MX2008012689A - Proceso para producir vainilla a partir de microorganismos inmovilizados por cultivo de superficies. - Google Patents

Abstract

Siendo Un proceso de biotransformación o biocatalisis de ácido ferúlico en vainillina, el proceso cuenta con los pasos de (a) inmovilizar un microorganismo del orden de los actinomicetos en un soporte poroso inerte compresible; (b) agregar una solución de ácido ferúlico o de alguna de sus sales; (c) incubar para llevar a cabo la reacción de biotransformación; (d) recuperar la solución de biotransformación obtenida en el paso (c); y (e) extraer la vainillina de la solución de biotransformación obtenida en el paso (d) (f) repetir físicamente el proceso de biotransformación a partir del paso (b), mediante alimentación de una solución fresca de acido ferúlico o algunas de sus sales, obteniendo repetitivamente el paso.(e).

Description

PROCESO PARA PRODUCIR VAINILLINA A PARTIR DE MICROORGANISMOS INMOVILIZADOS POR CULTIVO DE SUPERFICIE CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un proceso para producir vainillina. Más particularmente, se refiere a un proceso para producir vainillina mediante biotransformación de ácido ferúlico por microorganismos inmovilizados a partir de un cultivo de superficie, una modalidad simple del cultivo sobre sustrato sólido.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La vainillina es un compuesto ampliamente utilizado como saborizante en la industria de alimentos, como aroma en la industria cosmetologica y como precursor para la síntesis química de fármacos en la industria farmacéutica. En su mayor parte, la vainillina es obtenida por síntesis química a partir del guayacol y la lignina como es descrita por Clark, "Vanillin" en Perf Flavor ( 1990) 15 : 45-54. Sin embargo, si bien la vainillina obtenida por este método es adecuada para su uso en las industrias cosmetologica y farmacéutica, puede confrontar problemas legislativos en la industria de alimentos. Además en la actualidad, la tendencia entre los consumidores por productos de origen natural va en creciente aumento, dejando de lado los productos sintéticos. Hasta ahora la vainillina natural comercializada ha sido obtenida únicamente por extracción de las vainas de la vainilla, aunque a un costo muy elevado por lo limitado de la materia prima.

En los últimos 13 años se han hecho muchos esfuerzos para la obtención de vainillina natural por procesos biológicos alternativos, los cuales emplean microorganismos (bacterias, levaduras, hongos), células vegetales o sus sistemas enzimáticos.

En general, estos procesos biológicos involucran la biotransformacion de un precursor adecuado en vainillina. Se han señalado como precursores al eugenol, isoeugenol, curcumina, algunas resinas y al ácido ferúlico. En la mayoría de los casos los rendimientos de transformación son muy bajos como se detalla en la revisión publicada en : "H. Priefert ef al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2001) 56: 296-314". Solo en algunos casos los procesos fermentativos que se han descrito en los últimos años ofrecen rendimientos volumétricos elevados con un potencial económico atractivo.

Por ejemplo, Blandine Audras y Joeelle More, en la solicitud internacional de patente WO-9634971, describen un proceso en cultivo sumergido para la biotransformacion de ácido ferúlico a vainillina por Streptomyces setonii (cepa CNCM n° 1-1555) con el microorganismo inmovilizado en esférulas de alginato de calcio. Aquí se alcanzaron concentraciones de vainillina entre 0.65 y 0.90 g L"1 en un periodo de 3 días con un rendimiento molar de 53% a 69% con respecto al ácido ferúlico consumido. Adicionalmente se obtuvieron 0.65 g L" 1 de ácido vainillínico como subproducto de la fermentación. Una ventaja económica de este proceso es que el biocatalizador puede ser reciclado.

Juergen Rabenhorst y Rudolf Hopp, en la solicitud europea de patente EP-0405197, describen el aislamiento de una nueva cepa de Amycolatopsis sp., que en cultivo sumergido es capaz de convertir 19.92 g L" 1 de ácido ferúlico en 11.5 g L" 1 de vainillina en 32 horas con un rendimiento molar del 77.8%.

Andreas Muheim et al. en la patente estadounidense US-6,235,507B1, revelan un proceso en cultivo sumergido para la biotransformacion de ácido ferúlico en vainillina por Streptomyces setonii cepa ATCC 39116, alcanzando una concentración de vainillina de 9 g L" 1 en un periodo de 26 horas de biotransformación, con un rendimientos molar del 51 %.

Las enzimas y los genes correspondientes involucrados en la biotransformación a vainillina han sido recientemente caracterizados y utilizados para su producción (WO-9735999, US-20010014467A1). El creciente conocimiento de las enzimas involucradas en la rutas metabólicas de biotransformación ofrece nuevas oportunidades para la ingeniería metabólica y para la construcción de organismos genéticamente modificados (US-20030070188A1, US-20030092143A1, US-6,372,461B1, WO- 2004/006657A1) .

Sin embargo, el uso de organismos genéticamente modificados en la producción de vainillina puede resultar problemático por las objeciones de los consumidores a este tipo de productos, especialmente en Europa.

En diferentes publicaciones científicas se señala a la vainillina como un compuesto intermediario en las rutas metabólicas de degradación de sus precursores. Dos publicaciones se refieren concretamente a la implicación de la vainillina en la degradación del ácido ferúlico. Toms y Wood, Biochemistry (1970) 9: 337-43, cultivaron Pseudomonas sp. sobre ácido ferúlico y elucidaron la ruta de degradación. El producto final obtenido fue el ácido vainillínico por lo cual se dedujo que la vainillina es únicamente un intermediario inestable de esta vía. Sutherland ef al. , Can. J. Microbiol. (1983) 29: 1253-57, estudiaron la degradación de ácido ferúlico en cultivos de Streptomyces setonii, encontrando que este microorganismo es capaz de acumular vainillina como un producto de degradación que puede ser posteriormente convertida en ácido vainillínico, alcohol vainillínico y/o guayacol. En ambos casos, el proceso de degradación del ácido ferúlico involucra un paso único de desacetilación de este compuesto que no emplea CoA.

El ácido ferúlico empleado como substrato para la biotransformación es un compuesto muy abundante en la naturaleza al ser un componente de la pared celular de muchas especies vegetales como el arroz, el maíz, la remolacha azucarera entre otras. Sin embargo, no se encuentra en forma libre sino formando enlaces glicosídicos con las cadenas de carbohidratos de la pared celular, por lo cual para su liberación se recurren a métodos hidróliticos ya sean estos enzimáticos o alcalinos. Birgit Michelsen et al., patente estadounidense US-6,143,543 Al, describen un método enzimático para la obtención de ácido ferúlico libre. En la solicitud internacional de patente WO-2004/110975 Al se revela un proceso para la recuperación y purificación del ácido ferúlico ya en su forma libre a partir de las aguas de cocimiento del maíz conocidas como "nexayote" resultantes de la industria del nixtamal.

Los procesos de biotransformación para la obtención de vainillina hasta aquí descritos son desarrollados en cultivo sumergido. Este sistema de fermentación si bien permite llevar un control bueno de proceso, tiene costos de inversión y operación elevados debido a sus características intrínsecas y la productividad volumétrica alcanzada.

Durante los últimos años se ha despertado un gran interés por procesos en cultivo sobre sustrato sólido, o su modalidad más simple que es el cultivo de superficie, gracias un mejor desarrollo de muchos microorganismos en estos sistemas de cultivo, una velocidad específica de crecimiento alta, así como rendimientos elevados en la producción de metabolitos de importancia comercial y enzimas (Papagianni et al. , Food Technol. Biotechnol . (2001 ) 39 : 319-326).

Es por tanto necesario proveer un proceso para producir vainillina en concentraciones que resultan industrialmente interesantes mediante la biotransformación de ácido ferulico con microorganismos inmovilizados a partir de un cultivo de superficie.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En vista de lo anteriormente descrito y con el propósito de dar solución a las limitantes encontradas, es objeto de la invención ofrecer un proceso de biotransformación de ácido ferulico en vainillina, el proceso cuenta con los pasos de (a) inmovilizar un microorganismo del orden de los actinomicetos en un soporte poroso inerte compresible; (b) agregar una solución de ácido ferúlico o de alguna de sus sales; (c) incubar para llevar a cabo la reacción de biotransformación; (d) recuperar la solución de biotransformación obtenida en el paso (c) ; y (e) extraer la vainillina de la solución de biotransformación obtenida en el paso (d).

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS Los detalles característicos de la invención se describen en los siguientes párrafos en conjunto con las figuras que lo acompañan, los cuales son con el propósito de definir al invento pero sin limitar el alcance de éste.

Figura 1 muestra al actinomiceto Streptomyces setonii desarrollado y fijado en la espuma de poliuretano después de su cultivo de superficie.

Figura 2 muestra perfiles de crecimiento de Streptomyces setonii en un cultivo sumergido conforme al estado de la técnica (// = 0.22 h" 1) y en un cultivo de superficie de acuerdo al invento µ = 0.70 h" 1).

Figura 3 muestra los análisis por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) del medio de biotransformación a tres tiempos de iniciado el proceso. Se observa los productos obtenidos: 1) ácido ferúlico, 2) vainillina, 3) alcohol vainillínico, 4) ácido vainillínico, y 5) guayacol.

Figura 4 muestra la concentración máxima de vainillina alcanzada durante varios ciclos de biotransformación y la productividad volumétrica en cada uno de ellos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El invento contempla un proceso microbiológico con un alto rendimiento de biotransformación de ácido ferúlico en vainillina que comprende inicialmente el cultivo de superficie en un medio nutritivo de un microorganismo del orden de los actinomicetos, preferentemente de la familia de los estreptomicetos, preferentemente de la bacteria Streptomyces setonii ATCC 39116. El cultivo de superficie, que es una modalidad simple del cultivo sobre sustrato sólido, comprende un sistema con las siguientes características: El medio de cultivo acuoso, después haber sido inoculado con el microorganismo, es agregado a un material poroso inerte compresible, como espuma de poliuretano, en el cual es absorbido. Entre los intersticios de la espuma, el medio nutritivo inoculado va formando películas muy delgadas de aproximadamente 0.50 µ?? a aproximadamente 0.90 µ?t? de espesor. De esta manera se obtiene un sistema muy compacto con gran superficie, donde aproximadamente 1 g de espuma conteniendo entre 5 ml_ a 50 ml_ de medio, preferentemente entre 20 ml_ a 35 ml_ de medio, brinda una superficie de cultivo de 3000 cm2 a 4000 cm2, tal como se describe en la tesis doctoral de Romero-Gómez, Universidad Autónoma Metropolitana (Iztapalapa), México D. F. (2001) y en la patente mexicana MX-178723 para la producción de enzimas y otros metabólitos fúngicos. La espuma es de una densidad de 0.005 g mL 1 a 0.070 g mL"1, preferentemente de 0.015 g mL"1 a 0.025 g mL' 1, cortada en pequeños cubos de 0.2 cm a 3.0 cm de arista, preferentemente de 0.4 cm a 0.9 cm de arista, depositados en recipientes cerrados como matraces o bandejas, con una altura de lecho entre 1 cm a 10 cm, preferentemente entre 3 cm a 6 cm. El término "altura de lecho" está referido a la distancia entre la base y la cota vertical máxima alcanzada por los cubos de poliuretano depositados en el recipiente que los contiene. El sistema es incubado a una temperatura de 30 °C a 45 °C, durante 6 h a 35 h, periodo en el cual el microorganismo va creciendo como micelio sobre la superficie de las películas formadas, quedando fijado entre las estructuras del material poroso inerte compresible, tal y como se observa en la Figura 1. Al final de la fermentación, la biomasa alcanza un máximo y la fuente de carbono, generalmente glucosa, queda agotada. Los nutrientes residuales como la fuente de nitrógeno y sales del medio de cultivo en solución son entonces separados de la biomasa fijada en el soporte por compresión. El medio de cultivo acuoso residual es desechado.

Para el proceso de biotransformación, se agrega al material poroso inerte compresible conteniendo los microorganismos inmovilizados y libre del medio de cultivo residual, una solución de ácido ferúlico o de sus sales con una concentración de aproximadamente 5 g L" 1 a aproximadamente 30 g L"1, preferentemente de aproximadamente 10 g L"1 a aproximadamente 20 g L"1, con un pH entre 7 y 9, preferentemente entre 7.5 a 8.5, en un volumen de 5 mL a 50 mL, preferentemente 20 mL a 30 mL, por gramo de soporte inerte. La biotransformación es llevada a cabo a una temperatura de 30 °C a 45 °C durante un periodo de 7 h a 48 h. Al término de esta fase es consumido prácticamente todo el precursor, acumulándose en las películas acuosas del cultivo de superficie la vainillina resultante en concentraciones de aproximadamente 3 g L"1 a aproximadamente 12 g L"1, con un rendimiento molar de 70 % a 80 %. También son producidos, aunque en mucha menor cantidad ácido vainillínico, alcohol vainillínico y trazas de guayacol. Todos los productos de la biotransformación son recuperados en solución compresión. Los microorganismos inmovilizados en el soporte libre del medio acuoso, pueden ser nuevamente utilizados para un nuevo proceso de biotransformación, agregando una solución fresca de ácido ferúlico. Este proceso puede ser repetido cíclicamente entre 2 veces a 15 veces, preferentemente entre 6 veces a 10 veces, con similares rendimientos de biotransformación.

Es importante finalizar el proceso de biotransformación del invento cuando el precursor está siendo agotado porque luego se produce la degradación de la vainillina formada en ácido vainillínico y alcohol vainillínico. En otros términos, se tienen prácticamente dos etapas claramente definidas que son la de formación y la de degradación de la vainillina. Considerar este punto es muy importante si se quiere facilitar el proceso de purificación y asegurar un rendimiento que sea industrialmente interesante.

La recuperación y purificación de la vainillina se realiza mediante adsorción en carbón activado o resinas sintéticas de la familia de la amberlita, a partir de la solución obtenida del proceso de biotransformación. La vainillina adsorbida es eluida con alcohol etílico al 95 %, concentrando luego la solución resultante entre 0.05 g mL"1 a 0.5 g mL" 1, preferentemente entre 0.1 g mL" 1 a 0.4 g mL 1. A la solución concentrada, se agrega agua donde la vainillina cristaliza. El proceso de purificación descrito es particularmente importante porque en él se hace uso de un solvente que es enteramente de origen natural.

Como se ha señalado anteriormente, la combinación adecuada de un novedoso sistema de fermentación como el cultivo de superficie con condiciones exactas de fermentación y un proceso efectivo de purificación, permite la biotransformación de ácido ferúlico o sus sales en vainillina con un alto rendimiento. El sistema de fermentación está basado en el cultivo de superficie de un microorganismo del género estreptomices, preferentemente como se señaló anteriormente de la especie Streptomyces setonii, preferentemente la cepa ATCC 39116, en un medio de cultivo adecuado.

Para llevar a cabo el cultivo de superficie se utiliza un medio acuoso, conteniendo nutrientes usuales, el cual es absorbido por un material poroso inerte compresible, como la espuma de poliuretano, entre cuyos intersticios forma películas delgadas. Sobre las películas formadas el microorganismo se desarrolla como micelio. Un medio de cultivo adecuado contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas y factores de crecimiento.

Como fuente de carbono se utiliza preferentemente glucosa o maltosa en una concentración de aproximadamente 8 g L" 1 a aproximadamente 40 g L1, preferentemente de aproximadamente 15 g L" 1 a aproximadamente 30 g L 1. Como fuente de nitrógeno, factores de crecimiento y elementos traza, usualmente es empleado extracto de levadura, en una concentración de aproximadamente 1 g L"1 a aproximadamente 15 g L"1, preferentemente en una concentración de aproximadamente 3 g L" 1 a aproximadamente 10 g L'1. Adicionalmente se emplea una fuente de magnesio y una solución amortiguadora de fosfatos (de pH 7 a pH 8).

El medio de cultivo preparado es esterilizado y luego inoculado con una cepa de Streptomyces. El inoculo utilizado proviene del cultivo sumergido del microorganismo en el mismo medio de cultivo. El inoculo con una edad de 15 h a 30 h, preferentemente de 18 h a 24 h, es añadido en un volumen de 3% a 6% (v/v). Posteriormente el medio de cultivo con el inoculo es agregado a la espuma de poliuretano estéril donde es absorbido, en un volumen de 5 mL a 50 mL por gramo de espuma, preferentemente de 20 mL a 35 mL por gramo de espuma, iniciándose el crecimiento por cultivo de superficie. La fermentación es desarrollada de 30 °C a 45 °C, con una duración del periodo de crecimiento de 6 h a 35 h, preferentemente de 12 h a 24 h.

Terminada la fase de crecimiento, la espuma de poliuretano conteniendo a la biomasa que quedó inmovilizada entre sus intersticios, es comprimida dejando escurrir el medio acuoso conteniendo los nutrientes residuales. De esta manera, la espuma recobra nuevamente su capacidad absorbente, siendo alimentada a continuación con una solución de ácido ferúlico con una concentración de aproximadamente 5 g L" 1 a aproximadamente 30 g L" 1, preferentemente de aproximadamente 10 g L"1 a aproximadamente 20 g L"1, con un pH entre 7 y 9, preferentemente entre 7.5 a 8.5. Una cantidad adecuada de alimentación es de 5 mL a 50 mL por gramo de espuma, preferentemente de 20 mL a 35 mL por gramo de espuma.

La fase de biotransformación se inicia en el momento de la alimentación y tiene una duración de 7 h a 48 h, preferentemente de 15 h a 28 h, al cabo de las cuales prácticamente todo el substrato ha sido consumido y convertido en vainillina y algunos subproductos minoritarios.

Terminada la fase de biotransformación, la espuma conteniendo la biomasa inmovilizada, nuevamente es separada del medio acuoso conteniendo la vainillina por compresión. La solución recuperada arrastra una pequeña cantidad de material celular que es separada por centrifugación o filtración para luego proceder al proceso de recuperación y purificación, tal como fue descrito anteriormente. La espuma libre de medio acuoso queda nuevamente lista para iniciar un nuevo ciclo de biotransformación por alimentación de una solución fresca de ácido ferúlico. El sistema mantiene su eficiencia y velocidad de conversión a lo largo de 3 ciclos a 15 ciclos, preferentemente de 6 ciclos a 10 ciclos, al cabo de los cuales se produce una pérdida de la viabilidad celular así como un lavado paulatino de la biomasa.

Es importante señalar que únicamente la fase de desarrollo del microorganismo es llevada en condiciones de esterilidad ya que posteriormente al ser eliminado el medio de cultivo no existe posibilidad de desarrollo de microorganismos no deseados. Tampoco durante el proceso de alimentación de la solución de ácido ferúlico y recuperación de la vainillina en solución pues ambos compuestos resultan tóxicos para una gran variedad de microorganismos, pudiendo únicamente sobrevivir aquellos que cuentan con un mecanismo de desintoxicación altamente especializado como Streptomyces setonii.

La técnica descrita en nuestra invención hace referencia a la inmovilización de un actinomiceto en un soporte inerte y compresible, que permite operar cíclicamente al sistema como un proceso de biocatálisis puro, aprovechando además las ventajas fisiológicas de cierto tipo de microorganismos cuando son cultivados por fermentación sólida o de superficie. Son muchas las publicaciones que hacen referencia a las grandes diferencias fisiológicas y metabolicas de los microorganismos cuando se desarrollan en cultivo sobre sustrato sólido o en cultivo sumergido (Castilho L. y col. (2000) Biochemical Engineering Journal, 4: 239-247; Jenkins N.E. y col. (1998) Biocontrol News and Information, 19 : 21N-31N; Papagianni M. y col. (2001) Food Technology and Biotechnology, 39 : 319-326; Viniegra-González G. y col. (2002) Biochemical Engineering Journal, 3643 : 1-11).

Justamente la técnica busca aprovechar las ventajas que representa el cultivo sobre sustrato sólido en su modalidad más simple que es el cultivo de superficie para un caso de biotransformación en particular como es el de ferúlico a vainillina. La combinación adecuada de este sistema con condiciones exactas de operación y un método efectivo de purificación, permite altos rendimientos, confiriéndole ventajas adicionales frente a otros procesos conocidos. En la siguiente Tabla se presentan algunos datos numéricos de procesos en cultivo sumergido y los obtenidos por la técnica descrita : De esta Tabla se infieren las múltiples ventajas de nuestro proceso y que son : 1) una velocidad de crecimiento del microorganismo más alta, 2) un mayor rendimiento obtenido en el proceso, 3) una alta selectividad en el proceso de biotransformación al ser la vainillina casi el único producto, 4) la inmovilización de los actinomicetos permite al sistema actuar a partir del segundo ciclo como un sistema de biocatálisis puro, 5) mejor economía de proceso ya que los costos de operación relacionados con las materias primas del medio de cultivo, así como servicios auxiliares son reducidos en igual número de veces a la cantidad de ciclos de biotransformación (de 3 ciclos a 15 ciclos) en comparación a un cultivo sumergido por lotes, 6) baja complejidad técnica del proceso descrito, por lo cual los costos de inversión en instalaciones y equipos son por mucho menores a los requeridos para un proceso en cultivo sumergido, 7) el proceso de recuperación y purificación se ve altamente favorecido porque las soluciones resultantes de la biotransformación contienen vainillina casi como un único producto al ser el proceso selectivo. Además no contiene sales inorgánicas u otros nutrientes residuales del medio de cultivo como ocurre en procesos en cultivo sumergido, 8) también las características del sistema favorecen los procesos de transferencia de masa, principalmente oxígeno, por lo cual nuestro sistema es de alta eficiencia como se describe en los puntos anteriores. Otras patentes citadas (WO-9634971) dan cuenta de que actinomicetos inmovilizados sobre alginato en fermentación sumergida tienen rendimientos muy inferiores en relación a los que hemos obtenido con los actinomicetos en fermentación de superficie.

Por tanto, las claras diferencias metabólicas y fisiológicas entre los microorganismos cultivados por fermentación sumergida o fermentación sólida, las ventajas derivadas de este último sistema durante el proceso de biotransformación y sobre todo las características de operación para la biotransformación, justifican que el proceso descrito por la técnica se considere diferente a cualquier otra técnica descrita en cultivo sumergido.

También, es importante distinguir la síntesis de novo de una enzima o un metabolito a partir de un determinado sustrato, de un proceso de biotransformación o bioconversión, en el que un precursor es transformado en un producto mediante biocatálisis. La vainillina no es un producto del metabolismo natural del actinomiceto utilizado, por tanto no puede considerarse como un metabolito. La vainillina es el resultado de un proceso de desintoxicación que utiliza el microorganismo para reducir la concentración del ácido ferúlico al que es expuesto y que le resulta tóxico, transformándolo en un compuesto de menor toxicidad como es la vainillina. Por tanto, otros sistemas descritos para la síntesis de novo que emplean el cultivo de superficie en soportes absorbentes, no fermentables y compresibles, como el descrito en la patente mexicana MX- 178723, tienen propósitos diferentes a los descritos por la técnica, como el de brindar un medio químicamente definido que garantice la homogeneidad en los rendimientos y facilite la recuperación de los productos (metabolitos o enzimas) ya que esta tarea se dificulta mucho en los medios sólidos convencionales. El propósito de nuestra técnica es inmovilizar un actinomiceto en un soporte compresible para que el sistema actúe como un sistema de biocatálisis puro. La inmovilización es posible gracias al crecimiento miceliar que describen los actinomicetos y que les permite quedar adheridos como un entramado entre los intersticios del soporte (FIG. 1). Además, las características del soporte permiten drenar la solución de bioconversión y alimentar una solución fresca de ácido ferúlico sin que se dañe el entramado de actinomicetos, repitiendo el proceso a lo largo de varios ciclos de biocatálisis, ventaja fundamental de nuestra técnica. Era de esperar que ante la falta de nutrientes y la exposición constante de los actinomicetos al ácido ferúlico, compuesto que le resulta tóxico, perdieran rápidamente viabilidad y por tanto capacidad catalítica.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN La invención ahora será descrita con respecto a los ejemplos siguientes, los cuales son únicamente con el propósito de representar la manera de llevar a cabo la implementación de los principios del invento. Los ejemplos siguientes no intentan ser una representación exhaustiva de la invención, ni intentan limitar el alcance de esta.

Ejemplo 1 Se prepararon matraces de 250 mL conteniendo 1 g de espuma de poliuretano cortada en pequeños cubos. Se les agregó 20 mL de medio de cultivo previamente inoculados con 0.8 mL de un precultivo de Streptomyces setonii ATCC 39116, crecido en un matraz agitado a 37 °C, a 190 min"1, por 20 h . El medio de cultivo contenía 10 g L"1 de glucosa, 4 g L"1 de extracto de levadura, 4 g L" 1 Na2HP04, 1 g L" 1 de KH2P04, 0.2 g L"1 de MgS04 · 7H20, 0.2 g L 1 NaCI y 0.05 g L"1 de CaCI2 · H20, con un pH de 7.2. El cultivo de superficie en los matraces fue desarrollado a 37 °C durante 18 h, al cabo de las cuales la glucosa fue agotada. Luego de este periodo, los cubos de espuma de poliuretano fueron comprimidos dentro de una jeringa liberando el medio de cultivo residual que fue posteriormente desechado. Para dar inicio a la biotransformacion se agregó sobre la biomasa inmovilizada en la espuma de poliuretano y colocada nuevamente en los matraces, 20 mL de una solución de 10 g L"1 de ácido ferúlico a pH 7.2.

La biotransformacion fue desarrollada a 37 °C durante 20 h al cabo de las cuales la espuma fue presionada, liberando la solución de biotransformacion que fue recuperada con un contenido de 4.3 g L" 1 de vainillina, 0.7 g L"1 de ácido ferúlico, 0.12 g L"1 de ácido vainillínico, 0.09 g de alcohol vainillínico y trazas de guayacol. Se calculó un rendimiento molar de conversión en vainillina del 60 %. Los cubos con los microorganismos inmovilizados fueron devueltos a los matraces, agregando 20 mL de una solución fresca de 10 g L" 1 de ácido ferúlico, manteniendo los matraces a 37 °C durante 24 h. La solución de biotransformacion recuperada tuvo un contenido de 6.1 g L"1 de vainillina, 0.39 g L" 1 de ácido ferúlico, 0.06 g L" 1 de ácido vainillínico, 0.04 g L 1 de alcohol vainillínico y trazas de guayacol. El rendimiento de biotransformacion fue del 81 %. Se repitieron adicionalmente 3 ciclos de biotransformacion bajo las mismas condiciones de temperatura y durante el mismo periodo obteniendo resultados similares al anterior. En los 5 ciclos de biotransformacion se colectaron por matraz aproximadamente un total de 90 mL de solución.

Ejemplo 2 Se prepararon bandejas con tapa de 12 L conteniendo 25 g de espuma de poliuretano cortada en pequeños cubos. Se les agregó 500 mL de medio de cultivo previamente inoculados con 20 mL de un precuitivo de Streptomyces setonii ATCC 39116, crecido en un matraz agitado a 37 °C, a 190 min"1, por 20 h. El medio de cultivo contenía 15 g L"1 de glucosa, 6 g L"1 de extracto de levadura, 4 g L" 1 Na2HP04, 1 g L" 1 de KH2P04, 0.2 g L"1 de MgS04 · 7H20, 0.2 g L'1 NaCI y 0.05 g L"1 de CaCI2 · H20, con un pH de 7.2. El cultivo de superficie en las bandejas fue desarrollado a 37 °C durante 24 h, al cabo de las cuales la glucosa fue agotada. Luego de este periodo, los cubos de espuma de poliuretano fueron comprimidos dentro de las bandejas, liberando el medio de cultivo residual que fue desechado. Luego se agregó 500 mL de una solución de 10 g L" 1 de ácido ferúlico a pH 7.2.

La biotransformacion fue desarrollada a 37° C durante 24 h al cabo de las cuales se recuperó de manera similar al ejemplo anterior la solución de biotransformacion conteniendo 4.71 g L"1 de vainillina, 0.63 g L" 1 de ácido ferúlico, 0.07 g L" 1 de ácido vainillínico, 0.06 g de alcohol vainillínico y trazas de guayacol. Se calculó un rendimiento molar de conversión en vainillina del 64 %. En un segundo ciclo se agregó nuevamente 500 mL de una solución fresca de 10 g L"1 de ácido ferúlico, manteniendo las bandejas a 37 °C durante 24 h. La solución de biotransformacion recuperada tuvo un contenido de 5.87 g L"1 de vainillina, 0.24 g L"1 de ácido ferúlico, 0.14 g L"1 de ácido vainillínico, 0.10 g L" 1 de alcohol vainillínico y 0.04 g de guayacol. El rendimiento de conversión fue del 77 %. Se repitieron adicionalmente 5 ciclos de biotransformacion bajo las mismas condiciones de temperatura y durante el mismo periodo obteniendo resultados similares al anterior. En los 7 ciclos de biotransformación se colectaron por bandeja aproximadamente un total de 3.2 L de solución conteniendo 5.6 g L" 1 de vainillina. Ver Figura 4.

Para la recuperación y purificación de la vainillina, a la solución de biotransformación se agregaron 100 g de carbón activado dejando en agitación 5 h, al cabo de las cuales el sobrenadante fue desechado. La desorción fue llevada a cabo con 100 mL de etanol al 95 % bajo agitación durante 3 h. La solución etanólica fue concentrada por evaporación, reduciendo su volumen a 30 mL. A continuación se agregaron 30 mL de agua, dejando en reposo 12 horas, al cabo de las cuales la vainillina cristalizó.

Ejemplo 3 En otra modalidad de la invención, se emplearon 150 g de amberlita XAD-4 en lugar del carbón activado empleado en el ejemplo 2, continuando los mismos pasos hasta alcanzar la cristalización de la vainillina.

Las ventajas del invento con respecto al estado de la técnica se pueden resumir en los siguientes puntos: ¦ El proceso permite la biotransformación de ácido ferúlico y la acumulación de vainillina en concentraciones que resultan industrialmente interesantes (de aproximadamente 3 g L 1 a aproximadamente 12 g L"1). Ver Figura 4. Gracias a las ventajas intrínsecas del cultivo de superficie, la velocidad específica de crecimiento de Streptomyces setonii cepa ATCC 39116 es incrementada hasta en tres veces en comparación a su crecimiento en cultivo sumergido, reduciendo el tiempo para el desarrollo del microorganismo. Ver Figura 2.

El proceso de conversión en comparación a otros procesos en cultivo sumergido es selectivo ya que la vainillina es casi un único producto de biotransformación. El sistema utilizado permite fijar a los microorganismos en un soporte poroso inerte compresible por lo cual es posible su reutilización en un nuevo proceso de biotransformación (ciclo) por alimentación fresca de una solución de ácido ferúlico. Los costos de operación relacionados con las materias primas del medio de cultivo, así como servicios auxiliares son reducidos en igual número de veces a la cantidad de ciclos de biotransformación (de 3 ciclos a 15 ciclos) en comparación a un cultivo sumergido por lotes. El proceso del invento es de baja complejidad técnica, por lo cual los costos de inversión en instalaciones y equipos son por mucho menores a los requeridos para un proceso en cultivo sumergido. El proceso de recuperación y purificación se ve altamente favorecido porque las soluciones resultantes de la biotransformación contienen vainillina casi como un único producto al ser el proceso selectivo. Además no contiene sales inorgánicas u otros nutrientes residuales del medio de cultivo como ocurre en procesos en cultivo sumergido. En general el escalamiento industrial de los procesos en cultivo de superficie sobre sustrato sólido resulta más sencillo que los procesos en cultivo sumergido.

Basado en las realizaciones descritas anteriormente, se contempla que las modificaciones de los ambientes de realización descritos, así como los ambientes de realización alternativos serán considerados evidentes para una persona experta en el arte de la técnica bajo la presente descripción. Es por lo tanto, contemplado que las reivindicaciones abarcan dichas modificaciones y alternativas que estén dentro del alcance del presente invento o sus equivalentes.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES Un proceso de biotransformacion de ácido ferúlico en vainillina caracterizado porque comprende los pasos de: (a) inmovilizar un microorganismo del orden de los actinomicetos en un soporte poroso inerte compresible; (b) agregar una solución de ácido ferúlico o de alguna de sus sales; (c) incubar para llevar a cabo la reacción de biotransformacion; (d) recuperar la solución de biotransformacion obtenida en el paso (c); y (e) extraer la vainillina de la solución de biotransformacion obtenida en el paso (d). El proceso de biotransformacion de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso (a) de inmovilizar un microorganismo del orden de los actinomicetos comprende los pasos de: (a) adicionar un inoculo de dicho microorganismo a un medio de cultivo líquido; (b) adicionar el medio de cultivo inoculado a un soporte poroso inerte compresible para formar películas entre los intersticios de dicho soporte; (c) crecer al microorganismo en el soporte; y (d) eliminar el medio de cultivo residual de dicho soporte poroso inerte compresible. El proceso de biotransformacion de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el microorganismo del orden de los actinomicetos es del género de Streptomyces. El proceso de biotransformación de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el microorganismo es Streptomyces setonii, particularmente la cepa Streptomyces setonii ATCC 39116. El proceso de biotransformación de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el inoculo del microorganismo se crece en agitación a 190 min" 1, por un periodo de tiempo de 15 h a 30 h, a 37°C. El proceso de biotransformación de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el volumen del inoculo que se adiciona al medio de cultivo es del 3 % al 6 % del volumen total del medio. El proceso de biotransformación de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el medio de cultivo líquido comprende: glucosa o maltosa en un rango de concentración entre 8 g L" 1 a 40 g L" 1; y extracto de levadura en un rango de concentración entre 1 g L" 1 a 15 g L"1. El proceso de biotransformación de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el soporte poroso inerte compresible es espuma de poliuretano. El proceso de biotransformación de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el volumen del medio de cultivo inoculado que se adiciona al soporte poroso inerte compresible es de 5 mL por gramo de soporte a 50 mL por gramo de soporte, preferentemente de 20 mL por gramo de soporte a 35 mL por gramo de soporte. 10. El proceso de biotransformación de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la altura de lecho del soporte poroso inerte compresible es de 1 cm a 10 cm, preferentemente de 3 cm a 6 cm. 11. El proceso de biotransformación de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el paso (c) de crecer al microorganismo en el soporte se lleva a cabo a una temperatura de 30 °C a 45 °C por un periodo de tiempo de 6 h a 35 h. 12. El proceso de biotransformación de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el paso (d) de eliminar el medio de cultivo residual se lleva a cabo mediante la compresión del soporte poroso inerte compresible. 13. El proceso de biotransformación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la solución de ácido ferúlico o de alguna de sus sales del paso (b) tiene una concentración de 5 g L" 1 a 30 g L' 1, preferentemente de 10 g L'1 a 20 g L" 1. 14. El proceso de biotransformación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la solución de ácido ferúlico o de alguna de sus sales del paso (b) tiene valores de pH entre 7 y 9, preferentemente valores de pH entre 7.5 y 8.5. 15. El proceso de biotransformación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tiempo de incubación para la reacción de biotransformación del paso (c) es de 7 h a 48 h, preferentemente de 15 h a 28 h. El proceso de biotransformacion de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso (d) de recuperar la solución de biotransformacion se lleva a cabo mediante la compresión del soporte poroso inerte compresible. 17. El proceso de biotransformacion de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los pasos (b), (c) y (d) se llevan a cabo entre 2 veces a 15 veces de forma cíclica. 18. El proceso de biotransformacion de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso (e) de extraer la vainillina de la solución de biotransformacion comprende los pasos de: (a) tratar la solución de biotransformacion con carbón activado o resinas sintéticas; (b) eluir la vainillina adsorbida en el carbón activado o en las resinas sintéticas con una solución alcohólica; (c) concentrar por evaporación la vainillina eluída en la solución alcohólica; y (d) cristalizar la vainillina en agua. 19. El proceso de biotransformacion de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque las resinas sintéticas del paso (a) se seleccionan de la familia de la amberlita. 20. El proceso de biotransformacion de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la solución alcohólica del paso (b) comprende una solución de alcohol etílico al 95%. El proceso de biotransformación de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la etapa (c) de concentrar por evaporación la vainillina eluída en la solución alcohólica, se lleva a cabo a una temperatura entre 30 °C a 40 °C y a presión reducida.