JP4342860B2 - グルタチオンの生産方法 - Google Patents
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Description
(a)Saccharomyces、Hansenula、Pichia、Candida、Cryptococcus、Schizosaccharomyces、Sporobolomyces、Bullera、Bulleromyces、Filobasidiella、Lipomyces、Rhodotorulaから選択される酵母属の菌株又はその安定な突然変異株を有酸素条件下で前培養することにより、バイオマス単位当りのGSH含量が1.2重量%より高い、バイオマス前培養を得ること、
(b)生じたバイオマス前培養を、培養によって生じるバイオマスの密度が50g/lより高くなるように、有酸素条件下で培養すること、
(c)前記培養バイオマスを活性化すること、及び
(d)段階(c)から生じる培養バイオマスから、6以下のpHでGSHを抽出し、生じたGSHを精製することによってGSHを回収すること
を含む発酵工程によってGSHが生産できることが認められた。
この菌株の形態学的、栄養学的及び性的特徴は、例えば非特許文献5に述べられているように、この種の典型的な特徴に合致する。
形態学的特徴
5%麦芽抽出物中では、25℃で3日間インキュベートした後、該細胞は、球状、単一、対又は小さなクラスターとして存在する。
この菌株の形態学的、性的及び栄養学的特徴は、例えば非特許文献6に述べられているように、これらの種の典型的な特徴に合致し、特に:
「麦芽抽出物」中での増殖:25℃で3日後、該細胞は楕円状から円柱状である。堆積物、時としては環が存在する。
この菌株の特徴は、炭素化合物の同化と発酵試験の2つを除いて、Saccharomyces cerevisiae −NCYC 2958−GN/2220について上記で報告したのと同じである。
この菌株の形態学的、性的及び栄養学的特徴は、例えば非特許文献6に述べられているような、これらの種の典型的な特徴に合致し、特に:
グルコース−酵母抽出物−ペプトン水中での増殖:25℃で3日後、該細胞は、わずかに湾曲した後、長卵形から円柱状である。
(i)Cd、V、Cu、Fe、Pb、Al、Co、Cr、Mn、Ni、Mo、Hgから選択される金属の化合物、
(ii)過酸化物(例えば、H2O2、t−ブチルペルオキシド等)、
(iii)アルデヒド(例えばメチルグリオキサル、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド等)、
(iv)ヒドロペルオキシド(例えば、t−ブチル−HOOH等)、
(v)脂肪酸(例えば、オレイン酸、リノレン酸、アラキドン酸等)及び/又はその線状又は分枝、飽和又は不飽和誘導体、
の少なくとも1つを含み、前記化合物(i)から(v)が炭素及び/又は窒素及び/又は少なくとも1つの鉱質塩の同化可能なソースでない及び/又は塩そのものでない場合には常に、少なくとも1つの同化可能なそのようなソースをさらに含む、水性の、液体又は固体栄養培地において実施することができる。
(α)培養バイオマス、例えば5%から20%の乾燥バイオマスを、0.4Mから1M炭素ソースを含む水溶液に再懸濁すること、
(β)生じた懸濁液を300rpmから600rpmで攪拌すること、及び
(γ)前記懸濁液を空気又は酸素ガス及び/又はそれらの混合物により、好ましくは1−4vvmで通気すること
を含む。
前記株を、次の組成(g/l):
グルコース 20
ペプトン 20
酵母抽出物 10
を有するリッチ培地(RM)100ml中、37℃で20時間(250ml円錐フラスコ、200rpm旋回インキュベーション)培養した。
酵母培養25mlを蒸留水中で2回攪拌洗浄し、再び蒸留水に懸濁した。
グルコース 20
酵母窒素基剤 7
一水和塩化カドミウム 1.61
を有するグルコースミネラル培地(GM)で平板培養した。
インキュベーション後、代表的な平板は800コロニーから1000コロニーを示し、そのうち約50%が直径F<1mm(「小」)で、約50%がF>1mm(「大」)であった。10個の大コロニーを単離し、RM平板で画線精製し、再びMMCで試験した。10個のコロニーのうち5個について、それらのカドミウム耐性表現型を確認した。
ステージ3で単離した5個のコロニーを上述したように処理したが、但しこの場合には、カドミウムをオルトバナジン酸ナトリウム200mMに置き換えた。最後に、5個のコロニーを単離して、それらのカドミウム−バナジン酸耐性表現型を確認した。
先のステージの5個のカドミウム−バナジン酸耐性コロニーの各々(以下CVCdA、CVCdB、CVC、CVD、CVE)をミネラル培地(MM)7.5ml中で前培養し、37℃で16時間インキュベートした(旋回、200rpm)。次に、5×106細胞/mlで開始するために、これらの前培養からの細胞を使用して、MM 20mlを含む100mlフラスコにインキュベートした。前記フラスコを37℃で24時間インキュベートした(旋回、200rpm);この実験を3回実施した。
各々のフラスコの細胞内容物を遠心分離によって収集し、2回洗って、2つのアリコートに分けた。1つのアリコートはバイオマスの乾燥重量を測定するために使用し、他方は、非特許文献7の方法に従って、該細胞を過塩素酸1mlに懸濁し、ガラスビーズ(Sigma No.G−9268)0.5gを加えて1分間×3回攪拌し、固相を遠心分離によって沈殿させ、抽出物上にピペットで分注することによって得られる、細胞抽出物のGSH含量を測定するために使用した。
3l発酵槽での、表2において突然変異株Bとして示す突然変異株CVCdB GN/2219、NCYC 2957を使用したGSHの生産を、2つの異なる培地(GM、GlyM−GMであるが、グルコースを2%グリセロールに置き換える−及びmM−GMであるが、グルコースをサッカロース9%に相当する18%糖蜜に置き換える)、及び次の培養条件:容量:2l、温度:35℃、空気:1vvm、pH:5.0を用いて実施した。
先のステージから得たバイオマスを、鉱物質除去水に7g/l(バイオマス乾燥重量)の濃度で再懸濁した。この濃縮バイオマス懸濁液(CoBS)10lを、低いpH(濃硫酸を用いて、1から6.5)と高い温度(75℃×3分間)の組合せを用いて透過性を上げた。次に該バイオマスをろ過(0.2mmセラミック膜)によって除去し、約6g/l GSHに達するように該GSH含有溶液を逆浸透によって濃縮した。
Amberlite(1l、IR120H)を充填したカラムにおいて、1BV/時の流速で濃縮GSH溶液(約6g/l)1lを浸出ろ過することによってGSHの精製を行った。次に鉱物質除去水30BVを加えて前記樹脂を洗った後、1%H2SO4でGSHを溶出した。生じた溶出物6lを逆浸透によって5lに濃縮し、約85%の初期GSHを生成した。
前記濃縮溶出物を、あらかじめ1BV/時で再生した、非イオン性多孔性樹脂、すなわちSP207(Resindion,Mitsubishi)1lを充填したカラムにおいて浸出ろ過した。次にGSHを水で溶出し、分画2から9を収集した。そのようにして得たGSH水溶液を500g/lに濃縮した。最後にGSHを50%エタノール溶液によって沈殿させた。98%のGSH含量の白色結晶性粉末4gを得た。
前記菌株を、3つの異なる培地、すなわち(量はg/lで表している)YP(20ペプトン、10酵母抽出物、10グリセロール、pH5)、YPG(20ペプトン、10酵母抽出物、20グルコース、pH5)及びB(60ビート糖蜜−30スクロースに等しい−、5(NH4)2SO4、1KH2PO4、0.5酵母抽出物、0.2MgSO4、pH5.8)を使用して、14lの発酵槽で24時間バッチ培養した。培養条件は次の通りであった:28℃、1vvm空気、400rpm。泡止め剤:Sigma PPG No.2000。 YPでの静止期フラスコ培養の接種物10%(V/V)。
先のステージから得たバイオマスを、10,000rpmで10分間(5℃)遠心分離して収集し、脱イオン水で2回洗って、次の溶液(g/l):
グルコース 82
酒石酸ナトリウム 10
アデニン 4
システイン 4
メチオニン 3.5
KH2PO4 3.5
中に7%濃度(乾燥バイオマス、w/v)で懸濁した。
グルコース 82
酒石酸ナトリウム 10
アデニン 4
システイン 4
グルタミン酸ナトリウム 5
グリシン 5
メチオニン 3
85% H3PO4 0.25ml
中で「活性化」した。
前記菌株を、培地Bを使用して14l発酵槽で24時間バッチ培養したが、実施例3におけるように180g/l(サッカロースとして90g/l)まで糖蜜を添加した。培養条件は次の通りであった:28℃、1vvm空気、400rpm。泡止め剤:Sigma PPG No.YPでの静止期フラスコ培養の接種物10%(V/V)。
濃縮GSH溶液(約6g/l)を得るために、上記のバッチから得たバイオマスを実施例1(ステージ8)で述べたように処理した。この溶液1lをH2SO4によってpH1.8に調整し、次いで水中にCu2O 1.4gを含む懸濁液10mlで処理した。温度を4℃に維持しながら、前記懸濁液を非常に静かに滴下した。次にこの溶液を4℃で2時間静かに攪拌し、その後一晩静かに放置した。
ろ過した後、沈殿物(9g)を溶解した希硫酸で数回洗い、その後室温でH2Sによって可溶化した。GSH4.5gを含む溶液を、三菱化学(Mitsubishi Chemical)によって製造される非イオン性樹脂、SP 207 1lに加えて、その後鉱物質除去水10BVで溶出した。分画を収集して(6l)、濃縮し、水中50%エタノールで処理してGSHを沈殿させた。99%の純度を示すGSH 3.5gを得た。
Claims (17)
- (a)Pichia angusta −NCYC 2957−GN/2219、Saccharomyces cerevisiae −NCYC 2958−GN/2220、Saccharomyces cerevisiae var.ellipsoideus −NCYC 2959−GN/2221、Candida boidinii、突然変異株21 −NCYC 2983−GN/2222から選択される酵母属の菌株を有酸素条件下で前培養することにより、バイオマス単位当りのグルタチオン含量が乾燥重量で1.2重量%より高い、バイオマス前培養を得ること、
(b)生じたバイオマス前培養を、培養によって生じるバイオマスの密度が乾燥重量で50g/lより高くなるように、有酸素条件下で培養すること、
(c)(α)上記培養バイオマスを、0.4Mから1Mの糖類、有機酸、アルコール、アルデヒド、グリセロール、脂肪、油、炭化水素及び乳清の少なくとも1種を含む炭素ソースと0.001から0.01Mのシステインを含む水溶液に再懸濁すること、
(β)生じた懸濁液を300rpmから600rpmで攪拌すること、及び
(γ)前記懸濁液を空気又は酸素ガス及び/又はそれらの混合物で通気することを含む、非増殖条件での前記培養バイオマスを活性化すること、及び
(d)段階(c)から生じる培養バイオマスから、6以下のpHでグルタチオンを抽出し、生じたグルタチオンを精製することによってグルタチオンを回収すること
を含む、グルタチオンを生産するための発酵方法。 - 段階(a)及び/又は(b)及び/又は(c)のいずれかを、次の化合物:
(i)Cd、V、Cu、Fe、Pb、Al、Co、Cr、Mn、Ni、Mo、Hgから選択される金属の化合物、
(ii)過酸化物、
(iii)アルデヒド、
(iv)ヒドロペルオキシド、
(v)脂肪酸及び/又はその線状又は分枝、飽和又は不飽和誘導体
の少なくとも1つを含み、前記化合物(i)から(v)が糖類、有機酸、アルコール、アルデヒド、グリセロール、脂肪、油、炭化水素及び乳清の少なくとも1種を含む炭素ソース及び/又は、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、カゼインの酵素加水分解産物、黄粉、乾燥酵母、ペプトン、大豆ペプトン、肉抽出物、硝酸塩、アミノ酸、カゼイン及びアンモニウム塩の少なくとも1種を含む窒素ソース及び/又は少なくとも1つの鉱質塩でない及び/又は塩そのものでない場合には常に、少なくとも1つのそのような炭素ソース、窒素ソース及び/又は鉱質塩をさらに含む、水性の、液体又は固体栄養培地において実施する、請求項1に記載の方法。 - 前記化合物(i)が鉱質無機水溶性塩である、請求項2に記載の方法。
- 前記培地が少なくとも1つのアミノ酸及び/又はリン酸カリウムであるリンソース及び/又はアルコールを含む、請求項2又は3に記載の方法。
- 段階(a)において、バイオマス単位当りのグルタチオン含量が乾燥重量で1.6重量%より高い、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 段階(b)を20℃から50℃で12時間から72時間実施し、その結果生じる培養バイオマスの密度が乾燥重量で50g/lから65g/lである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 段階(b)を25℃から45℃で12時間から48時間実施する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 段階(a)及び/又は(b)及び/又は(c)のいずれかをバッチ方式で又は連続的に実施する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記炭素ソースが農業及び/又は産業廃棄物からのものである、請求項2から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記炭素ソースがビート糖蜜を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記窒素ソースが硝酸アンモニウム又は硫酸アンモニウムを含む、請求項2から10のいずれか一項に記載の方法。
- 段階(a)及び/又は(b)及び/又は(c)のいずれかを、空気又は酸素ガス及び/又はそれらの混合物で通気することによって実施する、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 段階(α)において、前記水溶液が0.001Mから0.01Mのシステイン、グリシン及びグルタミン酸塩を含む、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。
- 使用する発酵槽が通気攪拌型又はエアリフト型発酵層である、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 段階(d)においてグルタチオンを0.5から3.0のpH及び70℃から90℃の温度での溶解によって抽出する、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 段階(d)においてグルタチオンを、強力なカチオン樹脂、続いて非イオン性樹脂を通して抽出する、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 段階(α)の前記培養バイオマスが5%から20%乾燥バイオマスである請求項1から16のいずれか1項に記載の方法。
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