CZ188398A3

CZ188398A3 - Způsob výroby vanilinu

Info

Publication number: CZ188398A3
Application number: CZ981883A
Authority: CZ
Inventors: Andreas Muheim; Bruno Müller; Thomas Münch; Markus Wetli
Original assignee: Givaudan-Roure (International) Sa
Priority date: 1997-06-19
Filing date: 1998-06-16
Publication date: 1999-01-13
Also published as: DE69833516D1; EP0885968B3; DE69833516T3; ES2258290T3; AU7196498A; JP4359349B2; BR9802011A; ZA985146B; CA2238215A1; DE69833516T2; EP0885968B1; PL191552B1; DK0885968T3; TR199801111A3; IL124800A; EP0885968A1; ES2258290T7; JPH1169990A; PL326882A1; TR199801111A2

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká mikrobiologického postupu pro výrobu vanilinu z ferulové kyseliny. Podle tohoto postupu kultura, výhodně ponořená kultura, jakýchkoli bakterií řádu Actinomycetales, výhodně čeledi Streptomycetaceae,se inkubuje se substrátem ferulové kyseliny k fermentační produkci vanilinu. Vyrobený vanilin se získá z fermentačního bujónu určenou extrakční metodou dovolující také separaci a zisk hodnotných fermentačních vedlejších produktů, aby se získal analyticky a senzoricky vyčištěný produkt vanilin a zejména vedlejší produkt guajakol.

Dosavadní stav techniky

Při použití aromatizačních sloučenin je stále důležitější, aby aromatizační sloučeniny mohly být označeny jako přírodní. V souhlase s evropskými a US pravidly to znamená, že sloučenina musí být získána fyzikálním, enzymatickým nebo mikrobiologickým postupem a jen z materiálů rostlinného nebo živočišného původu. Různé výzkumné aktivity během poslední dekády byly tudíž zaměřeny na použití obnovitelného laciného a přírodního surového materiálu pro fermentační produkci vanilinu. Avšak v publikacích a patentech byly dosud velmi vzácně uvedeny atraktivní objemové výtěžky.

Guajakol je fenolický kouřový typ molekuly, který významně přispívá k charakteristickému aromatu vanilkových extraktů. Je tedy často používán v kombinaci s vanilinem pro vanilkový typ aromat. Avšak fermentační produkce přírodního guajakolu nebyla dosud popsána.

• ·

Ί • ·

V posledních deseti letech bylo přihlášeno několik patentových přihlášek týkajících se mikrobiální nebo enzymatické produkce vánilinu. Obecně se vhodný prekursor převede ha vanilin mikroorganizmem nebo enzymem. Navrhované prekurzory jsou eugenol, isoeugenol, kyselina ferulová, kuminové nebo siamské benzoe pryskyřice. Obvykle jsou transformační výtěžky extrémně nízké. Příklady jsou např. Haarman a Reimer (EP 0 405 197 Al) nárokující produkci 18 mg/1, přičemž se vychází z 0,2 g/l eugenolu za použití mikroorganizmů Serratia Klepsiella nebo Enterobacter. Tato transformace navíc trvá dní. Pernod-Ricard (EP 453 368 A) nárokuje 46 mg/1 vanilinu získaného v 6 dnech fermentací mikroorganizmem Picnoporus z ferulové kyseliny.

V této řadě je také Kraft General Foods (US 5 128 253) nárokující 210 mg/1 vanilinu z ferulové kyseliny během 54 dnů. Aby se získalo toto množství, musí být přidáván redukční prostředek, protože jinak by se tvorba vanilinu neuskutečnila a byla by vytvořena jen kyselina vanilová. Takasago (JP 227980/1993) připravil mutanty kmenů Pseudomonas, které jsou blokovány v degradační dráze vanilinu. Takto, vycházeje s 1 g/l kyseliny ferulové,může být získáno 0,28 g/l vanilinu. Tyto dosud jediné zaznamenané ekonomicky atraktivní objemové výtěžky vanilinu při fermentačním postupu byly dosud publikovány Haarmanem a Reimerem (EP 0 761 817 A2). Identifikovaly 2 kmeny Amycolatopsis, které jsou schopny akumulovat vanilin až do koncentrace 11,5 g/l ve fermentačním bujónu po nadávkování kyseliny ferulové.

Závěrem může být uvedeno, že vysoká množství vanilinu se nesnadno vytvářejí v mikrobiálních systémech. To je hlavně způsobeno vlivem buněčné toxicity vanilinu, který v koncentracích nad lg/1 brání růstu mikroorganizmů produkujících vanilin.

- 3 V mikrobiálních systémech se obvykle nalézají příslušné alkoholy nebo kyseliny a ne vanilin. Tento toxický účinek vanilinu byl překonán použitím enzymů (Quest, EP 0 542 348 A2). Zpracování isoeugenolu s lipoxygenasou vedlo k 10 až 15 g/1 vanilinu při výtěžku 10 až 15 %. Mnohem nižší koncentrace byly získány, když se použil eugnol (0,3 až 0,5 g/1 při výtěžku 0,3 až 0,5 %) a žádný odkaz není zmíněn pro kyselinu ferulovou. Způsob využívající lipoxygenasu je ztěží atraktivní z ekonomického hlediska.

Další opatření k zamezení toxicity této sloučeniny je mikrobiální produkce koniferylaldehydu, který tvoří vanilin při tepelném zpracování, viz BASF (Offenlegungs Schrift,

DE 3604874 Al). Podobný je také imobilizovaný buněčný systém jak je popsáno v nedávné Orsanově přihlášce vynálezu (WO 96/34971), ve které se vanilin akumuluje až do koncentrace^ lg/1. Možná ekonomický výhoda použití zmobilizované biomasy je uvedena v recyklaci biokatalyzátoru.

Mnoho prací se zabývá příslušnými metabolickými dráhami, když se vychází z eugenolu, isoeugenolu nebo ferulové kyseliny. Obecně se má zato, že vanilin je meziproduktovou sloučeninou při degradační dráze těchto sloučenin. Dvě publikace mohou být citovány, které ukazují zastižení vanilinu při degradaci kyseliny ferulové. Toms a Wood, Biochemistry 9 (1970) 337-43, kultivovali Pseudomonas sp. na ferulové kyselině a vysvětlili degradační dráhu. Ačkoli vanilin nebyl zjištěn v kultivačním supernatantu, byl uveden důkaz, že vanilin je meziproduktovou sloučeninou, protože mohla být zjištěna kyselina vanilová, Když ae vycházelo z ferulové kyseliny, vanilin byl získán v kulturách Strepromyces setonii (Sutherland a j., Can.J.Microbiol. 29 (1983) 1253-57). Není uvedena žádná indikace množství, ale jen stopy byly zjištěny, když se opakoval experiment.

/

Kyselina ferulová jako substrát pro biotransformace je hojně dostupná z různých přírodních zdrojů. Kyselina se často vyskytuje ve formě glukosidu v rostlinných materiálech jako je dřevo, řepná melasa, kukuřičné otruby, rýže a různé druhy trav. Může být izolována z odpovídajících glykosidů v těchto produktech dobře známými hydrolýzními metodami, například za použití enzymů a může být použita jako surový materiál nebo vyčištěný materiál. Britský zdroj (GB 2301103 Al) popisuje například enzymatické odbourání kyseliny ferulové obsažené v rostlinném materiálu esterasou ferulové kyseliny, aby se získala volná kyselina.

Podstata vynálezu

Předložený nový vysoce výtěžkový mikrobiologický postup pro výrobu vanilinu zahrnuje kultivaci nejdříve ve výživném bujónu, a to kultivaci mikroorganizmu řádu Actinomycetales, výhodně čeledi Streptomycetaceae, nejvýhodněji bakterie Streptomyces setonii, přičemž výhodně je kultivační perioda asi 5 až 40 hodin a trvá, dokud se uhlíkový zdroj glukosa (téměř) nespotřebuje, pak se přidá substrát kyseliny ferulové v rozmezí asi 5 až 40 g/1 fermentačního bujónu, bud kontinuálně nebo diskontinuálně. Po přibližné inkubační (biotransformační) periodě asi 5 až 50 hodin je dokončena konverze substrátu na vanilin a několik vedlejších produktů. Kyselina ferulová je postřehována a vanilin akumulován až do asi 8 až 16 g/1 ve fermentačním bujónu. Typickými vedlejšími produkty biotransformace kyseliny ferulové jsou vanilový alkohol, vanilová kyselina, guajakol, para-vinylguajakol a 2-methoxy-4ethylfenol.

Další získávání produktu spočívá v odstranění biomasy, načež obvykle následuje dvoustupňová extrakce vhodným orga- 5 nickým rozpouštědlem, výhodně methylterc.butyletherem.

První extrakce se provádí při pH vyšším než asi 9, výhodně při pH 10 až asi 11 ve vodné fázi pro selektivní extrakci vedlejších produktů, jako je senzoricky vysoce aktivní guajakol. Pak se vodný rafinát okyselí na neutrální hodnoty pH, čímž se selektivně extrahuje produkt vanilin. Vyčištění surového vanilinového extraktu může být nakonec provedeno aplikací dobře známých rekrystalizačních metod. Guajakol může být vyčištěn ze surového extraktu destilací.

Mikrobiologický postup a popsaná extrakční procedura jsou výhodné pro ekonomicky atraktivní produkci přírodního vanilinu stejně jako vedlejších produktů z ferulové kyseliny podle následující biochemické linie.

Linie degradace ferulové kyseliny například pomocí Streptomyces setonii

f

- 6 I « · · · · * » » · « · · ·· » · · · ··· · · • « » « · · «· · «0 ··

Výsledný vanilin (sloučenina 2) stejně jako vedlejší produkt guajakol (sloučenina 3) jsou oba známými chutovými a vonnými sloučeninami. Jejich použiti a aplikace jsou známy odborníkům v oboru. Při použití účinných a vybalancovaných množství těchto sloučenin je možné rozšířit nebo zvýšit organoleptické vlastnosti ochucení potravin jako jsou nápoje, mléčné výrobky, pečivo, zmrzlina a podobně. Fermentačně vyrobený vanilin a guajakol jsou zvlášř hodnotné v jakýchkoli chutových kompozicích vanilkového a ovocného typu, kde se vyžadují zcela přírodní složky.

Jak bylo výše poukázáno, přesné fermentační podmínky kombinované s účinnými produkčními ziskovými metodami, neumožHovaly vysoké výtěžky produkce senzoriticky a analyticky vyčištěného vanilinu stejně, jako získání velmi vlivné chuřové sloučeniny guajakolu jako vedlejšího produktu. Tyto podmínky jsou založeny na kultivaci bakterie rodu Strepromyces v příslušném kultivačním prostředí a následném přídavku substrátu ferulové kyseliny v přebytkových koncentracích, to je asi 5 až asi 40 g/1, čímž se získá vanilin ve vysokých objemových výtěžcích ve fermentačním bujónu.

Nejvhodnější je, jak bylo poukázáno výše, druh Streptomyces setonii, výhodně komerčně dostupný kmen ATCC 39116.

Substrátová kyselina ferulová je definována vzorcem 1. Podle nového postupu se použije materiál obsahující kyselinu ferulovou s obsahem kyseliny ferulové výhodně větším než 10 %, jako substrát. Povaha zbývajících sloučenin závisí na použitém zdroji.

Při provádění tohoto vynálezu se kultivace bakterií provádí ve vodném prostředí v přítomnosti obvyklých živných látek. Vhodné kultivační prostředí obsahuje zdroj uhlíku, organický nebo anorganický zdroj dusíku, anorgancké kyseliny a růstové faktory.

Pro kultivační prostředí se výhodně použije glukosa jako zdroj uhlíku, například v koncentraci asi 5 až 50 g/1, výhodně asi 20 až 35 g/1. Kvasinkový extrakt je obvykle zdrojem dusíku, fosfátů, růstových faktorů a stopových prvků a tento extrakt může být přidán například ve výhodných koncentracích asi 2 až 20 g/1, nejvýhodněji asi 5 až 10 g/1. Navíc mohou být přidány horečnaté ionty, například síran hořečnatý v koncentraci asi 0,1 až 5 g/1, výhodně asi 0,5 až 1 g/1.

Kultivační bujón se připraví a sterilizuje v bioreaktoru a pak se naočkuje kmenem Streptomyces, aby se iniciovala růstová fáze. Vhodné trvání růstové fáze je asi 5 až 40 hodin, výhodně asi 15 až 35 hodin a nejvýhodněji asi 20 až 30 hodin.

Specifikace dalších procesních podmínek jsou:

rozmezí pH: asi 7 až asi 9 rozmezí teplot: asi 30 až asi 45 °C aerace: je výhodná pro tento aerobní proces míchání: je výhodné.

Po dokončení růstové fáze se do kultury přidá substrát ferulové kyseliny. Vhodné množství dávky substrátu je asi 5 až 40 g/1 fermentačniho bujónu^ výhodně asi 15 až 30 g/1, nejvýhodněji 20 až 25 g/1. Substrát se bud přidává jako tuhý materiál, nebo jako vodný roztok nebo suspenze. Celkové množství substrátu se bud dávkuje v jednom stupni, ve dvou nebo více dávkovačích stupních, nebo kontinuálně.

Biotransformační fáze se zahajuje se začátkem dávkování substrátu a trvá asi 5 až 50 hodin, výhodně 10 až 30 hodin a nejvýhodněji 15 až 25 hodin, totiž dokud se všechen substát nepřevede na produkt a vedlejší produkty.

• · · a « » « · « » • « a ♦ · · a aa • · a a a * * · aa» a · a a a a a · a a a · aa aa ·* a ·· aa

Předpokládá se, ze přebytková koncentrace dávkované ferulové kyseliny je hlavně zodpovědná za vysoký objemový výtěžek vanilinu jak je zjištěno po skončené konverzi substrátu. Navíc procesní podmínky výše popsané jsou také, jak se předpokládá, odpovědné za akumulaci hodnotného guajakolového materiálu.

Po skončené biotransformační fázi se biomasa oddělí z fermentačního bujónu jakoukoli dobře známou metodou jako je odstřelování nebo membránová filtrace a podobně, čímž se získá bezbuněčný fermentační bujón.

Protože biotransformace převádí hydrofilní substrát kyseliny ferulové na dost hydrofobní látky jako je vanilin a guajakol, celková objemová produktivita fermentačního systému může být zvýšena aplikací jakéhokoli způsobu získávání produktu in sítu. Pro tento účel může být například přidána extrakční fáze do fermentačního bujónu za použití například s vodou nemísitelného organického rozpouštědla, rostinného oleje nebo jakéhokoli tuhého extraktantu, například pryskyřice výhodně neutrální pryskyřice jako je Amberlite XAD 4 nebo XAD 7 nebo podobně. Takováto in sítu získávací metoda produktu může umožnit pokračující tvorbu vanilinu a guajakolti také podosažení ve vodě rozpustných koncentrací.

Z tohoto fermentačního bujónu mohou být nyní vanilin a vedlejší produkty extrahovány selektivně dvěma rozdílnými extrakčními metodami.

Kontinuální kapalino-kapalinová extrakce a) nebo vsázková diskontinuální extrakce b) jsou vhodné.

φφφ « φ· · φ φ · φ * φ φ φφ φ φ φ φφφ · φ φφφ φφφ • Φ · *· φφ

a) Na základe extrakce závislé na hodnotě pH může být provedena účinná izolace vanilinu a také guajakolu. V prvním stupni může být guajakol extrahován z vhodného fermentačního bujónu. Pro tento stupefí se výhodně použije protiproudá ex-) trakční metoda, výhodně v extraktoru, výhodně pomocí organického ve vodě nerozpustného rozpouštědla. Příklady rozpouštědel jsou estery C^_jkyselin s C^_^alkoholy, ethery, zejména methylterc.butylether (MTME). Hodnota pH je výhodně mezi 10 až 11, zejména pH 10,8 až 11.

Vanilin se pak extrahuje z vodného rafinátu guajakolu extrakcí při pH asi 5 až asi 8, výhodně asi 6 až 7,5, výhodně asi 6,9 až asi 7,1.

Práce s koncentracemi vanilinu asi 8 až asi 16 g/1 v protiproude extrakci probíhá nejvhodněji v poměru dávka/rozpouštědlo asi 2,5-3:1, zejména asi 2,6:1.

b) Při vyšších koncentracích vanilinu ve vodné fázi, například po koncentraci fermentačního bujňu pomocí odpaření vody, je výhodná dvoustupňová diskontinuální extrakce při rozdílných hodnotách pH a s rozpouštědly navrhovanými výše.

Výhody nového postupu mohou být shrnuty následovně:

(1) jsou vhodné fermentační podmínky, které umožííují akumulaci vanilinu ve fermentačním bujónu Streptomyces >· například S.setonii, v ekonomicky atraktivních koncentracích (asi 8 až 16 g/1), (2) postup umožňuje současnou produkci vanilinu a guajakolu^ to je dvou produktů vysoké hodnoty v přípravě přírodních ochucovacích přípravků.

• · · · * φ φ φ «φ • · · » · φ φ φ Φφ φ φ φ φ φ φ φ ' φ φ φ φφφ φφ ·« φφφ φφφφ

- 10 (3) Fermentační postup má nízkou technickou složitost a používá surovin ze snadno dostupných zdrojů.

Konečně se vynález týká také nového postupu pro výrobu vanilinú/ ale za použití místo mikroorganizmů Streptomyces setonii ATCC 39116, jeho enzymů nebo jakýchkoli rekombinantních mikroorganizmů, například kvasinek® které obsahují genetický materiál kódující pro enzymy, které jsou relevantní nebo zahrnuty v buněčné biosyntéze vanilinu a/nebo guajakolu,’) a tedy ne mikroorganizmu jako takového.

i

9 9 «·» ι | Μ

9 «99 9« 9 «««« ·

9999 999 999 «9 99 9 *9 9«

Příklady provedení vynálezu r

Příklad 1

Byly připraveny 250 ml třepací baňky obsahující 50 ml následujícího media: 103 g/1 sacharosy, 4 g/1 NajHPO^, 1 g/1 KH₂PO₄, 1 g/1 kvasinkového extraktu, 0,2 g/1 NaCl, 0,2 g/1 MgSO₄a 0,05 g/1 CaClj. Hodnota pH byla nastavena na 7,2 za pooužití NaOH. Třepací baňky byly inokulovány 2 ml překultury Streptomyces setonii ATCC 39116 a kultivovány při 37 °C při 190 otáčkách za minutu po dobu 16 hodin. Na konci růstové fáze byly přidány 0,3 g kyseliny ferulové (zakoupené od firmy Aldrich, katalogové číslo 12 870-8, 99%ní) do kultury.

Pro tento účel 10%ní hm/hm roztok kyselinového substrátu v 0,5M NaOH (konečné pH roztoku bylo přibližně 7,2) byl předběžně připraven a sterilně zfiltrován. Baňky byly znovu inkubovány pl-li 37 °C, 190 otáčkách za minutu. Po 31,5 hodinách biotransformace (inkubace) se dosáhlo koncentrace vanilinu 3,10 g/1 (HPLC). Byl vypočten molekulární výtěžek 66 % molárních.

I

Příklad 2

Byly připraveny 250 ml třepací baňky a inkubovány jako v příkladu 1. Po 16 hodinách růstové fáze bylo do kultury přidáno 0,6 g ferulové kyseliny(jako 10%ní hm/hm roztok v 0,5M NaOH). Baňka byla inkubována znovu při 37 °C a 190 otáčkách za minutu. Po 78 hodinách biotransformace (inkubace) byla dosažena koncentrace vanilinu 5,94 g/1, což odpovídá výtěžku 63 % mol.

Příklad 3

250 ml třepací baňka byla připravena a inkubována jako v příkladu 1.

- 12 • * · Μ · 4 4444 ·

4 4 4 4 4 4 ·4 ·4 4 4· 44

Po 18hodinové růstové fázi bylo do kultury přidáno 0,3 g ferulové kyseliny(jako 10% hm/hm roztok v 0,5M NaOH).

Baňka byla inkubována znovu při 37 °C a 190 otáčkách za minutu Po 28 hodinách následovala druhá dávka 0,3 g ferulové kyseliny. Na konec inkubace (58 hodin) byla dosažena koncentrace vanilinu 6,41 g/l, což podpovídá výtěžku 68 % mol.

Příklad 4

Prekultura Streptomyces setonii byla vypěstována v tře pací baňce při pH 7,2, 37 °C, 190 otáčkách za minutu během 24 hodin. Medium třepací baňky obsahovalo 5 g/l glukosy, 4 g/l Na₂HPO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 10 g/l kvasinkového extraktu a 0,2 g/l MgSO₄.

Bioreaktor byl naplněn 10 1 media obsahujícího 32 g/l glukosy, 8 g/l kvasinkového extraktu, 0,8 g/l MgSO₄ a 0,2 g/l odpětíovacího prostředku (Dow Corning AF 1520). Po tepelné sterilizaci byl reaktoru inokulován dříve vypěstovanou prekulturou z třepací baňky. Množství inokula, které bylo použito bylo 3 %. Procesní podmínky byly 37 °C, pH 7,2, průtok vzduchu 1,0 vvm, 800 otáček za minutu. Po 24 hodinách růstové fáze byla naměřena koncentrace zbývající glukosy 4,6 g/l. Následně bylo pH posunuto na 8,5 pomocí NaOH (30%ního) a 24,5 hodin po inokulaci bylo do fermentačního bujónu přidáno 2,25 1 10%ního hm/hm roztoku kyseliny ferulové v 0,5M NaOH.

V době přídavku byla koncentrace glukosy snížena na 4,0 g/l. 3 až 4 hodiny po přídavku prekursorů byl zjištěn začá tek biotransformace kyseliny ferulové na vanilin. 17 hodin po přídavku prekursorů byly naměřeny koncentrace 3,9 g/l vanilinu a 0,4 g/l guajakolu ve fermentaČním bujónu plynovou chromatografií. V té době byla kyselina ferulová zcela přeměněna.

• · · · · · • · ·*· · · * · · * · · · ·· *· «« · * · · · • * ·· » ··« · * • * · ·· *·

Byl vypočten výtěžek vanilinu 75 % mol.

Bioproces byla pak ukončen pasterizací při 80 °C po dobu 15 minut. Fermentační bujón byl mikrofiltrován (0,2 mikrometru ).

Příklad 5

450 litrový bioreaktor s pracovním objemem 340 1 byl provozován podle postupu popsaného v předcházejícím příkladu.

Po růstové periodě 26,5 hodin bylo pH posunuto na 8,5 a první kyselina ferulová v množství 4,08 kg byla přidána podle příkladu 4. Současně byla naměřena zbývající koncentrace glukosy 7,5 g/1. O 1 hodinu později bylo přidáno 3,57 kg dalšího prekursoru. Celkové množství přídavku kyseliny ferulové bylo 22,5 g/1. 25,5 hodin po první dávce prekursoru byla naměřena koncentrace vanilinu 9,0 g/1. Koncentrace kyseliny ferulové byla nyní 1,75 g/1. Výtěžek vanilinu byl 51 % mol.

Příklad 6

Kapalino-kapalinová protiproudá extrakce vanilinu a guajakolu v technickém měřítku

939 kg bezbuněčného membránově zfiltrovaného fermentačního bujónu obsahujícího 7,1 g/1 vanilinu a 0,35 g/1 guajakolu bylo nastaveno na pH 11 pomocí NaOH a extrahováno nejdříve MTBE jako rozpouštědlem v komorově míchaném protiproudém extraktoru k oddělení guajakolu. Po odpaření MTBE bylo získáno 8 kg surového extraktu obsahujícího MTBE a 33%ní hm/hm guajakol. pH vodného rafinátu z této alkalické extrakce bylo pak posunuto na 6,9 až 7,1 kyselinou chlorovodíkovou a znovu extrahováno MTBE ve stejném extraktoru!;· čímž se oddělil vanilin.

*

9 9

9

Z tohoto druhého extrakčního stupně bylo získáno 150 kg surového extraktu obsahujícího MTBE a 37%ní obj/obj. vanilin.

Přiložený obrázek představuje:

Typický graf produkční vsázky vanilinu v 10 litrovém měřítku

-Δ- koncentrace vanilinu v g/1,

- (7 - koncentrace ferulové kyseliny v g/1,

- 0 koncentrace guajakolu v g/1,

-o- hodnota pH, hodnota¹po_ v %, *

-x- koncentrace glukosy v g/1.

Po 24 hodinové růstové fázi bylo pH nastaveno na 8,5 před přídavkem kyseliny ferulové. 3 až 4 hodiny po přídavku substrátu bylo detekováno malé množství vanilinu. Byla dosažena koncentrace vanilinu 13,9 g/1 po celkových 41 hodinách fermentace (17 hodin po přídavku kyseliny ferulové). V této době byla naměřena koncentrace guajakolu 0,38 g/1. Byla vypočtena produkční rychlost 1,10 g/1 za hodinu pro vanilin a 0,4 g/1 za hodinu pro guajakol. Po úplné konverzi kyseliny ferulové byl zjištěn pokles koncentrací vanilinu a guajakolu. Kvantitativní měření byla provedena pomocí vysokovýkonové kapalinové chromatografie HPLC a pomocí plynové chromatografie

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby vanilinu vyznačený tím, že zahrnuje

a) kultivaci bakterie náležející do řádu Actinomycetales v Živném bujónu, výhodně z čeledi Streptomycetaceae, nejvýhodně ji Streptomyces setonii, pak

b) přidání substrátu kyseliny ferulové, přičemž koncentrace substrátu v živném bujónu je od asi 5 g/l do asi 40 g/l ve fermentačním bujónu, produkci vanilinu jako hlavního reakčního produktu biotransformace kyseliny ferulové a separaci biomasy z fermentačního bujónu,

c) a extrakci vytvořeného vanilinu a, je-li třeba, vedlejšího produktu guajakolu z fermentačního bujónu.
2. Způscř podle nároku 1 vyznačený tím, že ve stupni c) se guajakol nejdříve extrahuje při zvýšení pH fermentačního bujónu výše než asi 9 a za použití organického rozpouštědla.
3. Způsob podle nároku 2 vyznačený tím, že pH fermentačního bujónu se následně převede na hodnotu asi 7 a vanilin se extrahuje pomocí organického rozpouštědla.
4. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že reakční produkty vanilin a guajakol se extrahují za neutrálních podmínek.
6. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků

1 až 5 vyznačený tím, že se jako extrakční rozpouštědlo použije methylter.butylether.

« 0 · ·

0 * '0 ·«

0 · · · *0 0« »

000 0 0 0
7. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 že biotransformační perioda se udržuje mezi dinami.

až 6 vyznačený tím, asi 5 až asi 50 ho8. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků 1 až

7 vyznačený tím, že se místo Streptomyces setonii, například Streptomyces setonii ATCC 39116 použije jejich enzymů nebo jakýchkoli rekombinantních mikroorganizmů, například kvasinek, které obsahují relevantní genetický materiál kódující pro enzymy, které jsou relevantní nebo zahrnuty v buněčné biosyntéže vanilinu a/nebo guajakolu.

000

0 0 0 0 0 • · 0 0 0 0 0 • 0 · · 0 0 0

00 00 00 0 * * 00

0 0 0 0 guajakol g/l (-o-) o o o o o ta «a o — n) ω

..........1.........1......... l-ti--. . . . . I .

O ·

tn j

ferulová kyselina g/l (-7-) — — — — — MWN)

OM-t>OTaoof\j-&<nooow.A

......... ^............... t .... 1 .... 1..............1....1 čas vanilin g/l (-Δ-) _PH (-0-)

Produkce vanilinu a guajakolu

............................ i nn.»T|inii i m|i i iinri Ι|Π n 1111 ηιιιι im i |n 11 li n i|iuni nu'

O — AJGJ-tkCnCDxJtDtO —

0 0 O O O O o o o o o

po₂, % (<]-)

........... 1 1 1 1 FI 1 . ..................... ..........I ι ι. ι ι ι ι ι ι i ...........

o tn — — ΜΜωω o tn o tn o tn glukosa g/l (-»-)