JPH1169990A - バニリンの製造法 - Google Patents

バニリンの製造法

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JPH1169990A
JPH1169990A JP10170406A JP17040698A JPH1169990A JP H1169990 A JPH1169990 A JP H1169990A JP 10170406 A JP10170406 A JP 10170406A JP 17040698 A JP17040698 A JP 17040698A JP H1169990 A JPH1169990 A JP H1169990A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 発酵法で、香料として有用なバニリン及びグ
アイアコールを経済的に魅力ある方法で生産する。 【解決手段】 a)Actinomycetales 目、好ましくはStre
ptomycetaceae 科、特に好ましくはStreptomyces seton
iiに属する細菌を栄養素培養液中で培養し、 b)基質フェルラ酸を、その栄養素培養液に発酵液中濃度
が約5g/Lから約40g/Lになるよう添加し、フェルラ酸の
生物変換の主反応生成物としてバニリンを生成させ、し
かる後、バイオマスを発酵液から分離し、 c)生成したバニリンを、また必要に応じて副生物のグア
イアコールを、MTBEを抽出溶媒として、pH調整された発
酵液から抽出する、 各工程を含む方法でバニリン及びグアイアコールを生産
する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はフェルラ酸から微生
物学的方法でバニリンを製造する方法に関する。本発明
の方法は、Actinomycetales 目の細菌、好ましくはStre
ptomycetaceae 科細菌の培養液、好ましくは深部培養液
を、フェルラ酸基質と共にインキュベートし、発酵によ
りバニリンを製造することを特徴としている。生成物の
バニリンは、分析的にも官能的にも精製された製品バニ
リン並びに価値ある発酵副生物、特に副生グアイアコー
ル、に分離して回収が可能なように設計された抽出法に
より、発酵液から回収される。
【０００２】
【従来の技術】芳香性化合物の使用において、芳香性化
合物が”天然物”として設計されることがますます重要
になってきている。このことは、ヨーロッパ及び米国規
制では、芳香性化合物は物理的、酵素的又は微生物学的
方法で、また、植物及び動物起源の材料から得られなけ
ればならないことを意味している。ここ１０年間の多様
な研究動向を概観すると、再生産可能で、廉価な天然原
料を用いて、発酵によりバニリンを製造することに焦点
があてられている。しかしながら、今までの刊行物及び
特許では、商業的に魅力ある方法での大量生産は、ほと
んど報告されていない。グアイアコールはフェノール性
スモーキー分子で、バニリン抽出物特有の香りに著しく
寄与している。そのため、しばしば、バニラ型香料でバ
ニリンと組み合わせて使用されている。しかしながら、
天然グアイアコールの発酵製造は、いまだ報告されてい
ない。
【０００３】ここ１０年間で、バニリンの微生物的又は
酵素的製造に関する特許出願が幾つかなされている。一
般的には、適当な前駆体を微生物または酵素によりバニ
リンに変換することが行われている。そこで使用される
前駆体としてオイゲノール、イソオイゲノール、フェル
ラ酸、クルクミン又はベンゾエシアム樹脂が例示されて
いる。しかしながら、通常、その変換収率は極めて低
い。
【０００４】例えば、Haarman & ReimerのEP 0405197A1
では、微生物Serratia、Klebsiella又はEnterobacterを
用いて0.2g/Lのオイゲノールから18mg/Lの製品を得るこ
とがクレームされているが、この変換には、１３日間も
要していた。Pernod-RicardのEP 453368Aでは、フェル
ラ酸から、６日間以内のピクノポーラス発酵で46mg/Lの
バニリンを得ることがクレームされている。同様にKraf
t General Foods のUS5,128,253 では、フェルラ酸から
54日以内で210mg/L のバニリンを得ることがクレームさ
れている。この値を得るためには還元剤を添加する必要
があり、さもなければ、バニリンの生成は起こらず、バ
ニリン酸が生成してしまう。
【０００５】Takasagoの JP 227980/1993 では、バニリ
ン分解経路に対してブロックされた突然変異Pseudomona
s 菌株を調製し、それにより、1g/Lのフェルラ酸から0.
28g/L のバニリンを得ている。発酵法での経済的に魅力
あるバニリンの大量生産法を記述した唯一の特許出願が
最近Haarman & Reimerの EP 0761817A2 でなされてい
る。その中で発明者らはAmycolatopsis 属の二菌株が、
フェルラ酸食餌後の発酵培養液中に、バニリンを11.5g/
L まで蓄積することを見いだしている。
【０００６】結論としては、微生物系では大量のバニリ
ンを容易に生成させることはできないと言えるが、これ
は1g/L濃度以上ではバニリン生成菌の生長が妨げる、バ
ニリンの細胞毒性に主に起因している。微生物系では、
通常は、バニリンは見いだされず、それぞれのアルコー
ル又は酸が見いだされる。このバニリンの細胞毒効果
は、特定酵素類(Quest, EP 0542348 A2)を用いることで
克服でき、lipoxygenaseでイソオイゲノールを処理する
と、10〜15g/L のバニリンが10〜15％収率で得られる。
また、オイゲノールを用いた時には、非常に低濃度(0.3
〜0.5g/L、 収率0.3 〜0.5 ％) でバニリンが得られた
が、フェルラ酸を用いた時には全くそれが得られなかっ
た。また、lipoxygenaseを用いる前記方法は経済性の面
からは魅力的方法とは言い難い。
【０００７】バニリンの細胞毒性を克服する他の手段と
して、加熱処理でバニリンが生成するコニフェリルアル
デヒドを微生物で生産する方法が挙げられる(BASF ，公
開特許 DE 3604874 A1 参照) 。バニリンが1g/L濃度で
蓄積したとされる、最近のOrsan の特許出願(WO 96/349
71) の固定化細胞系でも同様方法が採用されている。こ
の固定化バイオマスを用いる方法の経済的利点として、
そこで使用した生物触媒をリサイクルできることが挙げ
られる。
【０００８】多数の報告で、オイゲノール、イソオイゲ
ノール又はフェルラ酸から出発するそれぞれの代謝経路
が取り扱われているが、一般的には、バニリンがこれら
化合物の分解経路の中間体と考えられている。フェルラ
酸の分解系にバニリンが関与していることを示す二つの
刊行物を列挙引用できる。
【０００９】Toms and Wood,Biochemistry 9(1970) 337
- 343、では、Pseudomonas sp. をフェルラ酸と共に培
養し、その分解経路を明らかにしている。培養液上澄み
液中にはバニリンが見いだされなかったが、バニリン酸
を見いだしたことより、バニリンが中間体である証拠を
得ている。また、フェルラ酸から出発して、Streptomyc
es setoniiの培養で、バニリンが得られている(Sutherl
and et al., Can. J.Microbiol. 29(1983) 1253 - 57)
が、量としての生成の兆候は得られなかったが、繰り返
し実験を行った時に痕跡だけその生成が見いだされた。
【００１０】生物変換用基質としてのフェルラ酸は種々
の天然物から豊富に得られ、利用できる。この酸は、
木、甜菜糖蜜、トウモロコシ糠、米及び種々のタイプの
草等の、植物材料中にグルコシドの形でしばしば存在す
る。フェルラ酸はこれら産物中の対応するグリコシド
を、良く知られた加水分解法、例えば酵素法などで分解
することで得られ、粗原料又は精製原料として用いられ
る。英国文献の GB 2301103 A1では、フェルラ酸含有植
物材料をフェルラ酸エステラーゼで酵素的に分解し、遊
離酸を得る例を記述している。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、微生物学的
方法で高収率でバニリンを製造する方法を提供すること
を目的としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】新規で、かつ、高収率で
バニリンを生産する本発明の微生物学的方法は、最初に
栄養素入り培養液でActinomycetales 目の微生物、好ま
しくはStreptomycetaceae 科、特に好ましくは細菌のSt
reptomyces setoniiを、好ましくは約5 〜40時間、炭素
源グルコースが（ほとんど）消費されるまで培養し、し
かる後、基質のフェルラ酸を発酵液中濃度が5 〜40g/L
の範囲になるように連続的もしくはバッチ的に加えるこ
とを含む。約5 〜50時間のインキュベーション（生物変
換）の後、基質のバニリンへの変換及び何種類かの副生
物への変換は完結する。
【００１３】この時点でフェルラ酸は完全に消費され、
発酵液中にはバニリンが約8 〜16g/Ｌ蓄積している。こ
のフェルラ酸の生物変換での代表的副生物は、バニルア
ルコール、バニル酸、グアイアコール、p ‐ビニルグア
イアコール及び2 ‐メトキシ‐4 ‐エチルフェノールで
ある。
【００１４】引き続いて、バイオマスの除去、適当な有
機溶媒、好ましくはメチル‐t ‐ブチルエーテルを用い
ての二段階抽出で、生成物の回収が行われる。第一段階
の抽出は、水相pH> 約9 、好ましくはpH10〜約11で行わ
れ、官能的に高活性グアイアコールなどの副生物が選択
的に抽出される。
【００１５】しかる後、水相抽出残液を中性pH値まで
「酸性化」し、生成物バニリンを選択的に抽出する。粗
バニリン抽出物の精製は、最終的には、良く知られた再
結晶化法で行われる。グアイアコールは粗抽出液の蒸留
で精製される。
【００１６】以下の図で示される生化学的反応経路に従
ったフェルラ酸からの天然バニリン並びに副生物を生産
する、前述してきた微生物学的方法及び抽出操作は経済
的に魅力ある方法である。 Streptomyces setonii によるフェルラ酸分解経路
【００１７】
【化１】
【００１８】得られたバニリン（化合物２）並びに副生
物グアイアコール（化合物３）は、両方とも、既知の芳
香性化合物で、それらの用途及び応用は当業者には既知
である。これら化合物を効率的かつ量的にバランス良く
使用することで、飲料、酪産物、ベーカリー製品、アイ
スクリームなどの芳香性消費材の官能特性を向上および
増大させることができる。発酵法で生産されたバニリン
とグアイアコールは、特に、全成分が天然成分であるこ
とが要求されるバニラ型及び果実芳香性組成物において
特に価値がある。
【００１９】
【発明実施の形態】上述してきたように、本発明者ら
は、官能的及び分析的に精製されたバニリンを高収率生
産でき、同時にハイ‐インパクトな芳香化合物のグアイ
アコールを副生物として得ることが可能な効率的生成物
回収法と組み合わせた厳密な発酵条件を見いだした。こ
れら条件は、適当な培養媒体中でStreptomyces属細菌を
培養し、引き続いて、基質フェルラ酸を過剰濃度、例え
ば5 〜40g/L 、 で添加し、バニリンを発酵液中で高容量
収率で得ることに基づいている。
【００２０】先に指摘したように、最適の菌株はStrept
omyces setonii菌株であり、好ましくは商業的に利用で
きるATCC 39116菌株である。基質のフェルラ酸は式(1)
で定義したものであり、本発明の新規な方法では、好ま
しくは10％以上のフェルラ酸含量を有するフェルラ酸原
料が基質として用いられる。フェルラ酸原料における、
フェルラ酸以外の残余物質の性質は、該原料に依存す
る。
【００２１】本発明の実施において、細菌の培養は、通
常の栄養素を含む水性媒体中で行われる。最適の培養媒
体には、炭素源、有機もしくは無機の窒素源、無機塩及
び成長因子が含まれている。培養媒体には炭素源とし
て、濃度5 〜50g/L 、 さらに好ましくは20〜35g/L のグ
ルコースの使用が適している。また、約2 〜20g/L 、 特
に好ましくは5 〜10g/L 濃度の酵母抽出物が窒素、りん
酸塩、成長因子及び極微量元素源として適している。さ
らに、マグネシウムイオン、例えば硫酸マグネシウムな
ど、が約0.1 〜5g/L、 好ましくは約0.5 〜1g/L濃度で添
加可能である。
【００２２】バイオリアクター中でこの培養液を調製、
殺菌し、しかる後、成長フェーズを開始させることを目
的として、Streptomyces菌株でインキュベートする。成
長フェーズの適当期間は約5 〜40時間、好ましくは15〜
35時間、特に好ましくは約20〜30時間である。
【００２３】他のプロセス条件の詳細 pH範囲 ： 約7 〜9 温度範囲 ： 約30〜約45℃ エアレーション ： この好気性プロセスには好まし
い。 攪拌 ： 好ましい。
【００２４】成長フェーズの停止後、基質のフェルラ酸
を培養液に加えるが、その適当な添加量は発酵液に対し
て5 〜40g/L 、 好ましくは約15〜30g/L 、 特に好ましく
は20〜25g/L である。この基質は固体のまま、もしくは
水溶液又は懸濁液として添加される。基質の全添加量
は、一段階、二段階もしくは多段階、もしくは連続的に
加えられる。
【００２５】生物変換フェーズは基質供給の開始と共に
開始され、全ての基質が生成物及び副生物に変換される
まで、約5 〜50時間、好ましくは10〜30時間、特に好ま
しくは15〜25時間、続けられる。基質フェルラ酸の転化
が停止後バニリンの高容量収率が観察されたことから、
供給フェルラ酸の過剰濃度が、バニリンの高容量収率に
主に影響していると考えられ、さらに、先に概要したプ
ロセス条件が、有用材のグアイアコールの蓄積にも影響
していると考えられる。
【００２６】生物変換フェーズの停止後、遠心分離又は
膜ろ過等の既知の方法で、発酵液からバイオマスを分離
し、無細胞発酵液を得る。
【００２７】この生物変換で親水性基質のフェルラ酸が
疎水性のバニリンやグアイアコールに変換されるので、
発酵系での全容積生産性は、 in situ 生成物回収法を採
用することで向上できる。これを目的として、例えば水
非混合性有機溶媒、植物オイル又は固体抽出剤、例えば
樹脂、好ましくはAmberlite XAD 又はXAD 7 等の中性樹
脂、の抽出相を発酵液に加えることができる。このよう
なin situ 生成物回収法を採用することで、水への溶解
濃度に達した後までもバニリン及びグアイアコールの継
続生産が可能となる。
【００２８】この発酵液から、バニリン及び副生物を二
種類の異なる抽出法で選択的に抽出可能であり、a)連続
的液‐液抽出又はb)バッチ的抽出がこのプロセスには適
している。
【００２９】a)pH値依存抽出に基づいて、バニリン及び
グアイアコールの効率的単離が遂行できる。第一段階
で、グアイアコールを発酵液から抽出する。この段階の
抽出には、水非混合性有機溶媒による抽出器内での向流
抽出法を使用するのが好ましい。溶媒例としてC1-3の酸
のC1-4アルコールとのエステル、エーテル類、特にメチ
ル‐t ‐ブチルエーテル(MTBE)が挙げられる。pHは好ま
しくは10〜11、 特にpH10.8〜11の範囲が適している。
【００３０】バニリンはグアイアコールの抽出水性残液
から、pH約5 〜約8 、好ましくは約6 〜約7.5 、特に好
ましくは約6.9 〜約7.1 で抽出される。バニリン濃度が
約8〜16g/L の場合、向流抽出操作は供給液／溶媒比が
2.5 ‐3:1 、特に、2.6:1が最も適している。
【００３１】b)高い水相バニリン濃度の時、例えば水蒸
発で発酵液を濃縮した時などは、異なるpH値での、前記
した溶媒による対応する二段階バッチ抽出が適してい
る。
【００３２】
【発明の効果】本発明の新規プロセスの利点を次のよう
に要約できる。 (1)Streptomyces 、例えばS.setonii の発酵液中のバニ
リン蓄積量を経済的に魅力的な濃度（約8 〜16g/L)にま
でできる発酵条件を利用できる。 (2) この方法では、バニリンとグアイアコール、すなわ
ち天然香料調製で価値の高い二種類の産品、の同時生産
が可能である。 (3) この発酵方法は技術的には複雑でなく、容易に入手
可能な原料から得られる製造原料を使用できる。
【００３３】最後に、本発明はまた、Streptomyces set
onii ATCC39116の代わりに、その酵素又はバニリン及び
／又はグアイアコールの細胞性生合成に関連しているか
又は関与している酵素をコードする遺伝子学的物質を含
む組み替え微生物、例えば酵母、を使用し、先に述べて
きたような微生物を用いない、バニリン製造用の新規方
法にも関する。
【００３４】
【実施例】 例１ 以下の組成の媒体50mLが入った250mL 振とうフラスコを
準備し、そのpHをNaOHで7.2 に調整した。 スクロース 103 g/L Na2 HPO4 4 g/L KH2 PO4 1 g/L 酵母エキス 1 g/L NaCl 0.2 g/L MgSO4 0.2 g/L CaCl2 0.05 g/L
【００３５】この振とうフラスコに、2mL の前培養され
たStreptomyces setonii ATCC 39116 を接種し、37 ℃、1
90rpm で16時間、培養を行った。成長フェーズ終了時に
0.3gのフェルラ酸(Aldrich社から購入、cat.no 12.870
- 8, 99%) を、培養液に加えた。この操作を行うにあた
り、10％w/w 酸基質/0.5M NaOH溶液( 最終pHは約7.2)を
前もって調製し、無菌ろ過した。
【００３６】フラスコを再度37℃、190rpm でインキュベ
ートし、 生物変換（インキュベーション）を31.5時間行
ったところ、バニリン濃度は3.10g/L(HPLC) に達した。
分子収率は66mol ％であった。
【００３７】例２ 250mL 振とうフラスコを準備し、例1 と同様にインキュ
ベートした。16時間の成長フェーズ後、0.6gのフェルラ
酸(10w/w溶液／0.5M NaOH)を培養液に加え、フラスコを
再度、37℃、190rpmでインキュベートした。78時間の生
物変換後、バニリン濃度は5.94g/L(HPLC) に達した。分
子収率は63mol ％であった。
【００３８】例3 250mL 振とうフラスコを準備し、例1 と同様にインキュ
ベートした。18時間の成長フェーズ後、0.3gのフェルラ
酸(10w/w溶液／0.5M NaOH)を培養液に加え、フラスコを
再度、37℃、190rpmでインキュベートした。28時間後に
二回目のフェルラ酸0.3g供給を行った。インキュベーシ
ョン終了時(58 時間) 、バニリン濃度は6.41g/L(HPLC)
に達した。分子収率は68mol ％であった。
【００３９】例4 Streptomyces setoniiの前培養液を振とうフラスコ中
で、pH7.2 、37℃、190rpmの条件下、24時間、成育し
た。この振とうフラスコ内媒体は、 グルコース 5 g/L Na2HPO4 4 g/L KH2PO4 1 g/L 酵母エキス 10 g/L MgSO4 0.2 g/L であった。
【００４０】32g/L のグルコース、8g/Lの酵母エキス、
0.8g/LのMgSO4 及び0.2g/Lの消泡剤(Dow Corning AF 15
20) を含む10L の媒体で、バイオリアクターを満たし、
熱殺菌後、前述した振とうフラスコ内で成育した前培養
液を接種した。使用した接種液量は3 ％であった。プロ
セス条件を、37℃、pH7.2 、空気流速1.0vvm、800rpm、
として24時間インキュベートした。成長フェーズ終了後
の残留グルコース濃度は4.6g/Lであった。
【００４１】引き続いて、NaOH(30%) でpHを8.5 にし、
接種24.5時間後で、10％w/w フェルラ酸0.5M NaOH 溶液
2.25L を発酵液に添加した。供給時点で、グルコース濃
度は4.0g/Lに低下した。前駆体添加3 〜4 時間後に、フ
ェルラ酸のバニリンへの生物変換開始が観察された。前
駆体供給17時間後、GC測定で発酵液中に13.9g/L のバニ
リンと0.4g/Lのグアイアコールが存在することを確認し
た。この時点で、フェルラ酸は完全に変換されていた。
バニリン収率は75mol ％であった。
【００４２】バイオプロセスを80℃、15 分間の条件で殺
菌して停止させ、しかる後、発酵液をミクロフィルター
(0.2μm)でろ過した。
【００４３】例5 実動容積340Lの450Lバイオリアクターを、前述した操作
に従って運転した。26.5時間の成長フェーズ後、pHを8.
5 に調整し、例4 に従って、一回目のフェルラ酸供給
(4.08kg)を行った。その時点での残留グルコース濃度は
7.5g/Lであった。１時間後に二回目のフェルラ酸供給
(3.57kg)を行った。全フェルラ酸供給量は22.5g/L であ
った。一回目の前駆体供給25.5時間後に、バニリン濃度
は9.0g/L、 フェルラ酸濃度は1.75g/L になった。バニリ
ン収率は51mol ％であった。
【００４４】例6 工業規模でのバニリンとグアイアコールの液‐液向流抽
出 ７．１g/L バニリンと0.35g/L のグアイアコールを含む
7930kgの無細胞、膜ろ過済み発酵液をNaOHでpH11に調整
し、攪拌向流抽出器中で、最初に溶媒としてMTBEを用い
て、グアイアコールを分離した。MTBE蒸発後、MTBEと33
％w/w グアイアコールを含む8kg の粗抽出物を得た。こ
のアルカリ抽出の水性抽出残液pHを塩酸で6.9 〜7.1 に
調整し、MTBEを溶媒として同じ抽出器中で、バニリンの
抽出を行った。この第二抽出段階から、MTBEと37％w/w
バニリンを含む150kg の粗抽出物を得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はバニリンとグアイアコールの生成を示
し、10L 規模でのバニリン生産バッチの代表的チャート
である。図１に示した方法では、24時間の成長フェーズ
後、フェルラ酸を供給する前に、pHを8.5 に調整した。
基質添加3 〜4 時間で少量のバニリンが検出された。合
計41時間の発酵後( フェルラ酸供給17時間後) 、バニリ
ン濃度は13.9g/L に達した。その時点でのグアイアコー
ル濃度は0.38g/L であった。生産速度はバニリンが1.10
g/L/h 、 グアイアコールが0.04g/L/h であった。フェル
ラ酸が完全に変換された後、バニリンとグアイアコール
の濃度減少が観察された。定量的測定はHPLC及びGCで行
った。
フロントページの続き (72)発明者 トーマス ミュンヒ スイス国 イラナウ，ハーゲンワイス ９ (72)発明者 マークス ウェトリ スイス国 フォルヒ，アルテ フォルヒシ ュトラーセ 52

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 バニリンの製造法であって、 a)Actinomycetales 目、好ましくはStreptomycetaceae
    科、特に好ましくはStreptomyces setoniiに属する細菌
    を栄養素培養液中で培養し、 b)基質フェルラ酸を、その栄養素培養液に発酵液中濃度
    が約5 g/L から約40g/L になるよう添加し、フェルラ酸
    の生物変換の主反応生成物としてバニリンを生成させ、
    バイオマスを発酵液から分離し、 c)生成したバニリンを、必要に応じて副生物のグアイア
    コールを、発酵液から抽出する ことを特徴とするバニリンの製造法。
  2. 【請求項２】 工程c)において、発酵液のpHを約>9に調
    整し、しかる後、有機溶媒で最初にグアイアコールを抽
    出する、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 発酵液のpHを、引き続いて、約7 にし、
    バニリンを有機溶媒で抽出する、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 反応生成物のバニリンとグアイアコール
    を中性条件下で抽出する、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 培養を約5 時間から約40時間行う、請求
    項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 メチル‐tert‐ブチルエーテルが抽出溶
    媒である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 生物変換期間が約5 時間から約50時間で
    ある、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 Streptomyces setonii、例えばStreptom
    yces setonii ATCC39116 の代わりに、バニリン及び／
    又はグアイアコールの細胞生合成に関連もしくは関与す
    る酵素類又はそれら酵素類をコードする関連遺伝子学的
    物質を含む、酵母で例示される、組み替え微生物を用い
    る、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
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