CN114958617A - 一株高产麦角硫因的糙皮侧耳及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高产麦角硫因的糙皮侧耳及其应用。本发明提供了糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 20211052。本发明还提供了该菌株配套的发酵高产麦角硫因的工艺，摇瓶发酵液中麦角硫因的含量超过500mg/L。为满足食品安全的要求，本发明使用的发酵原料优选可食用的原料。

Description

一株高产麦角硫因的糙皮侧耳及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株高产麦角硫因的糙皮侧耳及其应用。

背景技术

麦角硫因(L-Ergothioneine)是一种多功能的细胞生理保护剂[刘琦,姜文侠,杨萍,周涛.麦角硫因——多功能的生理细胞保护剂[J].天然产物研究与开发,2013,25(增刊):160-164,85.]，有建议将麦角硫因称为“长寿维生素”(Longevity Vitamin)[BruceN.Ames.Prolonging healthy aging:Longevity vitamins and proteins[J].PNAS,2018,115(43):10836-10844.]。麦角硫因的抗氧化活性高于维生素C、维生素E、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸等抗氧化剂，对脂质过氧化的抑制率是辅酶Q10的2.7倍[Franzoni F,ColognatoR,Galetta F,et al.An in vitro study on the free radical scavenging capacityofergothioneine:comparison with reduced glutathione,uric acid,and Trolox[J].Biomed Pharmacother,2006,60:453–457.]，对自由基的清除率是艾地苯的2.8倍[KellyK Dong,MS,Niusha Damaghi,BA,Jeannie Kibitel,MS,et al.A comparison of therelative antioxidant potency of L-ergothioneine and idebenone[J].Journal ofCosmetic Dermatology,2007,6:183-188.]，在食品、饮料、化妆品和医药等行业具有广阔的应用前景。在美国，麦角硫因是属于公认安全的(generally recognized as safe，GRAS)产品。2018年欧盟委员会批准法国四面体公司合成的L-麦角硫因可以添加到无酒精饮品、牛奶饮品、乳制品、谷物棒等食品中[(EU)2018/462.THE EUROPEANCOMMISSION.Authorising an extension of use of L-ergothioneine as a novel foodunder Regulation(EU)2015/2283of the European Parliament and of the Council,and amending Commission Implementing Regulation(EU)2017/2470[Z].2018-03-21.]。

麦角硫因的制备方法包括天然生物提取法、化学合成法和生物合成法。生物合成法具有成本低，原料易获取，反应条件温和，产量易扩大等优点。如果使用可食用的菌种和发酵原料，制备可食用的麦角硫因发酵液，则可以发挥发酵液全成分利用的优势，不仅能节省麦角硫因的纯化成本，又能减少高浓度废水的排放。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产麦角硫因的天然蕈菌糙皮侧耳及其应用。

第一方面，本发明要求保护一种糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)，俗称“平菇”。

本发明要求保护的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)具体为糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 20211052。

所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015的18S rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示。

所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015的28S rDNA基因序列如SEQ ID No.2所示。

所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015的ITS序列如SEQ ID No.3所示。

第二方面，本发明要求保护前文第一方面中所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015的培养物。

本发明要求保护的所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015的培养物是将所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015在培养基(如真菌培养基)中培养得到的物质(培养容器内的所有物质)。

上述培养物中，所述物质包括所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015(菌体自身)和所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015的代谢物。

上述培养物中，所述培养基可为固体培养基或液体培养基。

进一步地，所述培养基可为用于培养蕈菌的培养基。

更进一步地，所述培养基具体可为后文所述发酵培养基。

术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体培养基的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。

第三方面，本发明要求保护一种菌剂。

本发明要求保护的菌剂含有前文第一方面中所述的糙皮侧耳(Pleurotusostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015。

进一步地，所述菌剂为用于生产麦角硫因的菌剂。

上述菌剂中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为微生物领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为植物材料或高分子化合物；所述植物材料可为活性炭、玉米粉、玉米芯、麸皮、米糠、稻壳、谷粒、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为植物油或水。

上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

第四方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的糙皮侧耳(Pleurotusostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的菌剂在如下任一中的应用：

(A1)生产麦角硫因；

(A2)制备用于生产麦角硫因的产品；

(A3)制备含有麦角硫因的产品。

第五方面，本发明要求保护一种生产麦角硫因的方法。

本发明要求保护的生产麦角硫因的方法，可包括如下步骤：对前文第一方面中所述的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015进行发酵培养，从发酵产物中获得麦角硫因。

进一步地，对所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015进行发酵培养时，采用的碳源可为甘油和/或麦芽糊精。

进一步地，对所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015进行发酵培养时，采用的氮源可为有机氮源；优选为酪蛋白胨或/和干酪素水解产物。

进一步地，对所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015进行发酵培养时，还可包括向培养体系中加入如下化合物中的全部或部分的步骤：甜菜碱、吐温80和精氨酸。

其中，所述甘油在培养体系中的终浓度可为50-80g/L，如60-80g/L，如70g/L。所述酪蛋白胨或/和干酪素水解产物在培养体系中的终浓度可为25-55g/L，如35-55g/L，如45g/L。所述甜菜碱在培养体系中的终浓度可为0.4-2.8g/L，如1.2-2.4g/L，如1.6g/L。所述吐温80在培养体系中的终浓度可为0.5-4.0g/L，如1.5-3.5g/L，如2.0g/L。所述精氨酸在培养体系中的终浓度可为0.5-4.0g/L，如1.0-3.0g/L，如2.0g/L。

更加具体地，对所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015进行发酵培养时，采用的发酵培养基的组成为：甘油70g/L，酪蛋白胨45g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，蛋氨酸3g/L，组氨酸0.15g/L，半胱氨酸0.9g/L，甜菜碱1.6g/L，吐温80 2g/L，精氨酸2g/L，其余为水。

或者，对所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015进行发酵培养时，采用的发酵培养基的组成为：甘油70g/L，干酪素水解物45g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，蛋氨酸3g/L，组氨酸0.15g/L，半胱氨酸0.9g/L，甜菜碱1.6g/L，吐温802g/L，精氨酸2g/L，其余为水。

进一步地，对所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015进行发酵培养时，发酵条件可为：22～30℃(如25℃)振荡(如150r/min)培养10～20d(如14d或18d)。

第六方面，本发明要求保护用于生产麦角硫因的成套产品。

本发明要求保护的用于生产麦角硫因的成套产品，可含有如下(B1)和(B2)：

(B1)前文第一方面中所述的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的菌剂；

(B2)前文第五方面中的所述发酵培养基。

进一步地，所述成套产品由所述(B1)和所述(B2)组成。

第七方面，本发明要求保护前文第六方面所述成套产品在生产麦角硫因中的应用。

在上述各方面中，所述干酪素水解物为用蛋白酶或酸水解干酪素后所得产物(包括肽、氨基酸等，还含有微量元素等)。其中，所述蛋白酶可为胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等。

在本发明的一个方案中，所述干酪素水解物可按照包括如下步骤的方法制备得到：称取100g干酪素，加入1L水搅拌，90℃加热30min，冷却至室温，调节pH至蛋白酶的适宜pH(如：胰蛋白酶：pH 7.8-9.0，胃蛋白酶：pH 1.5-5.0，菠萝蛋白酶：pH 6.0-6.8，木瓜蛋白酶：pH 6.0-7.0)。按照每克干酪素加入胰蛋白酶或胃蛋白酶或菠萝蛋白酶或木瓜蛋白酶1000-3000U，30-55℃酶解3-8h。酶解后经脱水制成固态的干酪素水解物。进一步地，在酶解和脱水之间还可包括终止反应的步骤，如80℃灭酶10min。

在本发明的另一个方案中，所述干酪素水解物可按照包括如下步骤的方法制备得到：称取100g干酪素，加入1L水搅拌，将干酪素和浓盐酸或硫酸或磷酸按照1∶0.5-1∶0.8的质量/体积比(g/mL)混合，85-100℃水解2-6h。水解后经中和、过滤、浓缩、脱色，得到干酪素水解液，脱水制成固态的干酪素水解物。

本发明提供了一株糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)新菌株——TIB.BPE.12015，并且提供了由其制备麦角硫因的高产工艺。本发明中麦角硫因的发酵水平高，摇瓶发酵液中麦角硫因的含量超过500mg/L。为满足食品安全的要求，本发明使用的发酵原料优选可食用的原料。

保藏说明

分类命名：糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)；

参据的生物材料：TIB.BPE.12015；

保藏机构：中国典型培养物保藏中心；

保藏机构简称：CCTCC；

地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号；

保藏日期：2021年8月18日；

保藏中心保藏编号：CCTCC NO:M 20211052。

附图说明

图1为菌株TIB.BPE.12015在培养基平板中的正面(左)和反面(右)照片。

图2为TIB.BPE.12015菌丝体的番红染色-光学显微镜镜检照片(400×)。

图3为基于ITS序列分析所绘制的系统树。图中Sample为菌株TIB.BPE.12015。

图4为不同碳源对TIB.BPE.12015发酵合成麦角硫因的影响。

图5为不同氮源对TIB.BPE.12015发酵合成麦角硫因的影响。

图6为培养基中添加不同浓度的甜菜碱对麦角硫因发酵水平的影响。图中对照组未添加甜菜碱。

图7为培养基中添加不同浓度的吐温80对麦角硫因发酵水平的影响。对照组未添加吐温80。

图8为培养基中添加不同浓度的精氨酸对麦角硫因发酵水平的影响。对照组未添加精氨酸。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、TIB.BPE.12015菌株的形态

菌株TIB.BPE.12015从子实体组织分离获得。

TIB.BPE.12015菌丝体呈绒毛状，白色，背面淡黄色，菌落形态见图1。

图2是菌丝体的番红染色-光学显微镜检照片。

实施例2、TIB.BPE.12015菌株的鉴定

18S rDNA基因序列的鉴定：提取TIB.BPE.12015菌株的DNA，使用引物NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC和NS8：TCCGCAGGTTCACCTACGGA进行PCR扩增，测定18S rDNA基因序列，其序列如SEQ ID No.1所示。将该序列与GenBank核酸序列数据库进行BLAST比对，获得同源性分析结果，TIB.BPE.12015与Pleurotus ostreatus(GenBank号MT644908.1)序列的同源性为99.88％。

28S rDNA基因序列的鉴定：提取TIB.BPE.12015菌株的DNA，使用引物NL1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG和NL4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG进行PCR扩增，测定28S rDNA基因序列，其序列如SEQ ID No.2所示。将该序列与GenBank核酸序列数据库进行BLAST比对，获得同源性分析结果，TIB.BPE.12015与Pleurotus ostreatus(GenBank号MH877725.1)序列的同源性为99.66％。

ITS序列鉴定：提取TIB.BPE.12015菌株的DNA，使用引物ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’和ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’进行PCR扩增，测定位于18S rDNA的3′端与28S rDNA的5′端之间的核糖体内转录间隔区(internal transcribedspacers，ITS)的序列，其ITS序列如SEQ ID No.3所示。将该序列与GenBank核酸序列数据库进行BLAST比对，获得同源性分析结果，TIB.BPE.12015与Pleurotus ostreatus TENN53662(Type material,GenBank号NR 163515.1)序列的同源性为100％，因此，鉴定TIB.BPE.12015菌株为糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)。图3为基于ITS序列分析所绘制的系统树。

糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015菌株于2021年8月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号。保藏编号CCTCC NO:M 20211052。后文简称糙皮侧耳TIB.BPE.12015或TIB.BPE.12015。

实施例3、糙皮侧耳TIB.BPE.12015菌丝体发酵制备麦角硫因

种子培养基：玉米粉30g/L，豆粕粉15g/L，α-淀粉酶54U/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，其余为水(各物质的浓度均为在培养基中的终浓度)。装液量为150mL/500mL三角瓶，自然pH。121℃灭菌30min。

发酵基础培养基：麦芽糊精50g/L，酵母浸粉35g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O1.5g/L，蛋氨酸3g/L，半胱氨酸0.9g/L，组氨酸0.15g/L，其余为水(各物质的浓度均为在培养基中的终浓度)。装液量为150mL/500mL三角瓶，自然pH。121℃灭菌20min。

发酵培养方法：每瓶种子培养基接种TIB.BPE 12015的斜面菌苔约3-4cm²，于25℃、150r/min振荡培养4.5d，得到液体种子。将制备的液体种子按6.7％(v/v)的接种量接入发酵基础培养基，于25℃、150r/min振荡培养14天，得到麦角硫因菌丝体发酵液。

实施例4、麦角硫因的浸提

发酵结束后，将发酵液置于90℃水浴，350r/min搅拌浸提30min，菌丝体内的麦角硫因被浸提到细胞外。浸提结束，将浸提液定容至发酵初始的体积，4℃、6000rpm离心10min。收集离心上清液，置于截留分子量为3kDa的超滤离心管，于4℃、11000rpm离心10min，透过液用于检测麦角硫因的含量。透过液中麦角硫因的浓度即是发酵液中麦角硫因的浓度。

实施例5、麦角硫因的定量检测

采用高效液相色谱法测定麦角硫因的含量。HPLC条件：色谱柱为Zorbax SB-Aq柱(5μm，4.6mm×250mm)，柱温30℃，检测波长257nm。流动相A为1％甲醇(体积百分含量1％的甲醇和99％的水)，流动相B为甲醇。进样量5μL，流速0.7mL/min。洗脱程序为：流动相A，100％，8min；流动相A，100-30％，12min(流动相A的含量变化是梯度线性变化)；流动相A，30％-0，4min(流动相A的含量变化是梯度线性变化)；流动相B，100％，6min；流动相B，100％-0，1min(流动相B的含量变化是梯度线性变化)；流动相A，100％，7min。上述％均表示体积百分含量。

精密称量10mg的麦角硫因对照品，溶解于5mL的超纯水中，转移至10mL的容量瓶，使用超纯水定容、混匀，配制成浓度为1000mg/L的对照品储备液。使用超纯水将储备液依次稀释至浓度为400mg/L、200mg/L、100mg/L、50mg/L和25mg/L的对照品溶液，也可根据需要按照比例配制其它浓度的对照品溶液，利用外标法定量测定样品中麦角硫因的浓度。

实施例6、不同碳源对TIB.BPE.12015发酵合成麦角硫因的影响

将实施例3中发酵基础培养基的麦芽糊精分别替换为等质量的：糊精、可溶性淀粉、葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘油、玉米粉，其他组分及含量不变，按照实施例3的方法进行发酵培养，发酵14天。按照实施例4和实施例5的方法测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见图4。以甘油为碳源时发酵液中麦角硫因的含量为198.65±2.98mg/L。

实施例7、不同氮源对TIB.BPE.12015发酵合成麦角硫因的影响

以等质量甘油替换实施例3中发酵基础培养基的麦芽糊精，并将其中的酵母浸粉分别替换为等质量的：蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、豆粕粉、豆饼粉、麦芽浸粉、脱脂奶粉、酪蛋白、花生饼粉、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵，其他组分及含量不变，按照实施例3的方法进行发酵培养，发酵14天。按照实施例4和实施例5的方法测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见图5。当氮源为酪蛋白胨时发酵液中麦角硫因的含量达到283.14±5.16mg/L。

实施例8、碳源与氮源的含量对TIB.BPE.12015发酵合成麦角硫因的影响

将实施例3中发酵基础培养基的麦芽糊精替换为不同含量的甘油，并将酵母浸粉替换为不同含量的酪蛋白胨，发酵基础培养基的其他组分及含量不变，按照实施例3的方法进行发酵培养，发酵14天，按照实施例4和实施例5的测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表1。

表1、甘油与酪蛋白胨的含量对麦角硫因发酵水平的影响

实施例9、促进剂对TIB.BPE.12015发酵合成麦角硫因的影响

(1)甜菜碱对麦角硫因发酵水平的影响

发酵培养基：甘油70g/L，酪蛋白胨45g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，蛋氨酸3g/L，半胱氨酸0.9g/L，组氨酸0.15g/L，分别添加0.4g/L、0.8g/L、1.2g/L、1.6g/L、2.0g/L、2.4g/L、2.8g/L和3.2g/L的甜菜碱，其余为水。装液量150mL/500mL三角瓶，自然pH，121℃灭菌20min。

按照实施例3的方法发酵18天，按照实施例4和实施例5的方法测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见图6。当甜菜碱浓度为1.6g/L时，麦角硫因的积累量达到409.28±6.02mg/L，比对照组(不添加甜菜碱)376.41±2.24mg/L提高了8.7％。

(2)吐温80对麦角硫因发酵水平的影响

发酵培养基：甘油70g/L，酪蛋白胨45g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，蛋氨酸3g/L，半胱氨酸0.9g/L，组氨酸0.15g/L，甜菜碱1.6g/L，分别添加0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L和4.0g/L的吐温80，其余为水。装液量150mL/500mL三角瓶，自然pH，121℃灭菌20min。

按照实施例3的方法发酵18天，按照实施例4和实施例5的方法测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见图7。当吐温80浓度为2g/L时，麦角硫因的积累量达到441.59±5.35mg/L，比对照组(不添加吐温80)402.34±10.51mg/L提高了9.8％。

(3)精氨酸对麦角硫因发酵水平的影响

发酵培养基：甘油70g/L，酪蛋白胨45g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，蛋氨酸3g/L，半胱氨酸0.9g/L，组氨酸0.15g/L，甜菜碱1.6g/L，吐温80 2.0g/L，分别添加0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L、4.5g/L和5.0g/L的精氨酸，其余为水。装液量150mL/500mL三角瓶，自然pH，121℃灭菌20min。

按照实施例3的方法发酵18天，按照实施例4和实施例5的方法测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见图8。当精氨酸浓度为2.0g/L时，麦角硫因的积累量达到504.69±13.41mg/L，比对照组(不添加精氨酸)451.60±6.73mg/L提高了11.8％。

实施例10、以干酪素水解物作为氮源发酵制备麦角硫因

制备干酪素水解物：称取100g干酪素，加入1L水搅拌，90℃加热30min，冷却至室温，以碳酸氢钠溶液调节pH至8.0。每克干酪素加入胰蛋白酶1000U，40℃酶解4h，然后80℃灭酶10min。冷冻干燥成固态的干酪素水解物。

配制发酵培养基：甘油70g/L，上述干酪素水解物45g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O1.5g/L，蛋氨酸3g/L，组氨酸0.15g/L，半胱氨酸0.9g/L，甜菜碱1.6g/L，吐温80 2g/L，精氨酸2g/L，其余为水(各物质的浓度均为在培养基中的终浓度)。121℃灭菌20min。

按照实施例3的方法将TIB.BPE.12015的液体种子接种至上述发酵培养基，于25℃、150r/min振荡培养18天。按照实施例4和实施例5的方法测定发酵液中麦角硫因的含量为510.29±6.21mg/L。

实施例11、发酵优化对麦角硫因发酵水平的影响

对比TIB.BPE.12015菌株的实施例3(发酵优化前)和实施例10(发酵优化后)，麦角硫因的发酵积累量提高了2.2倍，见表2。

表2、发酵培养基优化前后麦角硫因发酵水平的对比

实施例12、二株菌的麦角硫因发酵比对

按照实施例10的培养基和培养条件，分别培养中国专利CN 105296559 B的糙皮侧耳CGMCC No.6232菌株和本发明中的TIB.BPE.12015菌株，发酵结束按照实施例4和实施例5的方法测定发酵液中麦角硫因的含量，并与CN 105296559 B专利中的麦角硫因最高发酵水平及其培养方法进行了比较，结果见表3。菌株TIB.BPE.12015的麦角硫因的发酵水平达到513.07±11.29mg/L，比CGMCC No.6232菌株的麦角硫因最高发酵水平315.7mg/L提高了62.5％。

表3、糙皮侧耳CGMCC No.6232与TIB.BPE.12015的麦角硫因发酵水平对比

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一株高产麦角硫因的糙皮侧耳及其应用

<130> GNCLN213682

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1711

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm

<400> 1

agtacgatgt ctagtataaa caaatttgta ctgtgaaact gcgaatggct cattaaatca 60

gttatagttt atttgatggt accttgctac atggataact gtggtaattc tagagctaat 120

acatgcaatc aagccccgac ttctggaagg ggtgtattta ttagataaaa aaccaacgcg 180

gctcgccgct cccttggtga ttcataataa cttctcgaat cgcatggcct tgtgccggcg 240

atgcttcatt caaatatctg ccctatcaac tttcgatggt aggatagagg cctaccatgg 300

tttcaacggg taacggggaa taagggttcg attccggaga gggagcctga gaaacggcta 360

ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccgacacgg ggaggtagtg 420

acaataaata acaatatagg gctcttttgg gtcttataat tggaatgagt acaatttaaa 480

tcccttaacg aggaacaatt ggagggcaag tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc 540

tccaatagcg tatattaaag ttgttgcagt taaaaagctc gtagttgaac ttcagacctg 600

gctgggcggt ccgcttaacg gcgtgtactg gtctggctgg gccttacctc ttggtgagcc 660

ggcgtgccct ttattggtgt gcgttgggga accaggactt ttaccttgag aaaattagag 720

tgttcaaagc aggcctgtgc ctgaatacat tagcatggaa taataaaata ggacgtgcgg 780

ttctattttg ttggtttcta gagtcgccgt aatgattaat agggatagtt gggggcattg 840

gtattgagtc gctagaggtg aaattcttgg attgactcaa gaccaactac tgcgaaagca 900

tttgccaagg atgttttcat taatcaagaa cgaaggttag gggatcgaaa acgatcagat 960

accgttgtag tcttaacagt aaactatgcc gactagggat cgggcaatct caaacatgat 1020

gtgttgctcg gcaccttacg agaaatcaaa gtctttgggt tctgggggga gtatggtcgc 1080

aaggctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag ggcaccacca ggtgtggagc ctgcggctta 1140

atttgactca acacggggaa actcaccagg tccagacata actaggattg acagattgat 1200

agctctttca tgattttatg ggtggtggtg catggccgtt cttagttggt ggagtgattt 1260

gtctggttaa ttccgataac gaacgagacc ttaacctgct aaatagccag gccggctttc 1320

gctggtcgcc ggcttcttag agggactgtc agcgtctagc tgacggaagt ttgaggcaat 1380

aacaggtctg tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc gcgctacact gacagagcca 1440

gcgagttttt ttccttggcc ggaaggtctg ggtaatcttg tgaaactctg tcgtgctggg 1500

gatagagcat tgcaattatt gctcttcaac gaggaatacc tagtaagcgt gagtcatcag 1560

ctcgcgttga ttacgtccct gccctttgta cacaccgccc gtcgctacta ccgattgaat 1620

ggcttagtga ggtctccgga ttggctttgg ggagccggcg acggcaccct attgctgaga 1680

agttgatcaa acttggtcat tagaggaagt a 1711

<210> 2

<211> 598

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm

<400> 2

cctgctggat tccctagtac tgcgagtgaa gcgggaaaag ctcaaattta aaatctggtg 60

gtctttggcc atccgagttg taatctagag aagtgttatc cgcgctggac cgtgtacaag 120

tcccctggaa tggggcgtca tagagggtga gaatcccgtc tttgacacgg actaccaggg 180

ctttgtgatg cactctcaaa gagtcgagtt gtttgggaat gcagctcaaa atgggtggta 240

aattccatct aaagctaaat attggcgaga gaccgatagc gaacaagtac cgtgagggaa 300

agatgaaaag aactttggaa agagagttaa acagtacgtg aaattgttga aagggaaacg 360

cttgaagtca gtcgcgtctg ccagggatca accttacttt tgtgaggcgt acttcctggt 420

tgatgggtca gcatcagttt tggtcgctgg ataaaggtca gagaaatgtg gcaccttcgg 480

gtgtgttata gtctttgatc agatacagtg gctgggactg aggaactcag cgccgcaagg 540

ctgtcttagg atgctggcaa aatggcttta atcgacccgt cttgaacccc ccggacca 598

<210> 3

<211> 620

<212> DNA

<213> Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm

<400> 3

tgtccttgcg gacgattaga gagctggact ctattcatgc gtgctattga tgagtgataa 60

ttatcacatc atgcgcagag gcaatgagaa gtcctgctaa tgcatttaag aggagccgac 120

ctgtcaaggc cagcagcccc caacaatcca aacatcacaa ttggaaagaa accaaagtga 180

gtttgagaat ttaatgacac tcaaacaggc atgcccctcg gaataccaag gggcgcaagg 240

tgcgttcaaa gattcgatga ttcactgaat tctgcaattc acattactta tcgcatttcg 300

ctgcgttctt catcgatgcg agagccaaga gatccgttgt tgaaagttgt attatggttt 360

aaaggcacaa ggcccattaa atgacattcg tagacataca tttggggtgt gtaagtaaat 420

agactgcgta gtcacaccga gacgtttaaa tcccagcaac caagtctgac gacttgagag 480

acgacttcac agatctatca aaagttcaca ggtggttgaa agactagtga agcgtgcaca 540

tgcccctaga ggccagcaac aactccatag tgaattcatt aatgatcctt ccgcaggttc 600

acctacggaa accttgttac 620

Claims (10)

1.糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 20211052。

2.权利要求1所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015的培养物，是将权利要求1所述的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015在培养基中培养得到的物质。

3.菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015。

4.权利要求1所述的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的菌剂在如下任一中的应用：

(A1)生产麦角硫因；

(A2)制备用于生产麦角硫因的产品；

(A3)制备含有麦角硫因的产品。

5.一种生产麦角硫因的方法，包括如下步骤：对权利要求1所述的糙皮侧耳(Pleurotusostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015进行发酵培养，从发酵产物中获得麦角硫因。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：对所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015进行发酵培养时，采用的碳源为甘油和/或麦芽糊精；

和/或

对所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015进行发酵培养时，采用的氮源为有机氮源；

进一步地，所述有机氮源为酪蛋白胨或/和干酪素水解物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：对所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015进行发酵培养时，还包括向培养体系中加入如下化合物中的全部或部分的步骤：甜菜碱、吐温80和精氨酸。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述甘油在培养体系中的终浓度为50-80g/L，如60-80g/L，再如70g/L；和/或

所述酪蛋白胨或/和干酪素水解物在培养体系中的终浓度为25-55g/L，如35-55g/L，再如45g/L；和/或

所述甜菜碱在培养体系中的终浓度为0.4-2.8g/L，如1.2-2.4g/L，再如1.6g/L；和/或

所述吐温80在培养体系中的终浓度为0.5-4.0g/L，如1.5-3.5g/L，如2.0g/L；和/或

所述精氨酸在培养体系中的终浓度为0.5-4.0g/L，如1.0-3.0g/L，如2.0g/L。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：对所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015进行发酵培养时，采用的发酵培养基的组成为：甘油70g/L，酪蛋白胨45g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，蛋氨酸3g/L，组氨酸0.15g/L，半胱氨酸0.9g/L，甜菜碱1.6g/L，吐温80 2g/L，精氨酸2g/L，其余为水；和/或

对所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015进行发酵培养时，采用的发酵培养基的组成为：甘油70g/L，干酪素水解物45g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，蛋氨酸3g/L，组氨酸0.15g/L，半胱氨酸0.9g/L，甜菜碱1.6g/L，吐温80 2g/L，精氨酸2g/L，其余为水；和/或

对所述糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015进行发酵培养时，发酵条件为：22～30℃振荡培养10～20d。

10.用于生产麦角硫因的成套产品，含有如下(B1)和(B2)：

(B1)权利要求1所述的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm)TIB.BPE.12015或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的菌剂；

(B2)权利要求9中的所述发酵培养基；

或

所述成套产品在生产麦角硫因中的应用。

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