolben
wurde wieder bei 37°C,
190 U/min inkubiert. Nach 31,5 h der Biotransformation (Inkubation)
wurde eine Vanillinkonzentration von 3,10 gL–1 (HPLC) erreicht.
Eine molekulare Ausbeute von 66 mol% wurde berechnet.
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Beispiel 2
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Ein
250 ml Schüttelkolben
wurde hergestellt und inkubiert wie in Beispiel 1. Nach einer 16
Stunden langen Wachstumsphase wurden 0,6 g Ferulasäure (als
eine 10% w/w Lösung
in 0,5 M NaOH) zu der Kultur gegeben. Der Kolben wurde wieder bei
37°C und
190 U/min inkubiert. Nach 78 h der Biotransformation (Inkubation)
wurde eine Vanillinkonzentration von 5,94 gL–1 (HPLC)
erreicht, was einer Ausbeute von 63 mol% entsprach.
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Beispiel 3
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Ein
250 ml Schüttelkolben
wurde wie in Beispiel 1 zubereitet und inkubiert. Nach einer 18
Stunden langen Wachstumsphase wurden 0,3 g Ferulasäure (als
eine 10% w/w Lösung
in 0,5 M NaOH) zu der Kultur gegeben. Der Kolben wurde wieder bei
37°C mit
190 U/min inkubiert. Nach 28 h erfolgte eine zweite Zuführung von
0,3 g Ferulasäure.
Am Ende der Inkubation (58 h) wurde eine Vanillinkonzentration von
6,41 gL–1 erreicht, die
einer Ausbeute von 68 mol% entsprach.
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Beispiel 4
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Eine
Vorkultur oder Präkultur
von Streptomyces setonii wurde in einem Schüttelkolben bei einem pH von
7,2, 37 °C,
190 U/min 24 h lang gezüchtet.
Das Schüttelkolbenmedium
enthielt 5 gL–1 Glucose,
4 gL–1 Na2HPO4, 1 gL–1 KH2PO4, 10 gL–1 Hefeextrakt
und 0,2 gL–1 MgSO4.
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Ein
Bioreaktor wurde mit 10 l eines Mediums gefüllt, das 32 gL–1 Glucose,
8 gL–1 Hefeextrakt,
0,8 gL–1 MgSO4 und 0,2 gL–1 Antischaummittel
(Dow Corning AF 1520) enthielt. Nach einer thermischen Sterilisation wurde
der Reaktor mit der zuvor gezüchteten
Schüttelkolbenvorkultur
geimpft. Die Menge an Impfkeimen, die verwendet wurde, betrug 3%.
Die Verfahrensbedingungen waren 37 °C, pH 7,2, Luftflussrate 1,0
vvm, 800 U/min. Nach 24 h Wachstumsphase wurde eine verbleibende
Glucosekonzentrati on von 4,6 gL–1 gemessen. Nachfolgend
wurde der pH verschoben auf 8,5 unter Verwendung von NaOH (30%),
und 24,5 h nach dem Impfen wurden 2,25 l einer 10% w/w Lösung an
Ferulasäure
in 0,5 M NaOH zu der Fermentationsbrühe gegeben. Zum Zeitpunkt der
Zuführung
war die Glucosekonzentration bei 4,0 gL–1.
3 bis 4 h nach der Zugabe des Vorläufers wurde der Beginn der
Biotransformation von Ferulasäure
zu Vanillin beobachtet. 17 h nach der Vorläuferzuführung wurden Konzentrationen
von 13,9 gL–1 Vanillin
und 0,4 gL–1 Guajakol
in der Fermentationsbrühe
gemäß GC gemessen.
Zu diesem Zeitpunkt war die Ferulasäure vollständig überführt. Eine Ausbeute von Vanillin
von 75 mol% wurde berechnet.
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Das
Bioverfahren wurde dann beendet durch Pasteurisation bei 80 °C über einen
Zeitraum von 15 min. Die Fermentationsbrühe wurde mikrofiltriert (0,2 μm).
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Beispiel 5
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Ein
450 l Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 340 l wurde laufen
gelassen gemäß dem Verfahren, das
in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben ist.
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Nach
einer Wachstumsperiode von 26,5 h wurde der pH verschoben auf 8,5,
und eine erste Ferulasäurezuführung, die
4,08 kg betrug, wurde ausgeführt
gemäß Beispiel
4. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine verbleibende Konzentration von
7,5 gL–1 Glucose
gemessen. Eine Stunde später
wurden weitere 3,57 kg an Vorläufer
zugeführt.
Die Gesamtmenge an Ferulasäurezugabe
betrug 22,5 gL–1. 25,5 h nach der ersten
Vorläuferzuführung wurde
eine Vanillinkonzentration von 9,0 gL–1 gemessen.
Die Ferulasäurekonzentration
betrug nun 1,75 gL–1. Eine Ausbeute von
Vanillin von 51 mol% wurde erhalten.
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Beispiel 6
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Flüssig-flüssig Gegenstromextraktion
von Vanillin und Guajakol im technischen Maßstab.
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7930
kg einer zellfreien membranfiltrierten Fermentationsbrühe, die
7,1 gL–1 Vanillin
und 0,35 gL–1 Guajakol
enthielt, wurde auf einen pH von 11 eingestellt mit NaOH und zuerst
extrahiert mit MTBE als Lösemittel in
einem gerührten
Kammergegenstromextraktor, um das Guajakol zu trennen. Nach einer
MTBE Verdampfung wurden 8 kg Rohextrakt, der MTBE und 33% w/w Guajakol
enthielt, gewonnen. Der pH des wässrigen Raffinats
dieser alkalischen Extraktion wurde dann verschoben auf 6,9 bis
7,1 mit Chlorwasserstoffsäure
und wieder extrahiert mit MTBE in dem gleichen Extraktor, um das
Vanillin zu trennen. Aus dieser zweiten Extraktionsstufe wurden
150 kg eines Rohextrakts, der MTBE und 37% w/w Vanillin enthielt,
erhalten.
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Die
Figur zeigt:
Einen typischen Chart einer Vanillinherstellungscharge
im 10 l Maßstab.
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Δ Vanillinkonzentration
[gL–1];
-∇-Ferulasäurekonzentration
[gL–1];
x Guajakolkonzentration [gL–1]; -o- pH-Wert; -⧠-
pO2-Wert [%]; -x- Glucosekonzentration [gL–1].
Nach einer 24 h Wachstumsphase wird der pH eingestellt auf 8,5,
bevor die Ferulasäure
zugeführt
wurde. 3 bis 4 h nach der Substratzugabe wurde eine geringe Menge
von Vanillin detektiert. Eine Vanillinkonzentration von 13,9 gL–1 wurde
erreicht nach insgesamt 41 h an Fermentation (17 h nach der Ferulasäurezuführung).
Zu diesem Zeitpunkt wurde eine Guajakolkonzentration von 0,38 gL–1 gemessen.
Eine Herstellungsrate von 1,10 gL–1 h–1 Vanillin
und 0,04 gL–1 h–1 für Guajakol
wurden jeweils berechnet. Nach einer vollständigen Umsetzung von Ferulasäure wurde
eine Abnahme in den Konzentrationen von Vanillin und Guajakol beobachtet.
Quantitative Messungen wurden ausgeführt durch HPLC und GC.
