DE69930071T2 - Fermentations-Verfahren zur Herstellung von Erythritol mittels eines Mutanten von Candida sp. mit hoher Salztoleranz - Google Patents

Fermentations-Verfahren zur Herstellung von Erythritol mittels eines Mutanten von Candida sp. mit hoher Salztoleranz Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Fermentationsverfahren zur Herstellung von Erythritol mit hoher Produktivität mit einer salztoleranten Mutante von Candida sp., genauer [Candida magnoliae SR101: KCCM-10160], zur Herstellung von Erythritol unter optimalen Fermentationsbedingungen für die Herstellung maximaler Mengen Erythritol durch Optimierung der Kulturmilieubedingungen, wie Mediumzusammensetzung, pH, Temperatur, Belüftungsrate und Rührgeschwindigkeit.
  • 2. Beschreibung des Standes der Technik
  • Erythritol, ein Zuckeralkohol mit vier Kohlenstoffatomen, ist ein natürlich auftretender Stoff und ist weit verbreitet in der Natur. Wie die meisten anderen Polyole ist es ein Metabolit oder eine Speicherverbindung in Seetang und Muscheln. Früchte wie Melonen, Trauben oder Pfirsiche enthalten auch Erythritol. Da es häufig von Bakterien, Pilzen und Hefe hergestellt wird, tritt Erythritol regelmäßig in fermentierten Nahrungsmittelsystemen wie Weinen oder Bieren und vergärten Gemüsen wie Sojasoße oder der orientalischen Misobohnenpaste auf.
  • Erythritol ist ein mäßig süßes Quellmittel mit 60-70% der Süße von Saccharose in einer 10%-igen Lösung. Seine hohe negative Lösungswärme stattet das kristalline Material mit einem stark kühlenden Effekt aus. Da es einen Geschmack hat, der Saccharose sehr nahe kommt, ohne bitteren Nachgeschmack, ist es ideal zur Verbesserung des Geschmacks einer Kombination mit starken Süßstoffen wie Aspartam.
  • Erythritol hat, da es ein kleines Molekül ist, stark kolligative Eigenschaften, d.h. einen starken Schmelzpunkt erniedrigenden und Siedepunkt erhöhenden Effekt sowie einen hohen osmotischen Druck. In Verbindung mit seiner niedrigen Hygroskopizität und Viskosität in Lösung ist es sehr nützlich, um die Wasseraktivität von Nahrungsmitteln herabzusetzen und zu steuern.
  • Eine Erythritolherstellung aus seinen natürlichen Quellen wie Früchten und Gemüsen ist unpraktisch aufgrund der relativ geringen Mengen. Erythritol kann durch Reduktion von Meso-Tartrat, Oxidation und Reduktion von 4,6-O-Ethyliden-D-Glucose, Hydrolyse von Dialdehydstärke oder Addition von Wasserstoff chemisch hergestellt werden. Da die Erythritolherstellung durch chemische Methoden sich als sehr teuer erwiesen hat, ist es lohnenswert, ein alternatives Verfahren zur effektiven Herstellung von Erythritol unter Verwendung von Mikroorganismen zu erforschen.
  • Erythritol kann durch mikrobielle Methoden mit den osmophilen Hefen hergestellt werden, insbesondere mit Spezies der Gattung Torulopsis, wie T. magnoliae, T. veratilis, und T. candida; Endomycopsis chodati; Hansenula supelliculsa, Pichia miso; Monilliella tomentosa var. pollinis; Trigonopsis variabilis; Trichosporonoides; Candida zeylanoides und Aureobasidium. Manche Bakterien wie Leuconostoc oenos können auch Erythritol herstellen. Monilliella tomentosa var. pollinis stellte Erythritol in einem Medium, das 35,7% Glucose enthielt, mit einer Ausbeute von 45,6% her. Eine Erythritolherstellung unter Verwendung dieses Stammes war aufgrund von Nebenprodukten wie Glyzerin und Ribitol nicht auf industrielle Maßstäbe anwendbar. Eine industrielle Produktion von Erythritol wurde mit einer Mutante von Aureobasidium durchgeführt. Die Mutante wurde in einer gemeinsamen Studie von Nikken Chemical und dem National Research Institute of Japan isoliert und entwickelt. Die Mutante produzierte Erythritol mit einer Ausbeute von 47,6% in einem Medium, das 22,5% Glucose enthielt, und einer Volumenproduktivität von 2 g/l·h. Jedoch hatte die Kultur mit diesem Pilz mehr Schwierigkeiten als die mit Hefe. Ein Verfahren zur Herstellung von Erythritol unter Verwendung von Candida zeylanoides wird in Hattori & Suzuki (1974) Agri. Biol. Chem. 38, 581-586 beschrieben.
  • Daher wurde bei dieser Erfindung ein Wildhefestamm von Candida sp. aus der Natur isoliert und durch Behandlung mit EMS (Ethylmethanolsulfonat) mutiert. Eine der Mutanten hatte gegenüber dem wilden Stamm bezüglich der Erythritolausbeute aus Glucose, der Volumenproduktivität und der Salztoleranz bessere Eigenschaften. Unter Verwendung der Mutante von Candida sp. wurden die Kulturmilieubedingungen zur Herstellung maximaler Mengen an Erythritol optimiert.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, neue mutante Zellen von Candida magnoliae SR101, die beim Korean Culture Center of Microorganism mit der Hinterlegungsnummer KCCM-10160 am 21. Mai 1999 nach dem Budapester Vertrag hinterlegt wurden, zur Herstellung von Erythritol mit hoher Produktivität zur Verfügung zu stellen.
  • Das weitere Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, das optimale Fermentationsverfahren für die Herstellung maximaler Mengen an Erythritol unter der Verwendung von mutanten Zellen von Candida magnoliae SR101, die beim Korean Culture Center of Microorganism mit der Hinterlegungsnummer KCCM-10160 hinterlegt wurden, zur Verfügung zu stellen, das die Schritte umfaßt:
    • i) Fermentieren von Monosaccharid- oder Disaccharidmedium mit Zellen unter Steuern der folgenden Fermentationsbedingungen: a) das Medium für die Herstellung maximaler Mengen an Erythritol setzt sich aus 10-50 (w/v)% Glucose, 0,2-2,0 (w/v)% Hefeextrakt, 0,1-10 (w/v)% KH2PO4, 0,1-5,0 (w/v)% (NH4)2SO4 und 0,01-1,0 (w/v)% MgSO4·7H2O zusammen, b) der pH-Wert des Kulturmediums beträgt 6-8, c) die Kultivierungstemperatur beträgt 26-30 °C, d) die Belüftungsrate beträgt 0,75-2,0 Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute, e) die Rührgeschwindigkeit beträgt 300-1200 U.p.M.,
    • ii) eine Nährlösung, die KCl enthält, die kontinuierlich oder unterbrochen der Kulturbrühe während der Phase der Erythritolherstellung zugeführt wird, so daß diese 2-10% von dessen Konzentration enthält,
    • iii) Entfernen von Zellen aus dem Fermentationsmedium und
    • iv) Trennen und Gewinnen von Erythritol aus dem Fermentationsmedium aus Stufe iii).
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Erythritol mit einer hohen Ausbeute und einer hohen Volumenproduktivität unter Verwendung mutanter Zellen von Candida magnoliae durch Optimierung der Kulturbedingungen.
  • Die mutanten Zellen, die für die vorliegende Erfindung verwendet wurden, werden mit dem folgenden Verfahren isoliert.
  • Candida sp. von einem Kamm wurde durchmustert. Ein Stück Kamm wurde in das Medium, das 40% Glucose und 1,0% Hefeextrakt enthält, überführt und bei 30 °C inkubiert. Die Brühe wurde verdünnt und bei 30 °C auf einer Agar-Platte, die 20% Glucose, 1,0% Hefeextrakt und 2% Agar enthielt, inkubiert. Danach wurden die erhaltenen Kulturen in Fermentationsmedium inkubiert, welches aus 10% Glucose und 1 % Hefeextrakt bestand, die Kulturbrühe wurde zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und der Überstand zur Bestimmung von Erythritol analysiert. Ein Stamm, der viel Erythritol herstellte, wurde für die Erythritolherstellung ausgewählt. Der Stamm wurde von Microcheck Co. als Candida magnoliae identifiziert.
  • Der Stamm wurde in Wachstumsmedium, das 2,0% Glucose, 1,0% Hefeextrakt und 1,0% Pepton enthielt, inkubiert. Nach dem Wachstum wurde die Brühe auf eine Agar-Platte ausgestrichen, die 10% Glucose, 0,8% Hefeextrakt, 0,3% Pepton und 2,0% Agar enthielt, und dann wurden die erhaltene Kolonie in Sporulationsmedium, das 0,1 % Glucose, 1,0% Hefeextrakt und 2,0% Agar enthielt, überführt. Die gebildete Spore wurde durch autoklaviertes destilliertes Wasser geerntet und durch Zugabe von 10 mM 2-Mercaptoethanol für 30 Min. und Lyticasebehandlung mit 0,5 mg/ml für 4 Stunden selektiert.
  • Die selektierte Spore wurde mit EMS (Ethylmethanolsulfonat) behandelt und auf dem Medium, das 30% Glucose, 18% KCl, 0,1 % Hefeextrakt und 2% Agar enthielt, inkubiert. Einzelkolonien wurden als schnellwachsende Mutanten für die Selektion von Mutanten mit hoher Salztoleranz selektiert. Die selektierte Kolonie wurde zur Untersuchung der Erythritolherstellungsleistung im Schüttelkolben in das Fermentationsmedium überführt.
  • Nach Inkubation bei 30 °C und 240 U.p.M. für 72 Stunden wurde eine Mutante, die viel Erythritol herstellt, selektiert. Schließlich wurde eine wachsende Kolonie isoliert und als mutante Zellen erhalten und als herstellender Stamm in dieser Erfindung verwendet. Diese mutanten Zellen wurden beim Korean Culture Center of Microorganism mit der Hinterlegungsnummer KCCM-10160 nach dem Budapester Vertrag hinterlegt.
  • Das folgende ist ein Fermentationsverfahren zur Herstellung von Erythritol unter Verwendung mutanter Zellen.
  • Impfkultur
  • Die Zellen von Candida magnoliae (KCCM-10160) wurden in einem 250 ml Kolben, der 40-60 ml Wachstumsmedium (2,0% Glucose, 1,0% Pepton, 1,0% Hefeextrakt) enthielt, bei 30 °C und 240 U.p.M. für 48 Stunden inkubiert, und diese Impfkultur wurde in einen 250 ml Kolben oder einen 5 l Fermenter zur Herstellung von Erythritol in eine Hauptkultur überführt.
  • Hauptkultur
  • Versuche im Kolben mit Fermentationsmedium wurden bei 26-30 °C und 300-1200 U.p.M. für 60-100 Stunden durchgeführt. Das Fermentationsmedium bestand aus 10-50% Glucose als Kohlenstoffquelle und 0,2-2,0% Hefeextrakt, 0,1-5,0% (NH4)2SO4, 0,1-10% KH2PO4 und 0,01-1,0% MgSO4·7H2O wurden als anorganische Quellen verwendet. Für Versuchszwecke wurde die Glucosekonzentration eingestellt. Batch- und Fed-Batch-Kulturverfahren in dem Fermenter wurden bei 26-30 °C und einem Anfangs-pH-Wert von 7 durchgeführt. Die Belüftungsrate war im Bereich von 0,75-2,0 vvm. Die Rührgeschwindigkeit betrug 300-1200 U.p.M. Das Fed-Batch-Kulturverfahren wurde mit 5-10% Glucose unter kontinuierlicher oder unterbrochener Zugabe von 10-40% Glucose durchgeführt.
  • Das Fermentationsverfahren ist bevorzugt ein Fed-Batch-Verfahren. Nachdem Glucose vollständig aus dem Medium verbraucht ist, wird die Menge an Erythritol durch High Performance Liquid Chromatography mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das Trockengewicht der Zellen wird mit Hilfe einer Kalibrierungskurve, die aus dem Verhältnis zwischen optischer Dichte bei 600 nm und dem Trockengewicht von Zellen erstellt wurde, abgeschätzt. Glucose wird durch die Dinitrosalicylsäure-Methode gemessen.
  • Die gemessene Ausbeute an Erythritol beträgt 35-55% des Glucoseverbrauchs und die Volumenproduktivität beträgt 0,7 g/l·h.
  • Schließlich wird das Fermentationsmedium zur Entfernung von Zellen und anderen Rückständen zentrifugiert und der Überstand wird zur Gewinnung von Erythritol filtriert und dialysiert.
  • Die vorliegende Erfindung kann durch die folgenden Beispiele genauer erklärt werden.
  • (BEISPIEL I) Isolierung von mutanten Zellen
  • Candida sp. von einem Kamm wurde durchmustert. Ein Stück Kamm wurde in das Medium, das 40% Glucose und 1,0% Hefeextrakt enthält, überführt und bei 30 °C inkubiert. Die Brühe wurde verdünnt und bei 30 °C auf einer Agar-Platte, die 20% Glucose, 1,0% Hefeextrakt und 2% Agar enthielt, inkubiert. Danach wurden die erhaltenen Kulturen in Fermentationsmedium inkubiert, welches aus 10% Glucose und 1 % Hefeextrakt bestand, die Kulturbrühe wurde zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und der Überstand zur Bestimmung von Erythritol analysiert. Ein Stamm, der viel Erythritol herstellte, wurde für die Erythritolherstellung ausgewählt. Der Stamm wurde von Microcheck Co. als Candida magnoliae identifiziert.
  • Dieser Stamm wurde bei 30 °C für 48 Stunden auf Wachstumsmedium, das 2,0% Glucose, 1,0% Hefeextrakt und 1,0% Pepton enthielt, inkubiert. Nach dem Wachstum wurde die Brühe auf eine Agar-Platte, die 10% Glucose, 0,8% Hefeextrakt, 0,3% Pepton und 2,0% Agar enthielt, ausgestrichen, bei 30 °C für 36 Stunden, und die dann erhaltene Kolonie wurde in ein Sporulationsmedium überführt, das 0,1% Glucose, 1,0% Hefeextrakt und 2,0% Agar enthielt, und Sporen wurden bei 4 °C nach 4 Tagen gebildet. Die gebildeten Sporen wurden mit autoklaviertem destilliertem Wasser geerntet und durch Zugabe von 10 mM 2-Mercaptoethanol für 30 Min. und Lyticasebehandlung mit 0,5 mg/ml (100.000 Units) für 4 Stunden selektiert. Die selektierten Sporen wurden für 30 Min. mit EMS behandelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5% Thiosulfat beendet. Die Spore wurde auf dem Medium, das 30% Glucose, 18% KCl, 0,1% Hefeextrakt und 2% Agar enthielt, zur Selektion einer Mutante mit hoher Salztoleranz inkubiert. Eine Einzelkolonie wurde als schnellwachsende Mutanten isoliert. Die selektierten Kolonien wurden zur Untersuchung der Erythritolherstellungsleistung in 50 ml Fermentationsmedium in einem 250 ml Schüttelkolben überführt. Nach Inkubation bei 30 °C und 240 U.p.M. für 72 Stunden wurde eine Mutante, die große Mengen an Erythritol herstellt, selektiert. Schließlich wurde eine wachsende Kolonie isoliert und als mutante Zellen erhalten und als herstellender Stamm in dieser Erfindung verwendet. Die mutanten Zellen wurden beim Korean Culture Center of Microorganism mit der Hinterlegungsnummer KCCM-10160 hinterlegt.
  • (BEISPIEL II) Erythritolherstellung durch Fermentation mutanter Zellen
  • Die mutanten Zellen von Candida magnoliae (KCCM-10160) wurden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (2,0% Glucose, 1,0% Pepton, 1,0% Hefeextrakt) enthielt, bei 30 °C und 240 U.p.M. für 48 Stunden inkubiert und diese Impfkultur wurde zur Erythritolherstellung in einen 250 ml Kolben überführt. Versuche in Kolben mit Fermentationsmedium wurden bei 28 °C, anfänglichem pH-Wert von 7 und 240 U.p.M. für 84 Stunden durchgeführt. Das Fermentationsmedium bestand aus 25% Glucose als Kohlenstoffquelle und 0,5% Hefeextrakt, 0,2% (NH4)2SO4, 0,5% KH2PO4 und 0,04% MgSO4·7H2O.
  • Nach 84 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 10% Glucose durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 25 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,30 g/l·h.
  • (VERGLEICHSBEISPIEL I)
  • Erythritolherstellung durch Fermentation von Wildtyp-Zellen
  • Die Wildtyp-Zellen von Candida magnoliae wurden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (2,0% Glucose, 1,0% Pepton, 1,0% Hefeextrakt) enthielt, bei 30 °C und 240 U.p.M. für 48 Stunden inkubiert und diese Impfkultur wurde zur Erythritolherstellung in einen 250 ml Kolben überführt. Experimente im Kolben mit Fermentationsmedium wurden bei 28 °C, einem anfänglichen pH-Wert von 7 und 240 U.p.M. für 108 Stunden durchgeführt. Das Fermentationsmedium bestand aus 25% Glucose als Kohlenstoffquelle und 0,5% Hefeextrakt, 0,2% (NH4)2SO4, 0,5% KH2PO4 und 0,04% MgSO4·7H2O.
  • Nach 108 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol aus 10% Glucose durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 17 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,16 g/l·h.
  • (BEISPIEL III) Der Einfluß des Anfangs-pH-Werts auf die Erythritolherstellung
  • Die mutanten Zellen von Candida magnoliae (KCCM-10160) wurden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (2,0% Glucose, 1,0% Pepton, 1,0% Hefeextrakt) enthielt, bei 30 °C und 240 U.p.M. für 48 Stunden kultiviert und diese Impfkultur wurde zur Erythritolherstellung in einen 250 ml Kolben überführt. Versuche im Kolben mit Fermentationsmedium wurden bei 28 °C und 240 U.p.M. für 84 Stunden durchgeführt. Das Fermentationsmedium bestand aus 25% Glucose als Kohlenstoffquelle und 0,5% Hefeextrakt, 0,2% (NH4)2SO4, 0,5% KH2PO4 und 0,04% MgSO4·7H2O. Der Einfluß des pH-Werts auf die Erythritolherstellung wurde untersucht.
  • Nach 84 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei einem anfänglichen pH-Wert von 5,0 durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 21,4 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,25 g/I·h.
  • Nach 84 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei einem anfänglichen pH-Wert von 6,0 durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 23,6 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,28 g/l·h.
  • Nach 84 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei einem anfänglichen pH-Wert von 7,0 durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 25,0 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,30 g/l·h.
  • Nach 84 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei einem anfänglichen pH-Wert von 5,0 durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 18,6 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,22 g/l·h.
  • (BEISPIEL IV) Der Einfluß der Temperatur auf die Erythritolherstellung
  • Die mutanten Zellen von Candida magnoliae (KCCM-10160) wurden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (2,0% Glucose, 1,0% Pepton, 1,0% Hefeextrakt) enthielt, bei 30 °C und 240 U.p.M. für 48 Stunden kultiviert, und diese Impfkultur wurde zur Erythritolherstellung in einen 250 ml Kolben überführt. Versuche im Kolben mit Fermentationsmedium wurden bei einem anfänglichen pH-Wert von 7,0 und 240 U.p.M. für 84 Stunden durchgeführt. Das Fermentationsmedium bestand aus 25% Glucose als Kohlenstoffquelle und 0,5% Hefeextrakt, 0,2% (NH4)2SO4, 0,5% KH2PO4 und 0,04% MgSO4·7H2O. Der Einfluß der Temperatur auf die Erythritolherstellung wurde untersucht.
  • Nach 84 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 26 °C durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 15,0 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,18 g/l·h.
  • Nach 84 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 28 °C durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 25,0 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,30 g/l·h.
  • Nach 84 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 30 °C durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 20,7 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,25 g/l·h.
  • (BEISPIEL V) Der Einfluß der KCl-Konzentration auf die Erythritolherstellung
  • Die mutanten Zellen von Candida magnoliae (KCCM-10160) wurden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (2,0% Glucose, 1,0% Pepton, 1,0% Hefeextrakt) enthielt, bei 30 °C und 240 U.p.M. für 48 Stunden kultiviert und diese Impfkultur wurde zur Erythritolherstellung in einen 250 ml Kolben überführt. Versuche im Kolben mit Fermentationsmedium wurden bei 28 °C und 240 U.p.M. für 84 Stunden durchgeführt. Das Fermentationsmedium bestand aus 25% Glucose als Kohlenstoffquelle und 0,5% Hefeextrakt, 0,2% (NH4)2SO4, 0,5% KH2PO4 und 0,04% MgSO4·7H2O. Der Einfluß der KCl-Konzentration auf die Erythritolherstellung wurde untersucht.
  • Nach 84 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 0,0% KCl durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 25,0 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,30 g/l·h.
  • Nach 84 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 1,0% KCl durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 25,2 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,30 g/l·h.
  • Nach 84 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 3,0% KCl durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 23,3 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,28 g/I·h.
  • Nach 84 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 5,0% KCl durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 27,6 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,33 g/I·h.
  • Nach 84 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 6,0% KCl durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 26,5 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,32 g/I·h.
  • (VERGLEICHSBEISPIEL II)
  • Der Einfluß der KCl-Konzentration auf die Herstellung von Erythritol unter Verwendung von Wildtyp-Zellen
  • Die Wildtyp-Zellen von Candida magnoliae wurden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (2,0% Glucose, 1,0% Pepton, 1,0% Hefeextrakt) enthielt, bei 30 °C und 240 U.p.M. für 48 Stunden inkubiert und diese Impfkultur wurde zur Erythritolherstellung in einen 250 ml Kolben überführt. Experimente im Kolben mit Fermentationsmedium wurden bei 28 °C und 240 U.p.M. für 108 Stunden durchgeführt. Das Fermentationsmedium bestand aus 25% Glucose als Kohlenstoffquelle und 0,5% Hefeextrakt, 0,2% (NH4)2SO4, 0,5% KH2PO4 und 0,04% MgSO4·7H2O. Der Einfluß der KCl-Konzentration auf die Erythritolherstellung wurde untersucht.
  • Nach 84 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 0,0% KCl durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 17,0 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,16 g/l·h.
  • Nach 108 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 1,0% KCl durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 24,0 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,22 g/l·h.
  • Nach 108 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 2,0% KCl durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 23,7 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,26 g/l·h.
  • Nach 108 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 3,0% KCl durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 14,2 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,13 g/l·h.
  • (BEISPIEL VI) Die Erythritolherstellung entsprechend der Änderung der Belüftung in dem Fermenter
  • Die mutanten Zellen von Candida magnoliae (KCCM-10160) wurden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (2,0% Glucose, 1,0% Pepton, 1,0% Hefeextrakt) enthielt, bei 30 °C und 240 U.p.M. für 48 Stunden kultiviert und diese Impfkultur wurde zur Erythritolherstellung in einen 5 l Fermenter überführt. Versuche im Fermenter mit Fermentationsmedium wurden bei 28 °C, einem Anfangs-pH-Wert von 7,0 und 500 U.p.M. durchgeführt. Das Fermentationsmedium bestand aus 25% Glucose als Kohlenstoffquelle und 0,5% Hefeextrakt, 0,2% (NH4)2SO4, 0,5% KH2PO4, 5,0% KCl und 0,04% MgSO4·7H2O. Der Einfluß der Belüftungsrate auf die Erythritolherstellung wurde untersucht.
  • Nach 205 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 0,75 vvm durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 131,2 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,64 g/l·h.
  • Nach 205 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 1,0 vvm durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 143,3 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,70 g/l·h.
  • Nach 205 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 1,50 vvm durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 125,0 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,61 g/l·h.
  • (BEISPIEL VII) Die Erythritolherstellung entsprechend der Änderung der Glucosekonzentration in dem Fermenter
  • Die mutanten Zellen von Candida magnoliae (KCCM-10160) wurden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (2,0% Glucose, 1,0% Pepton, 1,0% Hefeextrakt) enthielt, bei 30 °C und 240 U.p.M. für 48 Stunden kultiviert und diese Impfkultur wurde zur Erythritolherstellung in einen 5 l Fermenter überführt. Versuche im Fermenter mit Fermentationsmedium wurden bei 28 °C, einem anfänglichen pH-Wert von 7,0, 1,0 vvm und 500 U.p.M. für 84 Stunden durchgeführt. Das Fermentationsmedium bestand aus Glucose als Kohlenstoffquelle und 0,5% Hefeextrakt, 0,2% (NH4)2SO4, 0,5% KH2PO4, 5,0% KCl und 0,04% MgSO4·7H2O. Der Einfluß der Glucosekonzentration auf die Erythritolherstellung wurde untersucht.
  • Nach 63 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 10% Glucose durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 29,1 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,46 g/l·h.
  • Nach 120 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 15% Glucose durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 64,9 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,54 g/l·h.
  • Nach 160 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 20% Glucose durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 87,2 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,55 g/l·h.
  • Nach 205 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 25% Glucose durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 143 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,70 g/l·h.
  • Nach 205 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 30% Glucose durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 117 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,57 g/I·h.
  • (BEISPIEL VIII) Die Erythritolherstellung entsprechend der Änderung der Saccharosekonzentration in dem Fermenter
  • Die mutanten Zellen von Candida magnoliae (KCCM-10160) wurden in einem 250 ml Kolben, der 50 ml Wachstumsmedium (2,0% Glucose, 1,0% Pepton, 1,0% Hefeextrakt) enthielt, bei 30 °C und 240 U.p.M. für 48 Stunden kultiviert und diese Impfkultur wurde zur Erythritolherstellung in einen 5 l Fermenter überführt. Versuche im Fermenter mit Fermentationsmedium wurden bei 28 °C, einem an fänglichen pH-Wert von 7,0, 1,0 vvm und 500 U.p.M. für 84 Stunden durchgeführt. Das Fermentationsmedium bestand aus Saccharose als Kohlenstoffquelle und 0,5% Hefeextrakt, 0,2% (NH4)2SO4, 0,5% KH2PO4, 5,0% KCl und 0,04% MgSO4·7H2O. Der Einfluß der Saccharosekonzentration auf die Erythritolherstellung wurde untersucht.
  • Nach 65 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 10% Saccharose durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 26,1 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,40 g/l·h.
  • Nach 154 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 20% Saccharose durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 78,3 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,51 g/I·h.
  • Nach 175 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 20% Saccharose durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 105 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,60 g/I·h.
  • Nach 250 Stunden Fermentation wird die Menge an Erythritol bei 40% Saccharose durch HPLC mit einer Säule zur Analyse von Kohlenhydraten gemessen. Das erhaltene Erythritol beträgt 126 g/l und die Volumenproduktivität beträgt 0,50 g/I·h.
  • Candida magnoliae KCCM-10160 kann im Vorliegenden Erythritol aus Glucose oder Saccharose mit einer hohen Produktivität und einer hohen Ausbeute herstellen, wenig Schaum erzeugen und keine Nebenprodukte wie Glycerin herstellen, was zu einer einfachen Gewinnung führt. Diese Vorteile haben beträchtliche Bedeutung für die mögliche gewerbliche Herstellung von Erythritol.

Claims (2)

  1. Fermentationsverfahren für die Herstellung von Erythritol unter Verwendung mutanter Zellen von Candida magnoliae SR101, die beim Korean Culture Center of Microorganism unter der Hinterlegungsnummer KCCM-10160 hinterlegt wurden, welches die folgenden Stufen umfaßt: i) Fermentieren von Monosaccharid- oder Disaccharidmedium mit Zellen unter Steuern der folgenden Fermentationsbedingungen: a) das Medium für die Herstellung maximaler Mengen an Erythritol setzt sich aus 10-50 (w/v)% Glucose, 0,2-2,0 (w/v)% Hefeextrakt, 0,1-10 (w/v)% KH2PO4, 0,1-5,0 (w/v)% (NH4)2SO4 und 0,01-1,0 (w/v)% MgSO4·7H2O zusammen, b) der pH-Wert des Kulturmediums beträgt 6-8, c) die Kultivierungstemperatur beträgt 26-30 °C, d) die Belüftungsrate beträgt 0,75-2,0 Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute, e) die Rührgeschwindigkeit beträgt 300-1200 U.p.M., ii) Nährlösung, die KCl enthält, die kontinuierlich oder unterbrochen der Kulturbrühe während der Phase der Erythritolherstellung zugeführt wird, so daß diese 2-10% von dessen Konzentration enthält, iii) Entfernen von Zellen aus dem Fermentationsmedium und iv) Trennen und Gewinnen von Erythritol aus dem Fermentationsmedium aus Stufe iii).
  2. Neuartige mutante Zellen von Candida magnoliae SR101 (KCCM-10160).
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