ES2300403T3

ES2300403T3 - Procedimiento para producir glutation.

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Publication number: ES2300403T3
Application number: ES02017906T
Authority: ES
Inventors: Alberto Benedetti; Enrico Giuseppe Roberto Berardi; Matilde Manzoni; Marina Nichele; Hermes Pagani; Manuela Rollini
Original assignee: Gnosis Srl
Current assignee: Gnosis Srl
Priority date: 2002-08-09
Filing date: 2002-08-09
Publication date: 2008-06-16
Anticipated expiration: 2022-08-09
Also published as: CA2436682C; EP1391517B1; EP1391517A1; DE60225004T2; ATE386134T1; JP4342860B2; CA2436682A1; DE60225004D1; KR101023923B1; US6902912B2; KR20040014360A; JP2004129647A; US20040048337A1

Abstract

Un procedimiento de fermentación para producir glutatión, que comprende: (a) la obtención de un precultivo de biomasa al precultivar, bajo condiciones aeróbicas, una cepa de un género de levadura seleccionada entre Pichia angusta -NCYC 2957- GN/2219, Saccharomyces cerevisiae -NCYC 2958- GN/2220, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus -NCYC 2959- GN 2221 y Candida boidinii, mutante 21, -NCYC 2983- GN 2222, en que el contenido de glutatión por unidad de biomasa es superior a 1,2% en peso/peso con respecto al peso en estado seco; (b) el cultivo, bajo condiciones aeróbicas, del precultivo de biomasa resultante de modo que la densidad de la biomasa cultivada resultante sea superior a 50 g/l con respecto al peso en estado seco; (c) la activación de la biomasa cultivada, bajo condiciones de no crecimiento, que comprende: (alfa) resuspender la biomasa cultivada, 5-20% de biomasa seca, en una disolución acuosa que contiene una fuente de carbono 0,4-1 M y cisteína 0,001-0,01 M; (beta) agitar la suspensión resultante a 300-600 rpm; y (gamma) gasear dicha suspensión con aire u oxígeno gaseoso y/o una mezcla de los mismos; y (d) la recuperación del glutatión de la biomasa cultivada que resulta de la operación (c) extrayendo el glutatión en un pH igual o inferior a 6 y purificando el glutatión resultante.

Description

Procedimiento para producir glutatión.

El presente invento se refiere a un procedimiento para producir glutatión. Particularmente, el invento se refiere a un procedimiento de fermentación y activación para producir glutatión (en adelante GSH), que permite obtener GSH con rendimientos elevados y costes relativamente bajos.

El GSH, también conocido como N-(N-L-\gamma-glutamil-L-cisteinil)glicocola, es un conocido tripéptido celular, presente en casi todas las células. Sus diferentes funciones son importantes en muchos campos biomédicos, incluyendo enzimología, transporte, farmacología, terapia, toxicología, endocrinología y microbiología, así como en la agricultura.

El GSH desempeña un papel crucial en diversos escenarios metabólicos, así como en el trasporte y en la protección celular. Sirve para la reducción de los enlaces disulfuro de proteínas y otras moléculas, la síntesis de los precursores desoxirribonucleotídicos de DNA, y la protección de células frente a los efectos peligrosos de radicales libres y de los muchos productos oxigenados intermedios reactivos (por ejemplo, peróxidos) que se forman en diversas fases del metabolismo. En "Selective Modification of Glutathione Metabolism" de Meister, Science, volumen 220, nº 4596, 472-477 (1983), se tratan los fenómenos enzimáticos y de transporte del metabolismo del GSH.

Se puede conseguir un aumento de los niveles intracelulares de GSH en diversas regiones del cuerpo humano mediante la administración oral de GSH puro o mediante la inyección de ciertos monoésteres de GSH después de su disolución en agua (véanse, por ejemplo, los documentos US 4.710.489, US 4.784.685 y US 4.879.370).

Industrialmente, el GSH se produce esencialmente mediante procedimientos de fermentación por medio de los cuales se extrae el compuesto de células microbianas. En diversas patentes, incluyendo los documentos US 4.596.775 y US 4.582.801, se describen métodos para producir GSH a partir de microorganismos.

En el documento US 4.582.801 se describe un procedimiento para producir GSH con elevados rendimientos (aproximadamente 3-4% con respecto a células secas y aproximadamente 0,7-0,9% g/l), que implica cultivar una cepa perteneciente al género Saccharomyces y que tiene tanto capacidad para producir GSH como resistencia a 1,2,4-triazol o azida sódica, en un medio de cultivo que contiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas, dejar que se acumule el GSH en las células microbianas, recoger las células y recuperar el GSH de ellas.

En el documento FR-A- 2.692.280 se describe el uso de levaduras resistentes al zinc, pertenecientes al género Saccharomyces, en un procedimiento de fermentación para producir GSH, que se obtiene con un rendimiento de 4,1-6,6% con respecto al peso en estado seco; el mayor porcentaje se obtiene al utilizar L-cisteína, de la que se sabe que mejora la acumulación de GSH durante la fermentación aunque afecta negativamente a la producción de biomasa.

K. O. Udeh y B. Achremowicz, en "High-glutathione containing yeast Saccharomyces cerevisiae: optimization of production", Acta Microbiologica Polonica, 1997, volumen 46, nº 1, 105-114, debaten acerca de cómo maximizar el rendimiento de GSH, usando una levadura S. cerevisiae que contiene altos niveles de GSH, S-8H, y obteniendo un rendimiento medio de GSH de 1,6 g/l y un contenido de GSH de 17 mg/g de biomasa seca.

Chi-Hsien Liu et al., en "Medium optimization for glutathione production by Saccharomyces cerevisiae", Process Biochemistry, volumen 34, 1999, 17-23, comunican que la glucosa, la peptona y el sulfato de magnesio son componentes adecuados para el crecimiento celular y la producción de GSH en la cepa de levadura, producción que asciende a 26-28 mg/l como valor medio y a 124,93 mg/l como valor máximo.

C. Alfafara et al., en "Cysteine addition strategy for maximum glutathione production in fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae", Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, 37, 141-146, enseñan cómo mantener una concentración constante de cisteína en el reactor, durante la fermentación, para maximizar la producción total de GSH que asciende a aproximadamente 0,8 g/l, mediante el suministro continuo de cisteína o mediante golpes de suministro de cisteína, bajo condiciones de crecimiento celular.

Alfafara et al., "Effect of amino acids on glutathione production by Saccharomyces cerevisiae", Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, 36: 538-540, describen los efectos de la adición de glutamato, glicocola y cisteína sobre el índice de producción específico de GSH en relación con el crecimiento de la levadura, durante el curso de la fermentación, bajo condiciones de crecimiento celular.

En el documento JP 61027999 se describe la separación del glutatión de extractos crudos usando una resina ácida fuerte para intercambio iónico; el glutatión es eluido usando disoluciones de hidróxido alcalino y es finalmente cristalizado.

En el documento JP 52156994 se describe un procedimiento para producir glutatión por cultivo aeróbico de microorganismos tales como Saccharomyces, Candida, Pichia y Hansenula en un medio de cultivo que contiene un átomo de carbono.

Aunque estos procedimientos ya representan una mejora para la producción de GSH, a veces son muy complejos o sus rendimientos de producción son aún relativamente bajos, por lo que una elevada producción de biomasa junto con una productividad específica son aún un objetivo en cuanto a la producción de GSH.

Se ha hallado ahora que se puede producir GSH por medio de un procedimiento de fermentación que comprende:

(a) la obtención de un precultivo de biomasa al precultivar, bajo condiciones aeróbicas, una cepa de un género de levadura seleccionada entre Pichia angusta -NCYC 2957- GN/2219, Saccharomyces cerevisiae -NCYC 2958- GN/2220, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus -NCYC 2959- GN 2221 y Candida boidinii, mutante 21, -NCYC 2983- GN 2222, en que el contenido de glutatión por unidad de biomasa es superior a 1,2% en peso/peso con respecto al peso en estado seco;

(b) el cultivo, bajo condiciones aeróbicas, del precultivo de biomasa resultante de modo que la densidad de la biomasa cultivada resultante sea superior a 50 g/l con respecto al peso en estado seco;

(c) la activación de la biomasa cultivada, bajo condiciones de no crecimiento, que comprende:

(\alpha): resuspender la biomasa cultivada, 5-20% de biomasa seca, en una disolución acuosa que contiene una fuente de carbono 0,4-1 M y cisteína 0,001-0,01 M;

(\beta): agitar la suspensión resultante a 300-600 rpm; y

(\gamma): gasear dicha suspensión con aire u oxígeno gaseoso y/o una mezcla de los mismos; y

(d) la recuperación del glutatión de la biomasa cultivada que resulta de la operación (c) extrayendo el glutatión en un pH igual o inferior a 6 y purificando el glutatión resultante.

Como levaduras productoras de GSH se prefieren particularmente Pichia angusta, identificada como GN/2219 en nuestra colección de cepas y presentada el 13 de Julio de 2000 al "National Collection of Yeast Cultures" (NCYC) con el número de acceso NCYC 2957; Saccharomyces cerevisiae, identificada como GN/2220 en nuestra colección de cepas y presentada el 13 de Julio de 2000 al NCYC con el número de acceso NCYC 2958; Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, identificada como GN/2221 en nuestra colección de cepas y presentada el 13 de Julio de 2000 al "National Collection of Yeast Cultures" (NCYC) con el número de acceso NCYC 2959; y Candida boidinii, mutante 21, identificada como GN/2222 en nuestra colección de cepas y presentada el 24 de Octubre de 2000 al "National Collection of Yeast Cultures" (NCYC) con el número de acceso NCYC 2983.

Las células de levadura no son sometidas a mutación o pueden ser tratadas con un agente mutagénico [por ejemplo, luz UV, 1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina (NTG), éster etílico del ácido metanosulfónico (EMS), etc.]. Las células de levadura que pueden ser usadas para la selección de mutantes pueden mostrar una respuesta de estrés oxidativo menor que las de la cepa silvestre original, en una ruta que es diferente de la ruta de respuesta al GSH.

Pichia angusta -NCYC 2957- GN/2219

Las características morfológicas, nutricionales y sexuales de esta cepa se ajustan a las típicas de esta especie, como describen, por ejemplo, Kurtzman y Fell en "The Yeasts, a taxonomy study" (4ª edición), Elsevier, 1998.

En particular:

Características morfológicas

En extracto de malta al 5%, después de 3 días de incubación a 25ºC, las células son esferoidales e individuales, en parejas o en pequeños agregados.

En agar de placas Dalmau, después de 7 días de incubación a 25ºC, no se observan pseudohifas ni hifas bajo el cubreobjetos.

A 25ºC, en extracto de malta al 2% o medio YM [3 g/l de extracto de levadura, 3 g/l de extracto de malta, 5 g/l de Bacto-peptona (producida por Difco), 10 g/l de glucosa y 20 g/l de agar], se observan ascosporas (las ascosporas tienen forma de sombrero y normalmente no están conjugadas).

Fermentación

1

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Asimilación

2

Crecimiento: NaCl al 10%, +; Glucosa al 5%, +.

Otras características: no se observa almidón: la licuefacción de gelatina es muy débil; la temperatura de máximo crecimiento es 48ºC.

Saccharomyces cerevisiae -NCYC 2958- GN/2220

Las características morfológicas, sexuales y nutricionales de esta cepa se ajustan a las típicas de estas especies, como describen, por ejemplo, J. A. Barnet et al. en "YEAST: Characteristics and Identification", tercera edición, Cambridge University, 2000. En particular:

Crecimiento en "extracto de malta": después de 3 días a 25ºC, las células tienen una forma de elipsoidal a cilíndrica. Está presente un sedimento, de vez en cuando un anillo.

Después de un mes a 20ºC, está presente un sedimento.

Crecimiento en "agar-malta": después de un mes a 20ºC, el cultivo por rayado es mantecoso, de color crema a ligeramente pardusco.

Formación de ascosporas: las ascas contienen de una a cuatro ascosporas.

El agar-acetato es el mejor medio para inducir la esporulación.

Asimilación de compuestos carbonados

4

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Fermentación

6

Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus -NCYC 2959- GN/2221

Las características de esta cepa son idénticas a las anteriormente presentadas para Saccharomyces cerevisiae -NCYC 2958-, GN/2220, salvo por lo referente a ambos ensayos, el de asimilación de compuestos carbonados y el de fermentación.

Asimilación de compuestos carbonados

7

Fermentación

9

Candida boidinii (mutante 21) -NCYC 2983- GN/2222

Las características morfológicas, sexuales y nutricionales de esta cepa se ajustan a las típicas de estas especies, como describen, por ejemplo, J. A. Barnet et al. en "YEAST: Characteristics and Identification", tercera edición, Cambridge University, 2000, en particular:

Crecimiento en glucosa-extracto de levadura-peptona-agua: después de 3 días a 25ºC, las células tienen forma de ovoide larga a cilíndrica, después son ligeramente curvadas.

Crecimiento en glucosa-extracto de levadura-peptona-agar: después de un mes a 25ºC, el cultivo por rayado es de color crema amarillento, blando y finamente arrugado.

Cultivo sobre harina de maíz-agar en placas Dalmau: el seudomicelio está presente y con cortas hifas ramificadas que contienen cadenas verticiladas y grupos de blastosporas ovoides.

Asimilación de compuestos carbonados

10

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Fermentación

11

El procedimiento del invento proporciona un modo económico para producir GSH, permitiendo mejorar la productividad de las levaduras productoras de GSH así como el rápido aislamiento de mutantes sobreproductores de GSH, el cultivo barato de dichos mutantes, el aumento del contenido de GSH en la biomasa y la rápida y eficaz extracción del GSH de dicha biomasa.

Las células de la levadura adecuada para llevar a cabo el procedimiento del invento son haploides.

Cualquiera de las operaciones (a) y/o (b) y/o (c) del procedimiento del invento puede ser llevada a cabo en un medio nutriente acuoso, líquido o sólido que comprende al menos uno de los compuestos siguientes:

(i) un compuesto de un metal seleccionado entre Cd, V, Cu, Fe, Pb, Al, Co, Cr, Mn, Ni, Mo y Hg;

(ii) un peróxido (por ejemplo, H_{2}O_{2}, peróxido de t-butilo, etc,);

(iv) un hidroperóxido (por ejemplo, t-butil-HOOH, etc.); y

(v) un ácido graso (por ejemplo, ácido oleico, ácido linolénico, ácido araquidónico, etc.) y/o un derivado lineal o ramificado, y saturado o insaturado, del mismo;

medio que comprende además al menos una fuente asimilable de carbono y/o nitrógeno y/o al menos una sal mineral, siempre que los propios compuestos (i) a (v) no sean dicha fuente y/o dicha sal.

Las fuentes de carbono pueden proceder, por ejemplo, de residuos agrícolas y/o industriales; particularmente, pueden comprender al menos una de las sustancias siguientes: azúcares, tales como dextrosa, dextrina, glucosa, fructosa, sacarosa, manitol y manosa; ácidos orgánicos; alcoholes; aldehídos; glicerol; almidón; grasas; aceites; hidrocarburos y suero de leche y similares. Particularmente, la producción de GSH de acuerdo con el invento puede ser llevada a cabo bajo condiciones favorables empleando fuentes de carbono relativamente baratas, tal como melaza de remolacha.

Las fuentes de nitrógeno pueden comprender, por ejemplo, al menos una de las sustancias siguientes: extracto de malta, extracto de embrión de maíz, producto de hidrólisis enzimática de caseína, harina de soja, levadura seca, peptona, peptona de soja, extracto de carne, nitrato, aminoácidos, caseína, sales amónicas y similares. Se obtienen buenos resultados al utilizar sales amónicas tales como nitrato amónico y sulfato amónico.

Las sales minerales utilizadas para la producción pueden variar dependiendo del medio de cultivo. Se pueden utilizar las sales inorgánicas solubles que proporcionan iones sodio, potasio, magnesio, sulfato, cloruro y nitrato. Dichas sales pueden ser, por ejemplo, fosfato potásico monobásico, sulfato magnésico, sulfato potásico monobásico y nitrato sódico. También puede ser útil la adición de carbonato cálcico.

Además, el medio puede comprender al menos un aminoácido (por ejemplo, cisteína, metionina, glutamato, glutamina, glicocola, leucina, acetilcisteína, etc.) y/o una fuente de fósforo (por ejemplo, fosfato potásico, etc.) y/o un alcohol (metanol, etanol, isopropranol, butanol, etc.).

En la operación (a), el contenido de GSH por unidad de biomasa es preferiblemente superior a 1,6% en peso/peso con respecto al peso en estado seco, mientras que la operación (b) es llevada preferiblemente a cabo a 20-50ºC durante 12-72 horas, particularmente a 25-45ºC durante 12-48 horas; la densidad de la biomasa cultivada es preferiblemente entre 50 y 65 g/l con respecto al peso en estado seco.

El procedimiento del invento y, específicamente, cualquiera de las operaciones (a) y/o (b) y/o (c), se puede llevar a cabo de modo continuo o discontinuo.

Las operaciones (a) y/o (b) y/o (c) del procedimiento del invento pueden ser llevadas a cabo por gaseamiento con aire u oxígeno gaseoso y/o una mezcla de los mismos. El procedimiento del invento es llevado ventajosamente a cabo en fermentadores gaseados con objeto de obtener cantidades notables de GSH. El fermentador preferido es un fermentador de tipo gaseamiento-agitación o de agitación y gaseamiento por inyección de aire. Además, el procedimiento puede ser llevado a cabo en un matraz y en fermentadores de diferente capacidad.

El procedimiento del invento abarca la operación (c) de activación de la biomasa cultivada. En la presente memoria descriptiva, con "activación" se quiere indicar un enriquecimiento de la biomasa en cuanto al contenido de GSH intracelular, llevado a cabo empleando células en reposo y condiciones de no crecimiento.

La activación comprende:

(\alpha) resuspender la biomasa cultivada, por ejemplo, 5-20% de la biomasa seca, en una disolución acuosa que contiene una fuente de carbono 0,4-1 M y cisteína 0,001-0,01 M;

(\beta) agitar la suspensión resultante a 300-600 rpm; y

(\gamma) gasear dicha suspensión con aire u oxígeno gaseoso y/o una mezcla de los mismos, preferiblemente a 1-4 volúmenes de gas por volumen de líquido por minuto (vvm).

Preferiblemente, en la operación (\alpha), la disolución acuosa contiene glicocola, glutamato y cisteína 0,001-0,01 M.

En otra realización preferida, en la operación (d) del procedimiento del invento, el GSH se extrae por lisis en un pH de 0,5-3,0 y a una temperatura de 70-90ºC.

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La biomasa cultivada que resulta de la operación (b) muestra una productividad de GSH de aproximadamente 0,9-1,2%, mientras que la biomasa cultivada y activada que resulta de la operación (c) del procedimiento del invento muestra un aumento de la productividad de GSH hasta 2,7-3,9% bajo condiciones secas.

La extracción del GSH en la operación (d) puede ser llevada ventajosamente a cabo por medio de una resina catiónica fuerte tal como, por ejemplo, Amberlite® IR 120-200-220, producida por Rhom & Haas, o Relite® CF, producida por Mitsubishi Chemical Corporation, y, posteriormente, de una resina no iónica tal como, por ejemplo, SP 207 (Resindion, Mitsubishi). La extracción del GSH se puede obtener preferiblemente por medio de la precipitación de la sal en presencia de H_{2}SO_{4}, sal que se vuelve insoluble tras la salificación del H_{2}SO_{4}.

Los Ejemplos siguientes ilustran el invento sin limitarlo.

Ejemplo 1

Se usó una cepa silvestre de Pichia angusta aislada de muestras de suelo, es decir, un organismo haploide homotálico.

Fase 1

Se cultivó la cepa durante 20 horas a 37ºC (matraces cónicos de 250 ml de capacidad; incubación orbital a 200 rpm) en 100 ml de Medio Rico (RM) que tenía la composición siguiente (g/l):

Glucosa: 20

Peptona: 20

Extracto de levadura: 10

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Fase 2

25 ml del cultivo de levadura fueron centrifugados-lavados dos veces en agua destilada, y el residuo fue resuspendido en agua destilada.

Se sembraron 5 x 10^{7} células en Medio Mineral con Glucosa (GM) que contenía cloruro de cadmio monohidratado (MMC) 8 mM y tenía la composición siguiente (g/l):

Glucosa: 20

Base nitrogenada de levadura: 7

Cloruro de cadmio monohidratado: 1,61

Las placas fueron irradiadas con luz UV hasta una mortalidad de 90% y fueron incubadas a 37ºC en la oscuridad durante 20 días.

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Fase 3

Después de la incubación, una placa típica mostraba 800-1000 colonias, de las cuales aproximadamente el 50% tenía un diámetro F < 1 mm ("pequeñas") y aproximadamente el 50% tenía un diámetro F > 1 mm ("grandes"). Diez colonias grandes fueron aisladas, purificadas en placas de RM mediante siembra por rayado y vueltas a analizar en MMC. Se confirmó el fenotipo resistente al cadmio en cinco de las diez colonias.

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Fase 4

Cinco colonias aisladas en la Fase 3 fueron tratadas del modo ya anteriormente descrito; en este caso, el cadmio fue sustituido por ortovanadato sódico 200 mM. Al final, se aislaron cinco colonias en las que se confirmó su fenotipo resistente a cadmio-vanadato.

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Fase 5

Cada una de las cinco colonias resistentes a cadmio-vanadato de la fase previa (en adelante, CVCdA, CVCdB, CVC, CVD y CVE) fue precultivada en 7,5 ml de Medio Mineral (MM) e incubada durante 16 horas a 37ºC (incubación orbital; 200 rpm). Las células de estos precultivos se usaron luego para la inoculación en matraces de 100 ml de capacidad que contenían 20 ml de MM, empezando con 5 x 10^{6} células/ml. Se incubaron los matraces a 37ºC durante 24 horas (incubación orbital; 200 rpm). El experimento se realizó por triplicado.

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Fase 6

El contenido celular de cada matraz fue recogido por centrifugación, lavado dos veces y dividido en dos partes alícuotas. Una parte alícuota sirvió para determinar el peso de la biomasa en estado seco mientras que la otra sirvió para determinar el contenido de GSH en los extractos celulares, obtenido al resuspender las células en 1 ml de ácido perclórico, añadir 0,5 g de glóbulos de vidrio (Sigma; referencia G-9268), agitar 1 minuto x 3, precipitar la fase sólida por centrifugación y transferir el extracto con una pipeta, de acuerdo con el método de Akerboom y Sies, "Methods in Enzymology", volumen 27, páginas 373-384, 1981, Academic Press Inc.

En la Tabla 1 se muestran ciertos resultados significativos obtenidos con los cinco cultivos, expresados como porcentaje de los niveles ponderales por unidad de biomasa.

TABLA 1

12

Se advertirá que los mutantes CVCdA y, acusadamente, CVCdB (Pichia angusta, identificada en nuestra colección de cepas como GN/2219, NCYC 2957) muestran un significativo aumento del contenido intracelular de GSH.

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Fase 7

Se llevó a cabo la producción de GSH utilizando el mutante CVCdB GN/2219, NCYC 2957, indicado como mutante B en la Tabla 2, en un fermentador de 3 l de capacidad empleando dos medios diferentes [GM, GlyM (como GM pero sustituyendo la glucosa por glicerol al 2%) y mM (como GM pero sustituyendo la glucosa por melaza al 18%, que corresponde a 9% en forma de sacarosa)] y las condiciones de cultivo siguientes: volumen: 2 l, temperatura: 35ºC, aire: 1 vvm, pH: 5,0.

Se siguió la evolución del GSH y la biomasa durante 62 horas y se comparó con la de un cultivo testigo idéntico (cepa silvestre). Los resultados se muestran en la Tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

13

Se advertirá que la productividad celular es mayor en el caso del Mutante B que en el caso de la cepa silvestre, mientras que las diferencias de rendimiento entre los dos medios no son relevantes.

Estas pruebas muestran que el procedimiento del invento puede ser llevado a cabo bajo condiciones favorables empleando diversos medios y durante largos periodos de tiempo.

Después de la fase de fermentación, la biomasa fue recuperada y lavada, y luego fue o bien resuspendida en forma concentrada para iniciar una fase de activación, dirigida a aumentar más los rendimientos de GSH (descrito en el Ejemplo 2), o bien procesada para extraer y purificar el GSH (descrito a continuación en la Fase 8).

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Fase 8

La biomasa obtenida de la fase previa fue resuspendida en agua desmineralizada hasta una concentración de 7 g/l (peso de la biomasa en estado seco). 10 litros de esta suspensión concentrada de biomasa (CoBS; del inglés, concentrated biomass suspension) fueron permeabilizados utilizando una combinación de pH bajo (1-6,5, con H_{2}SO_{4} concentrado) y temperatura elevada (75ºC x 3 minutos). La biomasa fue luego separada por filtración (membranas cerámicas de 0,2 mm), y la disolución que contenía GSH fue concentrada por ósmosis inversa para alcanzar aproximadamente 6 g/l de GSH.

En la Tabla 3 se resumen los rendimientos (%) de GSH obtenidos en diversos pHs, usando la CoBS anteriormente mencionada.

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TABLA 3

14

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Estas pruebas muestran que, bajo las condiciones empleadas, la permeabilización celular resulta favorecida por pHs bajos.

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Fase 9

La purificación del GSH se llevó a cabo haciendo percolar 1 l de la disolución concentrada de GSH (aproximadamente 6 g/l) por una columna rellena de Amberlite (1 l, IR120H), con un caudal de 1 volumen de lecho (BV; del inglés, bed volume)/h. Luego se aplican 30 BV de agua desmineralizada para lavar la resina, antes de eluir el GSH con H_{2}SO_{4} al 1%. 6 l de los productos de elución resultantes son concentrados hasta 5 l por ósmosis inversa, obteniéndose aproximadamente el 85% del GSH inicial.

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Fase 10

Los productos de elución concentrados fueron hechos percolar por una columna rellena con 1 l de resina porosa no iónica, es decir, SP207 (Resindion, Mitsubishi), previamente regenerada con 1 BV/h. Luego se eluyó el GSH con agua y se recogieron las fracciones 2 a 9. La disolución acuosa de GSH así obtenida fue concentrada hasta 500 g/l. El GSH fue finalmente precipitado mediante una disolución de etanol al 50%. Se obtuvieron 4 g de polvo blanco cristalino con un contenido de GSH de 98%.

Ejemplo 2

Se usó una cepa mutante espontánea no esporulante de Saccharomyces cerevisiae (identificada como GN/2220 en nuestra colección de cepas, NCYC 2958) que tenía un contenido de GSH por unidad de biomasa superior a 1,4% en peso/peso.

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Fase 1

La cepa fue discontinuamente cultivada durante 24 horas en un fermentador de 14 l de capacidad empleando tres medios diferentes; es decir (las cantidades se expresan como g/l): YP (20 de peptona, 10 de extracto de levadura, 10 de glicerol, pH de 5), YPG (20 de peptona, 10 de extracto de levadura, 20 de glucosa, pH de 5) y B [60 de melaza de remolacha (equivalente a 30 de sacarosa), 5 de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 de K_{2}HPO_{4}, 0,5 de extracto de levadura, 0,2 de MgSO_{4}, pH de 5,8]. Las condiciones de cultivo fueron las siguientes: 28ºC, 1 vvm de aire, 400 rpm. Agente antiespumante: PPG nº 2000 de Sigma. Inóculo: 10% (volumen/volumen) de un cultivo en matraz en fase estacionaría,
en YP.

En la Tabla 4 se resumen los resultados de siete lotes diferentes.

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TABLA 4

15

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Se advertirá que la productividad celular en el caso del medio B es más del doble que en el caso de los otros dos medios; además, los rendimientos finales relativos, que difieren considerablemente entre los tres medios, muestran que B permite obtener los mejores resultados.

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Fase 2

La biomasa obtenida en la fase previa fue recogida por centrifugación a 10.000 rpm durante 10 minutos (5ºC), lavada dos veces con agua desionizada y resuspendida hasta una concentración de 7% (biomasa seca; peso/volumen) en la disolución siguiente (g/l):

Glucosa: 82

Tartrato sódico: 10

Adenina: 4

Cisteína: 4

Metionina: 3,5

KH_{2}PO_{4}: 3,5

Luego se inició el procedimiento de "activación de la biomasa" en un fermentador de 3 l de capacidad durante 24 horas, con las siguientes condiciones operativas: velocidad de agitación, 500 rpm; índice de gaseamiento, 3 vvm; temperatura, 28ºC.

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En la Tabla 5 se resumen los rendimientos de GSH de cuatro experimentos de activación en que se empleaba biomasa obtenida en medio B o en medio YPG.

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TABLA 5

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Se advertirá que, independientemente del contenido inicial de GSH, el procedimiento de activación de 24 horas anteriormente mencionado permite significativos aumentos del rendimiento de GSH.

Ejemplo 3

La cepa NCYC 2958 de Saccharomyces cerevisiae fue discontinuamente cultivada durante 30 horas en un fermentador de 50 l de capacidad usando el medio B (Ejemplo 2). Inóculo: 20% de fase estacionaria. Las condiciones de cultivo fueron como las del Ejemplo 2.

Durante el crecimiento, se realizaron cinco adiciones (cada 3 horas) de melaza a partir de la hora 12ª, de modo que la concentración de sacarosa se mantuviera por encima del 10% hasta la hora 24ª.

Se obtuvo una biomasa de 58,89 g/l y 1,45% de GSH, ambos valores con respecto al peso en estado seco.

La biomasa recogida por centrifugación (Ejemplo 2) fue suspendida de nuevo al 10% y fue "activada" en la disolución siguiente (g/l):

Glucosa: 82

Tartrato sódico: 10

Adenina: 4

Cisteína: 4

Glutamato sódico: 5

Glicocola: 5

Metionina: 3

H_{3}PO_{4} al 85%: 0,25 ml

Bajo unas condiciones iguales a las del Ejemplo 2, se obtuvo 3,7% de GHS bajo condiciones secas, lo que es igual a 3,7 g/l de "activación".

Ejemplo 4

Se sometió a mutagénesis una cepa silvestre de Candida boidinii aislada de materia vegetal y se seleccionó el mutante nº 21 tras seguir un procedimiento análogo al descrito en el Ejemplo 1 pero usando metilglioxal como agente selectivo. Esta cepa fue identificada como mutante 21 de Candida boidinii, NCYC 2983, GN 2222 de la colección de cepas interna, y mostró un contenido de GSH superior a 1,5% en peso/peso por unidad de biomasa.

Fase 1

Se cultivó discontinuamente la cepa durante 24 h en un fermentador de 14 l de capacidad empleando el medio B, pero la melaza se añadió hasta 180 g/l (90 g/l en forma de sacarosa) como en el Ejemplo 3. Las condiciones del cultivo fueron las siguientes: 28ºC, 1 vvm de aire, 400 rpm. Agente antiespumante: PPG de Sigma. Inóculo: 10% (volumen/volumen) de un cultivo en matraz en fase estacionaría, en YP.

En la Tabla 6 se resumen los resultados de la fermentación.

TABLA 6

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Fase 2

La biomasa obtenida a partir del lote anteriormente mencionado fue tratada del modo descrito en el Ejemplo 1 (Fase 8) con objeto de obtener una disolución concentrada de GSH (aproximadamente 6 g/l). Se ajustó el pH de 1 l de esta disolución a 1,8 mediante H_{2}SO_{4} y luego se trató la disolución con 10 ml de una suspensión que contenía 1,4 g de Cu_{2}O en agua. La suspensión fue vertida muy despacio mientras se mantenía la temperatura a 4ºC. La disolución fue luego agitada lentamente a 4ºC durante dos horas y fue luego dejada en reposo durante la noche.

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Fase 3

Una vez separado por filtración, el precipitado (9 g) fue lavado varias veces con H_{2}SO_{4} diluido y fue luego solubilizado mediante H_{2}S a temperatura ambiental. Luego se aplicó la disolución, que contenía 4,5 g de GSH, a 1 l de SP 207, una resina no iónica producida por Mitsubishi Chemical, realizándose luego la elución con 10 BV de agua desmineralizada. Se recogieron fracciones (6 l) que fueron concentradas y tratadas con etanol al 50% en agua para que precipitara el GSH. Se obtuvieron 3,5 g de un GSH que mostraba una pureza de 99%.

Ejemplo 5

La biomasa obtenida de acuerdo con los Ejemplos 1 y 4 fue tratada del modo descrito en el Ejemplo 1 (Fase 8) con objeto de obtener una disolución concentrada de GSH (aproximadamente 6 g/l). Se ajustó el pH de 1 l de esta disolución a 1,8 mediante H_{2}SO_{4} y se calentó la disolución a 40ºC en un baño de agua.

Se añadieron 10 ml de una suspensión de Cu_{2}O (1,5 g) en agua, a una temperatura de 40ºC.

Después de 3 minutos, se llevó rápidamente la temperatura de la disolución resultante a 4ºC y luego se mantuvo la disolución bajo agitación durante 2 horas.

Después de 2 horas, se procedió a realizar una filtración como en el Ejemplo 3 (Fase 3). Después de la filtración, el precipitado (0,5 g) fue disuelto en H_{2}S, purificado con SP 207, una resina no iónica producida por Mitsubishi Chemical, y precipitado en etanol. Se obtuvieron 3,6 g de un GSH que tenía una pureza de 99%.

Claims

1. Un procedimiento de fermentación para producir glutatión, que comprende:

(\beta): agitar la suspensión resultante a 300-600 rpm; y

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación previa, en el que cualquiera de las operaciones (a) y/o (b) y/o (c) se lleva a cabo en un medio nutriente acuoso, líquido o sólido que comprende al menos uno de los compuestos siguientes:

(ii) un peróxido;

(iii) un aldehído

(iv) un hidroperóxido; y

(v) un ácido graso y/o un derivado lineal o ramificado, y saturado o insaturado, del mismo;

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación previa, en el que el compuesto (i) es una sal inorgánica mineral, soluble en agua.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en el que el medio comprende al menos un aminoácido y/o una fuente de fósforo y/o un alcohol.

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que, en la operación (a), el contenido de glutatión por unidad de biomasa es superior a 1,6% en peso/peso con respecto al peso en estado seco.

6. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la operación (b) es llevada a cabo a 20-50ºC durante 12-72 horas y la densidad de la biomasa cultivada resultante es entre 50 y 65 g/l con respecto al peso en estado seco.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la operación (b) es llevada a cabo a 25-45ºC durante 12-48 horas.

8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que cualquiera de las operaciones (a) y/o (b) y/o (c) es llevada a cabo de modo continuo o discontinuo.

9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que la fuente de carbono procede de residuos agrícolas y/o industriales.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación previa, en el que la fuente de carbono comprende al menos una de las sustancias siguientes: azúcares, ácidos orgánicos, alcoholes, aldehídos, glicerol, grasas, aceites, hidrocarburos y suero de leche.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, en el que la fuente de carbono comprende melaza de remolacha.

12. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que la fuente de nitrógeno comprende al menos una de las sustancias siguientes: extracto de malta, extracto de embrión de maíz, producto de hidrólisis enzimática de caseína, harina de soja, levadura seca, peptona, peptona de soja, extracto de carne, nitrato, aminoácidos, caseína y sales amónicas.

13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación previa, en el que la fuente de nitrógeno comprende nitrato amónico o sulfato amónico.

14. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que cualquiera de las operaciones (a) y/o (b) y/o (c) se lleva a cabo por gaseamiento con aire u oxígeno gaseoso y/o una mezcla de los mismos.

15. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que, en la operación (\alpha), la disolución acuosa contiene glutamato, glicocola y cisteína 0,001-0,01 M.

16. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que el fermentador que se va a utilizar es un fermentador de gaseamiento-agitación o de agitación y gaseamiento por inyección de aire.

17. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que el glutatión de la operación (d) es extraído por lisis en un pH de 0,5-3,0 y a una temperatura de 70-90ºC.

18. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que el glutatión de la operación (d) es extraído por medio de una resina catiónica fuerte y, posteriormente, una resina no iónica.