DE60225004T2

DE60225004T2 - Verfahren zur Herstellung von Glutathion

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Publication number: DE60225004T2
Application number: DE60225004T
Authority: DE
Inventors: Alberto Benedetti; Enrico Giuseppe Roberto Berardi; Matilde Manzoni; Marina Nichele; Hermes Pagani; Manuela Rollini
Original assignee: Gnosis Srl
Current assignee: Gnosis Srl
Priority date: 2002-08-09
Filing date: 2002-08-09
Publication date: 2009-03-05
Anticipated expiration: 2022-08-10
Also published as: JP2004129647A; EP1391517A1; US6902912B2; CA2436682A1; DE60225004D1; ATE386134T1; ES2300403T3; EP1391517B1; CA2436682C; KR20040014360A; KR101023923B1; JP4342860B2; US20040048337A1

Description

Die vorliegendende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion von Glutathion. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Fermentations- und Aktivierungsverfahren zur Produktion von Glutathion (hiernach GSH), das es ermöglicht, GSH bei hohen Ausbeuten und relativ geringen Kosten zu erhalten.
GSH, auch bekannt als N-(N-L-y-Glutamyl-L-cysteinyl)glycin, ist ein bekanntes zelluläres Tripeptid, das in praktisch allen Zellen vorhanden ist. Seine diversen Funktionen sind für viele biomedizinische Gebiete, einschließlich Enzymologie, Transport, Pharmakologie, Therapie, Toxikologie, Endokrinologie und Mikrobiologie, sowie für die Agrikultur wichtig.
GSH spielt eine ausschlaggebende Rolle in vielen Stoffwechselgebieten („metabolic districts") sowie im Transport und im Zellschutz. Es dient der Reduktion der Disulfidbrücken von Proteinen und anderen Molekülen, der Synthese von Desoxyribonukleotidvorläufern von DNA und dem Schutz von Zellen gegen die gefährlichen Wirkungen von freien Radikalen und von vielen reaktiven Sauerstoffintermediaten (z. B. Peroxide), die in verschiedenen Stufen des Stoffwechsels gebildet werden. Die enzymatischen und Transportphänomene des GSH-Stoffwechsels werden behandelt in: Meister „Selective Modification of Glutathione Metabolism", Science, Band 220, Nr. 4596, 472–477 (1983).
Eine Erhöhung der intrazellulären GSH-Spiegel kann, in zahlreichen Bereichen des menschlichen Körpers, durch orale Verabreichung von reinem GSH oder durch Injektion von bestimmten GSH-Monoestern nach Auflösung in Wasser erreicht werden (siehe z. B. US 4,710,489 ; US 4,784,685 und US 4,879,370 ).
GSH wird industriell hauptsächlich durch Fermentationsverfahren produziert, wobei die Verbindung aus mikrobiellen Zellen extrahiert wird. Verfahren der Herstellung von GSH aus Mikroorganismen sind in zahlreichen Patenten offenbart, einschließlich US 4,596,775 und US 4,582,801 .
Die US 4,582,801 offenbart ein Verfahren zur Produktion von GSH bei hohen Ausbeuten (etwa 3–4%, bezogen auf trockene Zellen, und etwa 0,7–0,9% g/l), das das Kultivieren eines Stammes, der zur Gattung Saccharomyces gehört und sowohl eine Fähigkeit zum Produzieren von GSH als auch eine Resistenz gegenüber 1,2,4-Triazol oder Natriumazid aufweist, in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, Akkumulieren bzw. Anreichern von GSH in den mikrobiellen Zellen, Ernten der Zellen und Gewinnung von GSH daraus umfasst.
Die FR-A-2,692,280 offenbart die Verwendung von zinkresistenten Hefen, die zur Gattung Saccharomyces gehören, in einem Fermentationsverfahren zur Produktion von GSH, welches mit 4,1–6,6%, bezogen auf das Trockengewicht, erhalten wird; der höhere prozentuale Anteil wird unter Verwendung von L-Cystein erhalten, das dafür bekannt ist, die Akkumulation von GSH während der Fermentation zu verbessern, während es die Produktion der Biomasse negativ beeinflusst.
Udeh K. O. und Achremowicz B. debattieren in „Highglutathione containing yeast Saccharomyces cerevisiae: optimization of production", Acta Microbiologica Polonica, 1997, Band 46, Nr. 1, 105–114 darüber, wie die GSH-Ausbeute unter Verwendung einer hoch GSH-haltigen Hefe S. cerevisiae S-8H maximiert und eine durchschnittliche GSH-Ausbeute von 1,6 g/l und ein GSH-Gehalt von 17 mg/g trockener Biomasse erhalten werden kann.
Chi-Hsien Liu et al. beschreibt in „Medium optimization for glutathione production by Saccharomyces cerevisiae", Process Biochemistry, Band 34, 1999, 17–23, dass Glucose, Pepton und Magnesiumsulfat geeignete Komponenten für das Zellwachstum und die GSH-Produktion in dem Hefestamm sind, wobei der letztere im Durchschnitt bis 26–28 mg/l und bis 124,93 mg/l als Maximum erreicht.
Alfafara C. et al. lehren in „Cysteine addition strategy for maximum glutathione production in fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae", Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, 37, 141–146, die Aufrechterhaltung einer konstanten Cysteinkonzentration im Reaktor während der Fermentation, um die Gesamt-GSH-Produktion, die bis etwa 0,8 mg/l erreicht, zu maximieren, und zwar entweder durch kontinuierliche Cysteineinspeisung oder durch Cysteineinspeisungsstöße in allen Zellwachstumsbedingungen.
Alfafara et al., „Effect of amino acids an glutathione production by Saccharomyces cerevisiae", Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, 36: 538–540, beschreiben die Wirkungen der Zugabe von Glutamat, Glycin und Cystein auf die spezifische GSH-Produktionsrate in Bezug auf das Hefewachstum während des Verlaufs der Fermentation, unter Zellwachstumsbedingungen.
Die JP 61027999 beschreibt die Abtrennung von Glutathion aus rohen Extrakten unter Verwendung von stark saurem Ionenaustauschharz, wobei Glutathion unter Verwendung von Alkalihydroxidlösungen eluiert und abschließend kristallisiert wird.
Die JP 52156994 offenbart ein Verfahren zur Produktion von Glutathion durch aerobes Kultivieren von z. B. Saccharomyces-, Candida-, Pichia-, Hansenula-Mikroorganismen in Kulturmedium, das ein Kohlenstoffatom enthält.
Obgleich diese Verfahren bereits eine Verbesserung für die Produktion von GSH darstellen, sind sie manchmal entweder zu komplex oder ihre Produktionsausbeuten sind noch relativ niedrig, und eine hohe Produktion von Biomasse zusammen mit einer spezifischen Produktivität sind noch ein Ziel für die Produktion von GSH.
Es ist nun festgestellt worden, dass GSH mittels eines Fermentationsverfahrens hergestellt werden kann, umfassend:

(a) das Erhalten einer Biomasse-Vorkultur durch Vorkultivieren, unter aeroben Bedingungen, eines Stammes einer Hefegattung, ausgewählt aus Pichia angusta -NCYC 2957- GN/2219, Saccharomyces cerevisiae -NCYC 2958- GN/2220, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus -NCYC 2959- GN/2221 und Candida boidinii, Mutante 21 -NCYC 2983- GN/2222, wobei der Glutathion-Gehalt pro Biomasseeinheit höher ist als 1,2% (G/G), bezogen auf das Trockengewicht;
(b) das Kultivieren, unter aeroben Bedingungen, der resultierenden Biomasse-Vorkultur, so dass die Dichte der resultierenden kultivierten Biomasse höher ist als 50 g/l, bezogen auf das Trockengewicht;
(c) die Aktivierung der kultivierten Biomasse unter Nicht-Wachstumsbedingungen, umfassend:
(α) Resuspendieren der kultivierten Biomasse, 5–20% trockene Biomasse, in einer wässrigen Lösung, enthaltend 0,4–1 M Kohlenstoffquelle und 0,001–0,01 M Cystein;
(β) Rühren der resultierenden Suspension bei 300–600 Upm und
(γ) Belüften der Suspension entweder mit Luft oder Sauerstoffgas und/oder einem Gemisch davon; und
(d) die Gewinnung von Glutathion aus der kultivierten Biomasse, die aus Stufe (c) resultiert, durch Extrahieren von Glutathion bei einem pH gleich oder niedriger als 6 und Reinigen des resultierenden Glutathions.

Besonders bevorzugt als GSH-produzierende Hefen sind Pichia angusta, identifiziert in unserer Stammsammlung als GN/2219, eingereicht am 13. Juli 2000 bei der „National Collection of Yeast Cultures" (NCYC), Eingangsnummer: NCYC 2957; Saccharomyces cerevisiae, identifiziert in unserer Stammsammlung als GN/2220, eingereicht am 13. Juli 2000 bei der NCYC, Eingangsnummer: NCYC 2958; Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, identifiziert in unserer Stammsammlung als GN/2221, eingereicht am 13. Juli 2000 bei der NCYC, Eingangs nummer: NCYC 2959; Candida boidinii, Mutante 21, identifiziert in unserer Stammsammlung als GN/2222, eingereicht am 24. Oktober 2000 bei der NCYC, Eingangsnummer: NCYC 2983.
Die Hefezellen sind entweder nicht mutagenisiert oder sie können mit einem mutagenen Agens bzw. Mittel behandelt werden (z. B. UV-Licht, 1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin (NTG), Methansulfonsäureethylester (EMS) usw.). Die Hefezellen, die zur Auswahl von Mutanten verwendet werden können, zeigen eine Reaktion auf oxidativen Stress, die geringer ist als die des ursprünglichen Wildstammes, und zwar in einem Weg, der vom GSH-Reaktionsweg verschieden ist.
Pichia Angusta -NCYC 2957- GN/2219
Die morphologischen, Nährstoff- und sexuellen Merkmale dieses Stammes stimmen mit jenen überein, die für diese Art typisch sind, wie z. B. beschrieben in: Kurtzman & Fell, „The Yeasts, a taxonomy study" (4. Ausgabe) Elsevier, 1998.
Insbesondere:
Morphologische Merkmale
In 5%igem Malzextrakt sind die Zellen nach 3-tägiger Inkubation bei 25°C sphäroid, einzeln, in Paaren oder in kleinen Aggregaten bzw. Clustern. In bzw. auf Dalmau-Platten-Agar werden nach 7-tägiger Inkubation bei 25°C weder Pseudohyphen noch Hyphen unter dem Deckglas beobachtet.

Bei 25°C werden in 2%igem Malzextrakt- oder YM-Medium (3 g/l Hefeextrakt; 3 g/l Malzextrakt; 5 g/l Bacto-Pepton – hergestellt von Difco –; 10 g/l Glucose; 20 g/l Agar), Ascosporen beobachtet (Ascosporen sind hutförmig und üblicherweise nicht konjugiert). Fermentation

Glucose	+
Trehalose	+
Galactose	–
Saccharose	–
Maltose	–
Lactose	–
Raffinose	–

Assimilation

Sorbose (schwach)	+	Mannit	+
Saccharose	+	Glucit	+
Maltose	+	α-Methyl-D-glucosid	+
Trehalose	+	Salicin (schwach)	+
Melezitose	+	Gluconat (schwach)	+
Xylose	+	Succinat	+
Glycerin	+	Citrat	+
Erythrit	+	Nitrat	+
Ribit	+	vitaminfreies Medium	–

Wachstum: 10% NaCl +; 5% Glucose +.
Andere Merkmale: Stärke wird nicht beobachtet; Gelatineverflüssigung ist sehr schwach; maximale Wachstumstemperatur ist 48°C.

Saccharomyces cerevisiae -NCYC 2958- GN/2220
Die morphologischen, sexuellen und Nährstoffmerkmale dieses Stammes stimmen überein mit jenen, die für diese Art typisch sind, wie zum Beispiel beschrieben in J. A. Barnet et al.: YEAST: Characteristics and identification, dritte Ausgabe Cambridge University, 2000, insbesondere:
Wachstum in „Malzextrakt": Nach 3 Tagen bei 25°C sind die Zellen ellipsoid bis zylindrisch. Ein Sediment, gelegentlich ein Ring, ist vorhanden.
Nach einem Monat bei 20°C ist ein Sediment vorhanden.
Wachstum auf „Malzagar": Nach einem Monat bei 20°C ist die Ausstrichkultur („streak culture") butterähnlich, cremefarben bis leicht bräunlich.
Bildung von Ascosporen: Die Asci enthalten ein bis vier Ascosporen.

Acetatagar ist das beste Medium zum Induzieren der Sporulation. Assimilation von Kohlenstoffverbindungen

Glucose	+	DL-Lactat	–
Galactose	–	Glycerin	–
Ribose	–	Sorbit	–
Saccharose	+	Erythrit	–
Maltose	+	Mannit	–
Cellobiose	–	Inosit	–
Lactose	–	Sorbose	–
Melibiose	–	Glucuronat	–
Raffinose	+	Gluconat	–
Trehalose	–	Glucosamin	–
L-Arabinose	–	N-Acetyl-glucosamin	–
D-Xylose	–	α-Methyl-D-glucosid	–
Ramnose	–	2-Ketogluconat	–
Levulinat	–	Palatinose	+
Melezitose	–	Äsculin	–
Actidion	–

Fermentation

	3 Tage	24 Tage
Cellobiose	–	–
Galactose	–	–
Glucose	+	+
Lactose	–	–
Maltose	+	+
Melibiose	–	–
Saccharose	+	+
Trehalose	–	–

Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus -NCYC 2959- GN/2221

Die Merkmale dieses Stammes sind identisch mit denen, die oben für Saccharomyces cerevisiae -NCYC 2958-, GN/2220, beschrieben wurden, abgesehen von der Assimilation von Kohlenstoffverbindungen und den Fermentationstests. Assimilation von Kohlenstoffverbindungen

Glucose	+	DL-Lactat	–
Galactose	+	Glycerin	–
Ribose	–	Sorbit	–
Saccharose	+	Erythrit	–
Maltose	+	Mannit	–
Cellobiose	–	Inosit	–
Lactose	–	Sorbose	–
Melibiose	–	Glucuronat	–
Raffinose	+	Gluconat	–
Trehalose	–	Glucosamin	–
L-Arabinose	–	N-Acetyl-glucosamin	–
D-Xylose	–	α-Methyl-D-glucosid	–
Ramnose	–	2-Ketogluconat	–
Levulinat	–	Palatinose	+
Melezitose	–	Äsculin	–
Actidion	–

Fermentation

	3 Tage	24 Tage
Cellobiose	–	–
Galactose	–	+
Glucose	+	+
Lactose	–	–
Maltose	+	+
Melibiose	–	–
Saccharose	+	+
Trehalose	–	–

Candida boidinii (Mutante 21) -NCYC 2983- GN/2222
Die morpohologischen, sexuellen und Nährstoff-Merkmale dieses Stammes stimmen überein mit jenen, die für diese Art typisch sind, wie zum Beispiel beschrieben in: J. A. Barnet et al.: YEAST: Characteristics and identification, dritte Ausgabe, Cambridge University, 2000, insbesondere: Wachstum in Glucose-Hefeextrakt-Pepton-Wasser: Nach 3 Tagen bei 25°C sind die Zellen lang-ovoid bis zylindrisch, danach leicht gebogen.
Wachstum auf Glucose-Hefeextrakt-Pepton-Agar: Nach einem Monat bei 25°C ist die Ausstrichkultur gelblich cremefarben, weich, feinfaltig.

Dalmau-Platten-Kultur auf Maismehlagar („corn meal agar"): Das Pseudomycel ist vorhanden und mit kurzen verzweigten Hyphen, die verticillate bzw. quirlförmig angeordnete Ketten und Gruppen von ovoiden Blastosporen tragen. Assimilation von Kohlenstoffverbindungen:

Glucose	+	DL-Lactat	+
Galactose	–	Glycerin	+
Ribose	+	Sorbit	+
Saccharose	–	Erythrit	+
Maltose	–	Mannit	+
Cellobiose	–	Inosit	–
Lactose	–	Sorbose	–
Melibiose	–	Glucuronat	–
Raffinose	–	Gluconat	–
Trehalose	–	Glucosamin	–
L-Arabinose	–	N-Acetyl-glucosamin	+–
D-Xylose	+	α-Methyl-D-glucosid	–
Ramnose	–	2-Ketogluconat	–
Levulinat	–	Palatinose	–+
Melezitose	–	Äsculin	–
Actidion	+

Fermentation

	3 Tage	24 Tage
Cellobiose	–	–
Galactose	–	–
Glucose	+	+
Lactose	–	–
Maltose	–	–
Melibiose	–	–
Saccharose	–	–
Trehalose	–	–

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt einen wirtschaftlichen Weg zur Produktion von GSH bereit, ermöglicht die Verbesserung der Produktivität der GSH-produzierenden Hefen sowie die schnelle Isolation von GSH-überproduzierenden Mutanten, die kostengünstige Kultivierung von derartigen Mutanten, die Erhöhung des GSH-Gehalts der Biomasse und die schnelle und effektive Extraktion von GSH aus der Biomasse.
Die Zellen der Hefe, geeignet zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, sind haploid.
Entweder Stufen (a) und/oder (b) und/oder (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens können in einem wässrigen, flüssigen oder festen Nährmedium durchgeführt werden, das wenigstens eine der folgenden Verbindungen umfasst:

(i) eine Verbindung eines Metalls, ausgewählt aus Cd, V, Cu, Fe, Pb, Al, Co, Cr, Mn, Ni, Mo, Hg;
(ii) ein Peroxid (z. B. H₂O₂, tert.-Butylperoxid usw.);
(iv) ein Hydroperoxid (z. B. tert.-Butyl-HOOH usw.);
(v) eine Fettsäure (z. B. Ölsäure, Linolensäure, Arachidonsäure usw.) und/oder ein geradkettiges oder verzweigtes, gesättigtes oder ungesättigtes Derivat davon; wobei das Medium ferner wenigstens eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff und/oder Stickstoff und/oder wenigstens ein Mineralsalz umfasst, wenn die Verbindungen (i) bis (v) selbst nicht eine derartige Quelle und/oder ein derartiges Salz sind.

Die Kohlensstoffquellen können zum Beispiel aus agrikulturellen und/oder industriellen Abfällen stammen; insbesondere können sie wenigstens eine der folgenden Substanzen umfassen: Zucker, wie Dextrose, Dextrin, Glucose, Fructose, Saccharose, Mannit, Mannose; organische Säuren; Alkohole; Aldehyde; Glycerin; Stärke; Fette; Öle; Kohlenwasserstoffe und Molke und dergleichen; insbesondere kann die erfindungsgemäße Produktion von GSH unter günstigen Bedingungen, wobei relativ preiswerte Kohlenstoffquellen, wie Rübenmelasse, eingesetzt werden, durchgeführt werden.
Die Stickstoffquellen können zum Beispiel wenigstens eine der folgenden Substanzen umfassen: Malzextrakt, Maisquellwasser („corn steep liquor"), enzymatisches Hydrolysat von Casein, Sojamehl, Trockenhefe, Pepton, Sojapepton, Fleischextrakt, Nitrat, Aminosäuren, Casein, Ammoniumsalze und dergleichen. Gute Ergebnisse werden unter Verwendung von Ammoniumsalzen, wie Ammoniumnitrat und Ammoniumsulfat, erhalten.
Die zur Produktion verwendeten Mineralsalze können in Abhängigkeit vom Kulturmedium variieren; die löslichen anorganischen Salze, die Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Sulfat-, Chlorid-, Nitrationen bereitstellen, können verwendet werden. Derartige Salze können z. B. Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Kaliumhydrogensulfat, Natriumnitrat sein. Die Zugabe von Calciumcarbonat kann ebenso hilfreich sein.
Ferner kann das Medium wenigstens eine Aminosäure (z. B. Cystein, Methionin, Glutamat, Glutamin, Glycin, Leucin, Ace tylcystein usw.) und/oder eine Phosphorquelle (z. B. Kaliumphosphat usw.) und/oder einen Alkohol (Methanol, Ethanol, Isopropanol, Butanol usw.) umfassen.
Vorzugsweise ist in Stufe (a) der GSH-Gehalt pro Biomasseeinheit höher als 1,6% (G/G), bezogen auf das Trockengewicht, wohingegen Stufe (b) vorzugsweise bei 20–50°C für 12–72 h, insbesondere bei 25–45°C für 12–48 h, durchgeführt wird; die Dichte der kultivierten Biomasse liegt vorzugsweise zwischen 50 und 65 g/l, bezogen auf das Trockengewicht.
Das erfindungsgemäße Verfahren und spezifisch entweder Stufen (a) und/oder (b) und/oder (c) können entweder chargenweise oder kontinuierlich durchgeführt werden.
Die Stufen (a) und/oder (b) und/oder (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens können durch Belüftung mit entweder Luft oder Sauerstoffgas und/oder einem Gemisch davon durchgeführt werden; das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhafterweise in belüfteten Fermentern durchgeführt, um bemerkenswerte Mengen an GSH zu erhalten. Der bevorzugte Fermenter ist ein Fermenter vom Typ Belüftung-Umwälzung oder ein Airlift-Fermenter. Ferner kann das Verfahren in einem Kolben und in Fermentern verschiedener Kapazität durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Aktivierung – Stufe (c) – der kultivierten Biomasse. In der vorliegenden Beschreibung soll „Aktivierung" auf eine Anreicherung des intrazellulären GSH-Gehalts der Biomasse, durchgeführt unter Einsatz von ruhenden Zellen unter Nicht-Wachstumsbedingungen, hinweisen.
Die Aktivierung umfasst:

(α) Resuspendieren der kultivierten Biomasse, z. B. 5–20% der/an trockenen/r Biomasse, in einer wässrigen Lösung, enthaltend 0,4–1 M Kohlenstoffquelle und 0,001–0,01 M Cystein;
(β) Rühren der resultierenden Suspension bei 300–600 UpM; und
(γ) Belüften der Suspension entweder mit Luft oder Sauerstoffgas und/oder einem Gemisch davon, vorzugsweise bei 1–4 vvm.

In Stufe (a) enthält die wässrige Lösung vorzugsweise 0,001–0,01 M Cystein, Glycin und Glutamat.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird GSH in Stufe (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Lyse bei einem pH von 0,05–3,0 und bei einer Temperatur von 70–90°C extrahiert.
Die kultivierte Biomasse, die aus Stufe (b) resultiert, zeigt eine Produktivität an GSH von etwa 0,9–1,2%, wohingegen die aktivierte kultivierte Biomasse, die aus Stufe (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens resultiert, eine Erhöhung der GSH-Produktivität auf 2,7–3,9% unter getrockneten Bedingungen zeigt.
Die Extraktion von GSH in Stufe (d) kann vorzugsweise durch ein stark kationisches Harz, wie z. B. Amberlite^® IR 120-200-220, hergestellt von Rhom & Haas, oder Relite^® CF, hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation, und nachfolgend ein nicht-ionisches Harz, wie z. B. SP 207 (Resindion, Mitsubishi), durchgeführt werden. Die GSH-Extraktion kann vorzugsweise durch Fällung des Salzes in Gegenwart von H₂SO₄, in der das Salz nach Salzbildung durch ein (Molekül) H₂SO₄ unlöslich wird, erhalten werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie einzuschränken.
BEISPIEL 1
Ein Wildstamm von Pichia angusta, isoliert aus Bodenproben, wurde verwendet, nämlich ein homothallischer, haploider (Stamm).
Stufe 1
Der Stamm wurde für 20 Stunden bei 37°C (konische 250 ml-Kolben, Inkubation bei 200 UpM orbital) in 100 ml reichen Me dium („Rich Medium") (RM) kultiviert, das die folgende Zusammensetzung (g/l) aufwies:

Glucose 20

Pepton 20

Hefeextrakt 10
Stufe 2
25 ml Hefekultur wurden zwei mal in destilliertem Wasser per Zentrifugation gewaschen („spin-washed") und in destilliertem Wasser resuspendiert.
5 × 10⁷ Zellen wurden auf Glucose-Mineral-Medium (GM), enthaltend 8 mM Cadmiumchloridmonohydrat (MMC), ausplattiert, das die folgende Zusammensetzung (g/l) aufwies:

Glucose 20

Hefe-Stickstoffbasis 7

Cadmiumchloridmonohydrat 1,61
Die Platten wurden bis zu einer Mortalität von 90% UV-bestrahlt und für 20 Tage bei 37°C im Dunklen inkubiert.
Stufe 3
Nach der Inkubation zeigte eine typische Platte 800–1000 Kolonien, wobei etwa 50% von diesen einen Durchmesser F < 1 mm („klein") und etwa 50% F > 1 mm („groß") aufwiesen. Zehn große Kolonien wurden isoliert, mittels Ausstreichen auf RM-Platten gereinigt und auf MMC erneut getestet. Der cadmiumresistente Phänotyp von 5 von 10 Kolonien wurden bestätigt.
Stufe 4
Fünf in Stufe 3 isolierte Kolonien wurden wie gerade oben beschrieben behandelt, in diesem Fall wurde das Cadmium durch 200 mM Natriumorthovanadat ersetzt. Am Ende wurden 5 Kolonien isoliert, deren Cadmium-Vanadat-resistenter Phänotyp bestätigt war.
Stufe 5
Jede der 5 Cadmium-Vanadat-resistenten Kolonien der vorherigen Stufe (hiernach CVCdA, CVCdB, CVC, CVD, CVE) wurde in 7,5 ml Mineralmedium (MM) vorkultiviert und für 16 h bei 37°C (orbital, 200 UpM) inkubiert. Zellen aus diesen Vorkulturen wurden anschließend verwendet, um 100 ml-Kolben, enthaltend 20 ml MM, zu inokulieren, so dass mit 5 × 10⁶ Zellen/ml begonnen wurde. Die Kolben wurden bei 37°C für 24 h (orbital, 200 UpM) inkubiert; das Experiment wurde in dreifacher Wiederholung durchgeführt.
Stufe 6
Der Zellgehalt jedes Kolbens wurde mittels Zentrifugation gewonnen, zweimal gewaschen und in zwei Aliquots aufgeteilt. Ein Aliquot diente der Bestimmung des Trockengewichts der Biomasse, wohingegen das andere der Bestimmung des GSH-Gehalts von Zellextrakten diente, die erhalten wurden durch Resuspendieren der Zelle in 1 ml Perchlorsäure, Zugeben von 0,5 g Glaskügelchen (Sigma # G-9268), Rühren für 1 Min × 3, Präzipitieren bzw. Fällen der Festphase mittels Zentrifugation und Pipettieren auf dem Extrakt, gemäß dem Verfahren von Akerboom und Sies, „Methods in enzymology", Band 27, Seiten 373–384, 1981, Academic Press Inc.

Tabelle 1 zeigt einige signifikante Ergebnisse, die mit den fünf Kulturen erhalten wurden, ausgedrückt als prozentualer Anteil der Gewichtskonzentrationen („weight levels") pro Einheit Biomasse. Tabelle 1

Stamm	GSH/Biomasseeinheit
	E. 1	E. 2	E. 3	Mittelwert
Wildtyp (Kontrolle)	100	100	100	100
Mutante CVCdA	124	119	122	122
Mutante CVCdB	231	219	242	231
Mutante CVC	100	101	97	99
Mutante CVD	102	105	106	104
Mutante CVE	109	110	107	109

E. = Experiment

Es wird bemerkt werden, dass die Mutanten CVCdA und, bemerkenswerterweise, CVCdB (Pichia angusta, identifiziert in unserer Stammsammlung als GN/2219, NCYC 2957) eine signifikante Erhöhung im intrazellulären GSH-Gehalt zeigen.
Stufe 7
Die Produktion von GSH unter Verwendung der Mutante CVCdB GN/2219, NCYC 2957, in Tabelle 2 als Mutante B angegeben, in einem 3 l-Fermenter wurde unter Verwendung von 2 verschiedenen Medien (GM, GlyM – wie GM, jedoch ist Glucose durch 2% Glycerin ersetzt – und mM – wie GM, jedoch ist Glucose durch 18% Melasse, entsprechend 9% als Saccharose, ersetzt) und den folgenden Kulturbedingungen durchgeführt: Volumen: 2 l, Temperatur: 35°C, Luft: 1 vvm, pH: 5,0.
Die Entwicklung von GSH und Biomasse wurde für 62 h verfolgt und mit der einer identischen Kontrollkultur (Wildstamm) verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Es wird bemerkt werden, dass die zelluläre Produktivität im Falle der Mutante B höher ist als im Wildstamm, wohingegen die Ausbeuteunterschiede zwischen den zwei Medien nicht relevant sind.
Diese Tests zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren unter günstigen Bedingungen unter Einsatz verschiedener Medien und für lange Zeiträume durchgeführt werden kann.
Nach der Fermentationsphase wurde die Biomasse gewonnen, gewaschen und entweder in konzentrierter Form resuspendiert, um eine Aktivierungsstufe zu beginnen, wobei auf eine weitere Erhöhung der GSH-Ausbeuten abgezielt wurde (beschrieben in Beispiel 2), oder eine Bearbeitung zum Extrahieren und Reinigen von GSH erfolgte (hier unten beschrieben in Stufe 8).
Stufe 8
Die aus der vorherigen Stufe erhaltene Biomasse wurde in entmineralisiertem Wasser bis zu einer Konzentration von 7 g/l (Biomassetrockengewicht) resuspendiert. 10 Liter dieser konzentrierten Biomassesuspension (CoBS) wurden unter Verwendung einer Kombination aus niedrigem pH (1–6,5, mit konzentrierter H₂SO₄) und hoher Temperatur (75°C × 3 Min) permeabilisiert. Die Biomasse wurde anschließend mittels Filtration (0,2 mm-Keramikmembranen) entfernt und die GSH-enthaltende Lösung wurde mittels Umkehrosmose konzentriert, um etwa 6 g/l GSH zu erreichen.
Tabelle 3 fasst die GSH-Ausbeuten (%), erhalten bei verschieden pH(-Werten), wobei die vorstehend genannte CoBS verwendet wurde, zusammen. Tabelle 3

pH 6,5 5 4 3 1,5

E. 1 0,50 0,55 0,61 0,68 0,98

E. 2 0,48 0,52 0,58 0,72 1,02

E. 3 0,42 0,49 0,64 0,73 0,95

E. = Experiment

Diese Tests zeigen, dass eine Zellpermeabilisierung unter den eingesetzten Bedingungen durch niedrige pH-Werte begünstigt wird.
Stufe 9
Die Reinigung von GSH wurde bewerkstelligt, indem 1 l der konzentrierten GSH-Lösung (etwa 6 g/l) in einer Säule, gepackt mit Amberlite (1 l, IR120H), bei einer Flussrate von 1 BV/h percoliert wurde. 30 BV entmineralisiertes Wasser wurden anschließend aufgebracht, um das Harz zu waschen, bevor das GSH mit 1% H₂SO₄ eluiert wurde. 6 l der resultierenden Eluate werden auf 5 1 mittels Umkehrosmose konzentriert, was etwa 85% des anfänglichen GSH ergibt.
Stufe 10
Die konzentrierten Eluate wurden in einer Säule perkoliert, gepackt mit 1 1 nicht-ionischem porösem Harz, d. h. SP207 (Resindion, Mitsubishi), zuvor regeneriert bei 1 BV/h. GSH wurde anschließend mit Wasser eluiert und die Fraktionen 2 bis 9 wurden gesammelt. Die wässrige GSH-Lösung, die so erhalten wurde, wurde auf 500 g/l konzentriert. GSH wurde schließlich mittels einer 50%igen Ethanollösung gefällt. 4 g weißes kristallines Pulver mit 98% GSH-Gehalt wurden erhalten.
BEISPIEL 2
Ein nicht-sporulierender, spontan mutierter bzw. mutanter Stamm von Saccharomyces cerevisiae (identifiziert in unserer Stammsammlung als GN/2220, NCYC 2958), der einen GSH-Gehalt pro Biomasseeinheit von mehr als 1,4% (G/G) aufweist, wurde verwendet.
Stufe 1
Der Stamm wurde chargenweise für 24 h in einem 14 l-Fermenter kultiviert, wobei 3 verschiedene Medien eingesetzt wurden, nämlich (Mengen sind als g/l angegeben): YP (20 Pepton, 10 Hefeextrakt, 10 Glycerin, pH 5), YPG (20 Pepton, 10 Hefeextrakt, 20 Glukose, pH 5) und B (60 Rübenmelasse – entsprechend 30 Saccharose –, 5(NH₄)₂SO₄, 1K₂HPO₄, 0,5 Hefeex trakt, 0,2MgSO₄, pH 5,8). Die Kultivierungsbedingungen waren wie folgt: 28°C, 1 vvm Luft, 400 UpM. Antischaum: Sigma PPG #2000, Inokulum 10% (V/V) einer Kolbenkultur in stationärer Phase in YP.

Tabelle 4 fasst die Ergebnisse von sieben verschiedenen Chargen zusammen. Tabelle 4

		Biomasse		GSH
E.	M	Y1	P	Y1	Y2	P
		g/l	g/lh	mg/l	%	mg/lh
1	YPG	9,40	0,39	94	1,0	3,90
2	YPG	9,20	0,39	65	0,7	2,70
3	B	10,7	0,44	207	1,9	8,60
4	B	9,10	0,38	155	1,7	6,50
5	B	10,5	0,44	203	1,9	8,46
6	YP	7,50	0,31	90	1,2	3,80
7	YP	7,80	0,32	101	1,2	4,00

E. = Experiment; P = Produktivität; Y1 = Ausbeute pro Volumen; Y2 = Ausbeute pro trockener Biomasse; es wurde keine verbleibende Saccharose detektiert.

Es wird bemerkt werden, dass die zelluläre Produktivität in Falle des Mediums B mehr als die doppelte der im Falle der anderen 2 Medien ist; ebenso zeigen die relativen endgültigen Ausbeuten, die zwischen den 3 Medien beträchtlich differieren, dass B das Erhalten der besten Ergebnisse ermöglicht.
Stufe 2
Biomasse, erhalten aus der vorherigen Stufe, wurde mittels Zentrifugation bei 10000 UpM für 10 Min (5°C) gewonnen, zwei mal mit entionisiertem Wasser gewaschen und bis zu einer Konzentration von 7% (trockene Biomasse, G/V) in der folgenden Lösung (g/l) resuspendiert:

Glucose 82

Natriumtartrat 10

Adenin 4

Cystein 4

Methionin 3,5

KH₂PO₄ 3,5
Das „Biomasseaktivierungs"-Verfahren wurde anschließend in einem 3 l-Fermenter für 24 h gestartet, und zwar mit den folgenden Betriebsbedingungen: Rührgeschwindigkeit, 500 UpM; Belüftungsrate 3 vvm; Temperatur 28°C.
Tabelle 5 fasst die GSH-Ausbeuten von vier Aktivierungsexperimenten zusammen, wobei Biomasse eingesetzt wurde, die entweder in B-Medium oder in YPG-Medium erhalten wurde. Tabelle 5

_E Fermentationsmedium GSH-Ausbeute (% der trockenen Biomasse)

vor Aktivierung nach Aktivierung

1 YPG 1,0 2,0

2 YPG 0,7 2,0

3 B 1,9 3,7

4 B 1,7 3,4

E. = Experiment

Es wird bemerkt werden, dass das vorstehend angeführte 24-stündige Aktivierungsverfahren unabhängig vom anfänglichen GSH-Gehalt signifikante GSH-Ausbeuteerhöhungen ermöglicht.
BEISPIEL 3
Der Stamm Saccharomyces cerevisiae NCYC 2958 wurde chargenweise für 30 h in einem 50 l-Fermenter unter Verwendung des Mediums B (Beispiel 2) kultiviert. Inokulum: 20% von stationärer Phase. Kultivierungsbedingungen waren wie in Beispiel 2.
Während des Wachstums, beginnend ab der zwölften Stunde, erfolgten 5 Zugaben (alle 3 h) von Melasse, so dass die Kon zentration an Saccharose bis zur 24sten Stunde höher als 10% gehalten wurde.
Eine Biomasse von 58,89 g/l und 1,45% GSH, beide bezogen auf das Trockengewicht, wurden erhalten.
Die für Zentrifugation gesammelte bzw. gewonnene Biomasse (Beispiel 2) wurde wieder zu 10% suspendiert und in der folgenden Lösung (g/l) „aktiviert":

Glucose 82

Natriumtartrat 10

Adenin 4

Cystein 4

Natriumglutamat 5

Glycin 5

Methionin 3

85% H₃PO₄ 0,25 ml
Bei den gleichen Bedingungen von Beispiel 2 wurden 3,7% GSH unter trockenen Bedingungen erhalten, entsprechend 3,7 g/l der „Aktivierung".
BEISPIEL 4
Ein Wildstamm von Candida boidinii, isoliert aus Pflanzenmaterial, wurde mutagenisiert und die Mutante #21 wurde nach einer Verfahrensweise, die analog zu der in Beispiel 1 beschriebenen war, ausgewählt, wobei jedoch Methylglyoxal („methylglioxal") als ein Selektionsmittel verwendet wurde. Dieser Stamm wurde als Candida boidinii Mutante 21, NCYC 2983, interne Stammsammlung GN/2222, identifiziert und zeigte einen GSH-Gehalt pro Biomasseeinheit von mehr als 1,5% (G/G).
Stufe 1
Der Stamm wurde chargenweise über 24 h in einem 14 l-Fermenter unter Einsatz von Medium B kultiviert, jedoch wurde die Melasse bis 180 g/l (90 g/l als Saccharose) wie in Beispiel 3 zugesetzt. Die Kultivierungsbedingungen waren wie folgt: 28°C, 1 vvm Luft, 400 UpM. Antischaum: Sigma PPG #, Inokulum 10% (V/V) einer Kolbenkultur in stationärer Phase in YP.
Tabelle 6 fasst die Ergebnisse der Fermentation zusammen. Tabelle 6

Biomasse GSH

H Y1 P Y1 Y2 P

g/l g/lh mg/l % mg/lh

6 0,54 0,09 2,7 0,5 0,33

18 16,2 0,9 194,4 1,2 10,80

24 29,2 1,2 408,8 1,4 17,03

30 36,1 1,2 469,3 1,3 15,64

H = Stunden; P = Produktivität; Y1 = Ausbeute pro Volumen; Y2 = Ausbeute pro trockener Biomasse; es wurde keine verbleibende Saccharose detektiert.

Stufe 2
Die aus der vorstehend genannten Charge erhaltene Biomasse wurde wie in Beispiel 1 (Stufe 8) beschrieben behandelt, um eine konzentrierte GSH-Lösung (etwa 6 g/l) zu erhalten. 1 l dieser Lösung wurde mit H₂SO₄ auf pH 1,8 eingestellt und anschließend mit einer 10 ml-Suspension, enthaltend 1,4 g Cu₂O in Wasser, behandelt. Die Suspension wurde sehr sanft eingetropft, während die Temperatur bei 4°C gehalten wurde. Die Lösung wurde anschließend bei 4°C für 2 h gerührt und anschließend über Nacht ungestört gelassen.
Stufe 3
Nach Filtration wurde das Präzipitat (9 g) mehrmals mit verdünnter H₂SO₄ gewaschen und anschließend mit H₂S bei Raumtemperatur solubilisiert. Die Lösung, enthaltend 4,5 g GSH, wurde auf 1 l SP 207, ein von Mitsubishi Chemical hergestelltes nicht-ionisches Harz, aufgebracht und anschließend mit 10 BV entmineralisiertem Wasser eluiert. Fraktionen wurden gesammelt (6 l), konzentriert und mit 50% Ethanol in Wasser behandelt, um GSH auszufällen. 3,5 g GSH, die eine Reinheit von 99% zeigten, wurden erhalten.
BEISPIEL 5
Die gemäß den Beispielen 1 und 4 erhaltene Biomasse wurde behandelt, wie in Beispiel 1 (Stufe 8) beschrieben, um eine konzentrierte Lösung von GSH (etwa 6 g/l) zu erhalten. 1 l dieser Lösung wurde mit H₂SO₄ auf pH 1,8 eingestellt und in einem Wasserbad auf 40°C erhitzt.
Bei einer Temperatur von 40°C wurden 10 ml einer Cu₂O-Suspension (1,5 g) in Wasser zugegeben.
Nach 3 Minuten wurde die resultierende Lösung schnell auf 4°C gebracht und dann für 2 Stunden unter Rühren gehalten.
Nach 2 Stunden wurde sie wie in Beispiel 3 (Stufe 3) zur Filtration fortgeführt. Nach der Filtration wurde das Präzipitat (0,5 g) in H₂S gelöst, mit SP 207, einem von Mitsubishi Chemical hergestellten nicht-ionischen Harz, gereinigt und in Ethanol gefällt. 3,6 g GSH mit einer Reinheit von 99% wurden erhalten.

Claims

Fermentationsverfahren zur Produktion von Glutathion, umfassend: (a) das Erhalten einer Biomasse-Vorkultur durch Vorkultivieren, unter aeroben Bedingungen, eines Stammes einer Hefegattung, ausgewählt aus Pichia angusta -NCYC 2957- GN/2219, Saccharomyces cerevisiae -NCYC 2958- GN/2220, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus -NCYC 2959- GN/2221 und Candida boidinii, Mutante 21 -NCYC 2983- GN/2222, wobei der Glutathion-Gehalt pro Biomasseeinheit höher ist als 1,2 (G/G), bezogen auf das Trockengewicht; (b) das Kultivieren, unter aeroben Bedingungen, der resultierenden Biomasse-Vorkultur, so dass die Dichte der resultierenden kultivierten Biomasse höher ist als 50 g/l, bezogen auf das Trockengewicht: (c) die Aktivierung der kultivierten Biomasse unter Nicht-Wachstumsbedingungen, umfassend: (α) Resuspendieren der kultivierten Biomasse, 5–20% trockene Biomasse, in einer wässrigen Lösung, enthaltend 0,4–1 M Kohlenstoffquelle und 0,001–0,01 M Cystein; (β) Rühren der resultierenden Suspension bei 300–600 Upm und (γ) Belüften der Suspension entweder mit Luft oder Sauerstoffgas und/oder einem Gemisch davon; und (d) die Gewinnung von Glutathion aus der kultivierten Biomasse, die aus Stufe (c) resultiert, durch Extrahieren von Glutathion bei einem pH gleich oder niedriger als 6 und Reinigen des resultierenden Glutathions.
Verfahren nach dem vorstehenden Anspruch, worin entweder die Stufen (a) und/oder (b) und/oder (c) in einem wässrigen, flüssigen oder festen Nährmedium durchgeführt werden, das wenigstens eine der folgenden Verbindungen umfasst: (i) eine Verbindung eines Metalls, ausgewählt aus Cd, V, Cu, Fe, Pb, Al, Co, Cr, Mn, Ni, Mo, Hg; (ii) ein Peroxid; (iii) ein Aldehyd; (iv) ein Hydroperoxid; (v) eine Fettsäure und/oder ein geradkettiges oder verzweigtes, gesättigtes oder ungesättigtes Derivat davon; wobei das Medium ferner wenigstens eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff und/oder Stickstoff und/oder wenigstens ein Mineralsalz enthält, wenn die Verbindungen (i) bis (v) selbst nicht eine derartige Quelle und/oder ein derartiges Salz sind.
Verfahren nach dem vorstehenden Anspruch, worin die Verbindung (i) ein anorganisches wasserlösliches Mineralsalz ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, worin das Medium wenigstes eine Aminosäure und/oder eine Phosphorquelle und/oder einen Alkohol umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin der Glutathion-Gehalt pro Biomasseeinheit in Stufe (a) höher ist als 1,6% (G/G), bezogen auf das Trockengewicht.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin Stufe (b) bei 20–50°C für 12–72 h durchgeführt wird und die Dichte der resultierenden kultivierten Biomasse zwischen 50 und 65 g/l, bezogen auf das Trockengewicht, liegt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin Stufe (b) bei 25–45°C für 12–48 h durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin entweder Stufen (a) und/oder (b) und/oder (c) entweder chargenweise oder kontinuierlich durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, worin die Kohlenstoffquelle aus agrikulturellen und/oder industriellen Abfällen stammt.
Verfahren nach dem vorstehenden Anspruch, worin die Kohlenstoffquelle wenigstens eine der folgenden Substanzen umfasst: Zucker, organische Säuren, Alkohole, Aldehyde, Glycerin, Fette, Öle, Kohlenwasserstoffe und Molke.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin die Kohlenstoffquelle Rübenmelasse umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, worin die Stickstoffquelle wenigstens eine der folgenden Substanzen umfasst: Malzextrakt, Maisquellwasser („corn steep liquor"), enzymatisches Hydrolysat von Casein, Sojamehl, Trockenhefe, Pepton, Sojapepton, Fleischextrakt, Nitrat, Aminosäuren, Casein und Ammoniumsalze.
Verfahren nach dem vorstehenden Anspruch, worin die Stickstoffquelle Ammoniumnitrat oder Ammoniumsulfat umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin entweder Stufen (a) und/oder (b) und/oder (c) durch Belüftung entweder mit Luft oder Sauerstoffgas und/oder einem Gemisch davon durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die wässrige Lösung in Stufe (a) 0,001–0,01 M Cystein, Glycin und Glutamat enthält.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin der zu verwendende Fermenter ein Fermenter vom Typ Belüftung-Umwälzung oder vom Airlift-Typ ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Glutathion in Stufe (d) durch Lyse bei einem pH von 0,5–3,0 und bei einer Temperatur von 70–90°C extrahiert wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Glutathion in Stufe (d) durch ein starkes kationisches Harz und nachfolgend ein nicht-ionisches Harz extrahiert wird.