WO2015180492A1 - 制备麦角硫因的方法 - Google Patents

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  • the fermentation broth was prepared according to the method of Comparative Example 1, except that 5 g/L, 10 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L, and 35 g/L of bean cake powder were used instead of the same concentration. Soybean meal is used as a nitrogen source for seed culture. The mycelium of CGMCC No.6232 of Pleurotus ostreatus was fermented and cultured, and the content of ergothione in the fermentation broth was measured. The results are shown in Tables 1 and 2.
  • the content of ergothione in the extracellular filtrate was also determined, and it was found that the above concentration was added. Tween 80 can increase the content of extracellular ergot thiol. When 10g/L is added, the content of ergothione in the extracellular filtrate is the highest, reaching 18.72mg/L, which is 114.4% higher than the control group 8.73mg/L. .

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Abstract

本发明公开了一种改进的制备麦角硫因的方法，该方法包括如下步骤：（a）将糙皮侧耳（ Pleurotus ostreatus）CGMCC No.6232菌种接种至种子培养基，培养制备种子液，其中所述种子培养基使用豆饼粉作为氮源；和（b）将种子液接种至发酵培养基，然后培养得糙皮侧耳菌丝体发酵液。

Description

制备麦角硫因的方法 技术领域
本发明属于生物资源、生物工程、发酵工程及天然产物的生物合成领域。更具体地，本发明涉及一种以更高的产量制备麦角硫因的方法。
背景技术
麦角硫因(L-Ergothioneine，EGT)是一种稀有的天然手性氨基酸，作为生物体内重要的生理活性物质，起着抗氧化，防止紫外辐射损伤，调节细胞内的氧化还原反应，螯合二价金属离子，参与细胞内的能量调节等诸多生物学功能，是一种多功能的细胞生理保护剂(刘琦，姜文侠，杨萍，周涛.麦角硫因——多功能的生理细胞保护剂[J].天然产物研究与开发，2013，25(增刊)：160-164.)。麦角硫因是通常认为安全的(generally recognized as safe，GRAS)产品，性能稳定，在医药、生物医学、食品、保健食品、食品添加剂和化妆品等行业具有重要的应用价值和广阔的应用前景。
由于目前麦角硫因的制备成本高，限制了其应用。与化学合成法和天然生物提取法相比，利用食用菌深层发酵制备麦角硫因，可以通过建立高强度发酵过程控制策略，提高麦角硫因的积累量，实现大规模的高效生产，降低生产成本，而且具有产品安全等优势，是合成麦角硫因的发展方向(刘琦，张维亚，姜文侠，梅保良，周涛.麦角硫因生物合成技术的研究进展[C].2013年国际氨基酸产业发展高峰论坛论文集.2013：22-27.)。
日本Pramvadee Tepwong等利用香菇(Lentinula edodes)菌丝体深层发酵制备麦角硫因，发酵第15天时发酵液中麦角硫因的产量为23.6mg/L(Pramvadee Tepwong，Anupam Giri，Fumito Sasaki.Mycobial enhancement of ergothioneine by submerged cultivation of edible mushroom mycelia and its application as an antioxidative compound[J].Food Chemistry，2012，131：247-258.)；韩国Wi Young Lee等利用紫黑灵芝(Ganoderma neo-japonicum)菌丝体发酵合成麦角硫因，发酵结束时发酵液中麦角硫因的含量达57.5mg/L(Wi Young Lee，Eung-Jun  Park，Jin Kwon Ahn.Supplementation of methionine enhanced the ergothioneine accumulation in the Ganoderma neo-japonicum mycelia[J].Appl Biochem Biotechnol，2009，158：213-221.)；台湾黄龄谊和Chih-Hung Liang对杏鲍菇(Pleurotus eryngii)菌丝体进行液体发酵培养，培养结束后，发酵液中麦角硫因的产量分别达62.2mg/L(黄龄谊.高麦角硫因含量之杏鲍菇菌丝体深层培养及其生理活性[D].台湾：中兴大学，2010)和60.4mg/L(Chih-Hung Liang，Ling-Yi Huang，Kung-Jui Ho，et al.Submerged cultivation of mycelium with high ergothioneine content from the culinary-medicinal king oyster mushroom Pleurotus eryngii(higher basidiomycetes)and its composition[J].International Journal of Medicinal Mushrooms，2013，15(2)：153-164.)；姜文侠等利用糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)菌丝体发酵制备麦角硫因，通过对发酵培养基和发酵控制工艺的优化，发酵液中麦角硫因的含量达到135.7mg/L(姜文侠，刘琦，周涛.生产麦角硫因的菌株及制备麦角硫因的方法[P].CN 201210392417.8.)。
发明内容
本发明的目的是进一步提高中国发明专利申请CN 201210392417.8中麦角硫因的发酵产量，提供一种改进的制备麦角硫因的方法。将中国发明专利申请CN 201210392417.8的全部内容引入本文以供参考。
在中国发明专利申请CN 201210392417.8中，公开了一种制备麦角硫因的方法，包括如下步骤：
1)将糙皮侧耳CGMCC No.6232的固体菌种(优选PDA斜面菌种)接种至液体种子培养基，在19～31℃摇床100～200rpm培养至少3天，制备种子液；
2)将种子液按4～20％的接种量(V/V)接种至发酵培养基，然后在19～31℃摇床100～200rpm培养至少6天，得到糙皮侧耳菌丝体发酵液；
3)发酵结束后，将菌丝体发酵液升温至50～100℃，以0～600rpm搅拌浸提10～100min，麦角硫因从菌丝体的细胞内浸提到细胞外的发酵液中。
所述的液体种子培养基的组成为：玉米粉15～50g/L(优选25～40g/L)、豆粕粉10～35g/L(优选15～25g/L)、α-淀粉酶20～80U/L(优选30～65U/L)、磷酸二氢钾1～6g/L(优选2～4.5g/L)、硫酸镁0.2～5g/L(优选0.2～3g/L)，其余为水。
所述的发酵培养基的组成为：甘油10～80g/L，酪蛋白胨10～40g/L，磷酸二氢钾2～4g/L，硫酸镁0.5～2g/L，其余为水。
本发明的技术方案
根据本发明，使用糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)TIB.BPE.10010，作为发酵菌种发酵制备麦角硫因。该菌种已于2012年6月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.6232。
根据本发明进一步提高麦角硫因发酵产量的制备方法包括如下步骤：
(a)将糙皮侧耳CGMCC No.6232的菌种接种至种子培养基，培养制备种子液，其中所述种子培养基使用豆饼粉作为氮源；和
(b)将种子液接种至发酵基础培养基，然后培养得到糙皮侧耳菌丝体发酵液。
优选地，糙皮侧耳CGMCC No.6232获自PDA斜面培养基；种子培养基为：玉米粉15～50g/L(优选25～40g/L)、豆饼粉5～35g/L(优选15～35g/L)、α-淀粉酶20～80U/L(优选30～80U/L)、磷酸二氢钾1～6g/L(优选2～4.5g/L)、硫酸镁0.2～5g/L(优选0.2～3g/L)，其余为水；发酵基础培养基为：甘油10～95g/L(优选65～95g/L)、酪蛋白胨10～80g/L(优选40～80g/L)、磷酸二氢钾2～4g/L、硫酸镁0.5～2g/L，其余为水。
优选地，步骤(a)中的培养操作在19～31℃进行至少3天，步骤(b)中的培养操作在19～31℃进行至少6天，且步骤(b)中的接种量为4～20(V/V)％。
进一步，向发酵基础培养基中添加以下的任一种或多种物质：NH4Cl、NH4NO3、NaCl、聚乙二醇、叶酸、维生素B1(VB1)、吲哚丁酸、柠檬酸、丙酮酸、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨 酸、甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、吐温(tween，例如吐温60和吐温80)、司盘(span，例如司盘80)、壳聚糖、氟康唑(Fluconazole)、咪康唑(Miconazole)、酮康唑(Ketoconazole)、乙二胺四乙酸(EDTA)、异丙醇和二甲基亚砜，该添加步骤可以在发酵前或发酵的过程中进行。
优选地，向发酵基础培养基中添加以下量的任一种或多种物质：NH4Cl 0.5g/L～12g/L、NH4NO30.5g/L～10g/L、NaCl 0.5g/L～20g/L、聚乙二醇(例如PEG 6000)0.2g/L～5g/L、叶酸0.08g/L～2.56g/L、VB10.01g/L～0.8g/L、吲哚丁酸0.1mg/L～4mg/L、柠檬酸0.01g/L～0.8g/L、丙酮酸0.05g/L～4.5g/L、精氨酸0.1g/L～7g/L、赖氨酸0.1g/L～8g/L、亮氨酸0.02g/L～0.5g/L、天冬氨酸0.05g/L～9g/L、谷氨酸1μmol/L～100μmol/L、甜菜碱50mmol/L～250mmol/L、组氨酸0.1mmol/L～3mmol/L、半胱氨酸2mmol/L～45mmol/L、蛋氨酸3mmol/L～45mmol/L、吐温0.5g/L～50g/L(例如吐温602g/L～50g/L、吐温800.5g/L～40g/L)、司盘0.2g/L～10g/L(例如司盘800.2g/L～10g/L)、壳聚糖0.2g/L～0.4g/L、氟康唑2mg/L～80mg/L、咪康唑0.5mg/L～50mg/L、酮康唑0.5mg/L～50mg/L、乙二胺四乙酸(EDTA)0.05g/L～0.5g/L、异丙醇0.5％～2％(V/V)和二甲基亚砜0.5％～2％(V/V)。
进一步地，优选在步骤(b)的发酵过程中调控发酵温度至25～31℃。例如，将发酵开始时的温度控制在25℃，并从发酵第4天开始将温度控制在28～31℃直至发酵结束。
进一步地，优选在步骤(b)的发酵过程中调节发酵液pH至4.8～6.3。例如，在发酵开始后的第4天将pH控制到5.0～6.3并保持直至发酵结束。
进一步地，优选在步骤(b)的发酵过程中调节压力为0.05～0.1MPa，调节溶氧为15～30％。
在一个实施方式中，本发明的制备麦角硫因的方法包括如下步骤：(a)将糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)CGMCC No.6232的菌种接种至种子培养基，在25～28℃培养3～5天制备种子液，其中所述种子培养基包括25～40g/L玉米粉、15～35g/L豆饼粉、30～80U/Lα-淀粉酶、2～4.5g/L磷酸二氢钾、0.2～3g/L硫酸镁，其余为水；和(b)将 种子液以4～20(V/V)％的接种量接种至发酵基础培养基，在25～31℃培养至少6天，得到糙皮侧耳菌丝体发酵液，所述发酵基础培养基包括65～95g/L甘油、40～80g/L酪蛋白胨、2～4g/L磷酸二氢钾、0.5～2g/L硫酸镁、7.5～15mmol/L蛋氨酸、7.5～15mmol/L半胱氨酸，其余为水。
本发明的技术效果
使用豆饼粉作为糙皮侧耳CGMCC No.6232发酵合成麦角硫因的种子培养基的氮源，适当提高发酵培养基中甘油和酪蛋白胨的含量，向发酵基础培养基中添加NH4Cl、NH4NO3、NaCl、聚乙二醇、叶酸、维生素B1(VB1)、吲哚丁酸、柠檬酸、丙酮酸、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、吐温、司盘、壳聚糖、氟康唑、咪康唑、酮康唑、乙二胺四乙酸(EDTA)、异丙醇和二甲基亚砜中的任意一种或多种化合物，在发酵过程中调控发酵温度，在发酵过程中调节发酵液pH，并且/或者在发酵过程中调节压力和溶氧，可显著提高麦角硫因的发酵水平，产物的产率比对照组大幅度提高。特别地，在发酵基础培养基中添加吐温、氟康唑、咪康唑、酮康唑、乙二胺四乙酸(EDTA)、异丙醇和二甲基亚砜中的任意一种或多种化合物还可以提高胞外发酵液中麦角硫因的含量。
具体实施方式
本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。其它的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方式，落在本发明的保护范围之内。
实验仪器、材料：摇床(IS-RDV3，美国精骐有限公司)；75L自动控制发酵罐(BIO-DDCU型，赛多利斯斯泰迪生物技术有限公司)；高效液相色谱仪(Agilent 1260，Agilent Technologies)；水浴锅(TW20，Julabo公司)；数字式加热磁力搅拌器(MIX Control 20，WIGGENS公司)；电子分析天平(AB204-S，METTLER TOLEDO)；活塞式真空泵(V610，ChemVak)；超声波清洗机(SB-5200D型，宁波新芝生物科 技股份有限公司)；0.22μm孔径微孔滤膜(天津博纳艾杰尔科技有限公司)；中空纤维超滤膜(天津爱生膜过滤技术有限公司)。
主要试剂：麦角硫因对照品(纯度≥98％，Biomol International Inc.)；PDA培养基(Becton，Dickinson and Company)；甲醇等试剂为市售色谱纯；磷酸二氢钾、硫酸镁、柠檬酸购自国药集团化学试剂有限公司；玉米粉购自梅河口市兴达米业有限责任公司；豆饼粉和豆粕粉购自北京中棉紫光生物科技有限公司；甘油购自天津市风船化学试剂科技有限公司；酪蛋白胨购自偃师市百家工贸有限公司；NH4Cl、NH4NO3、NaCl、聚乙二醇、丙酮酸和司盘80购自天津市光复精细化工有限公司；α-淀粉酶、叶酸、VB1、吲哚丁酸、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、壳聚糖、氟康唑、咪康唑和酮康唑购自北京索莱宝科技有限公司；甜菜碱为潍坊祥维斯化学品有限公司产品；吐温60和吐温80购自北京索莱宝科技有限公司；EDTA购自成都格雷西亚化学技术有限公司；异丙醇购自天津市博纳艾杰尔科技有限公司；二甲基亚砜购自天津市光复精细化工研究所。
比较例1：麦角硫因菌丝体发酵液的制备及麦角硫因的检测
麦角硫因菌丝体发酵液的制备
种子培养基：玉米粉30g/L、豆粕粉15g/L、α-淀粉酶80U/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L，其余为水，于121℃灭菌20min，500mL三角瓶中的装液量为150mL。
发酵基础培养基：甘油50g/L、酪蛋白胨35g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L，其余为水，于121℃灭菌20min，500mL三角瓶中的装液量为150mL。
挑取PDA斜面菌种CGMCC No.6232的菌苔接入种子培养基，25℃、150rpm摇床培养4天，得到种子液。将种子液按体积比5％的接种量接入发酵基础培养基，25℃摇床150rpm培养15天，得菌丝体发酵液，大部分麦角硫因积累于菌丝体的细胞内。
如此制备的发酵液中麦角硫因含量为110.8mg/L，测定方法如下所述。
胞外滤液中麦角硫因含量检测的待测样品的制备
糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体深层发酵结束后，取20mL菌丝体发酵液，经白布过滤，收集滤液，再使用截留分子量为4kDa的超滤膜过滤，得到的透过液即为胞外滤液中麦角硫因含量检测的待测样。
发酵液中麦角硫因总含量检测的待测样品的制备
将菌丝体发酵液置于90℃水浴，200rpm搅拌浸提15min，使麦角硫因浸提到细胞外。过滤，收集滤液，使用截留分子量为4kDa的超滤膜过滤，得到的透过液即为发酵液中麦角硫因总含量检测的待测样。
麦角硫因的测定
对照品溶液的制备：精密称取麦角硫因对照品10mg，于25mL容量瓶中加纯水配制成浓度为400mg/L的对照品贮备液。再精密吸取贮备液适量，加纯水制成浓度分别为40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L和200mg/L的溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得对照品溶液。
定性与定量检测：相同色谱条件下，对麦角硫因对照品溶液与待测样品进行HPLC测定，将待测样品的色谱图与麦角硫因对照品溶液的色谱图进行对比，根据保留时间确定待测样品中的麦角硫因色谱峰。以麦角硫因对照品溶液的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线，在对照品溶液与待测样品进样量相同的情况下，用外标法定量，计算出待测样品中麦角硫因的含量，待测样品中麦角硫因的浓度即为发酵液中麦角硫因的浓度。
检测条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm)，两根色谱柱串联使用；流动相为1％甲醇溶液，使用乙酸-乙酸钠缓冲液调节流动相的pH为5.0；检测波长257nm；流速0.7mL/min；柱温25℃；进样量5μL。
实施例1：种子培养基的氮源及其含量对麦角硫因发酵积累量的影响
按照比较例1的方法制备发酵液，不同之处在于分别使用5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L的豆饼粉替代相同浓度的豆粕粉作为种子培养基的氮源。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表1和表2。
使用豆饼粉替代相同浓度的豆粕粉作为种子培养基的氮源，发酵液中麦角硫因的含量均有所提高，其中15g/L的豆饼粉试验组发酵液中麦角硫因的平均含量达125.5mg/L，与比较例1(110.8mg/L)相比提高了13.3％。另外，还测定了胞外滤液中麦角硫因的含量，最高为7.14mg/L。
表1.种子培养基中豆饼粉含量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000001
表2.种子培养基中豆粕粉含量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000002
实施例2：添加NH4Cl提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L、8g/L、12g/L的NH4Cl，同时以不添加NH4Cl的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行 发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表3。
试验结果表明NH4Cl的添加量在0.5g/L～12g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以NH4Cl添加量为4g/L时麦角硫因的含量最高，达到155.4mg/L，比对照组提高了24.4％。
表3.NH4Cl的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000003
实施例3：添加NH4NO3提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.5g/L、1g/L、2.5g/L、5g/L、7.5g/L、10g/L的NH4NO3，同时以不添加NH4NO3的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表4。
试验结果表明NH4NO3的添加量在0.5g/L～10g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以NH4NO3添加量为5g/L时麦角硫因的含量最高，达到148mg/L，比对照组提高了18.5％。
表4.NH4NO3的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000004
实施例4：添加NaCl提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.5g/L、2g/L、5g/L、10g/L、20g/L的NaCl，同时以不添加NaCl的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培 养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表5。
试验结果表明NaCl的添加量在0.5g/L～20g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以NaCl添加量为5g/L时麦角硫因的含量最高，达到123.9mg/L，比对照组提高了6.63％。
表5.NaCl的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000005
实施例5：添加聚乙二醇PEG 6000提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.2g/L、0.5g/L、1g/L、3g/L、5g/L的PEG 6000，同时以不添加PEG 6000的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表6。
试验结果表明PEG 6000的添加量在0.2g/L～5g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以PEG 6000添加量为1g/L时麦角硫因的含量最高，达到124.4mg/L，比对照组提高了7.06％。
表6.PEG 6000的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000006
实施例6：添加叶酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.08g/L、0.16g/L、0.32g/L、0.64g/L、1.28g/L、2.56g/L的叶酸，同时以不添加叶酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232 菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表7。
试验结果表明叶酸的添加量在0.08g/L～2.56g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以叶酸添加量为0.64g/L时麦角硫因的含量最高，达到148.6mg/L，比对照组提高了25％。
表7.叶酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000007
实施例7：添加VB1提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.01g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L的VB1，同时以不添加VB1的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表8。
试验结果表明VB1的添加量在0.01g/L～0.8g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以VB1添加量为0.1g/L时麦角硫因的含量最高，达到132.2mg/L，比对照组提高了11.2％。
表8.VB1的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000008
实施例8：添加吲哚丁酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L的吲哚丁酸，同时以不添加吲哚丁 酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表9。
发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以吲哚丁酸添加量为1mg/L时麦角硫因的含量最高，达到140.6mg/L，比对照组提高了9.33％。
表9.吲哚丁酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000009
实施例9：添加柠檬酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.01g/L、0.05g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L的柠檬酸，同时以不添加柠檬酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表10。
试验结果表明柠檬酸的添加量在0.01g/L～0.8g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以柠檬酸添加量为0.4g/L时麦角硫因的含量最高，达到138.3mg/L，比对照组提高了10.4％。
表10.柠檬酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000010
实施例10：添加丙酮酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.05g/L、0.1g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.2g/L、4.5g/L的丙酮酸，同时以不添加丙 酮酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表11。
试验结果表明丙酮酸的添加量在0.05g/L～4.5g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以丙酮酸添加量为2.2g/L时麦角硫因的含量最高，达到132.7mg/L，比对照组提高了5.9％。
表11.丙酮酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000011
实施例11：添加精氨酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.1g/L、0.25g/L、0.75g/L、2g/L、5g/L、7g/L的精氨酸，同时以不添加精氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表12。
试验结果表明精氨酸的添加量在0.1g/L～7g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以精氨酸添加量为2g/L时麦角硫因的含量最高，达到134.2mg/L，比对照组提高了12.7％。
表12.精氨酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000012
实施例12：添加赖氨酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制 备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.1g/L、0.25g/L、0.75g/L、2g/L、5g/L、8g/L的赖氨酸，同时以不添加赖氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表13。
试验结果表明赖氨酸的添加量在0.1g/L～8g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以赖氨酸添加量为5g/L时麦角硫因的含量最高，达到135.1mg/L，比对照组提高了13.4％。
表13.赖氨酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000013
实施例13：添加亮氨酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.02g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.25g/L、0.5g/L的亮氨酸，同时以不添加亮氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表14。
试验结果表明亮氨酸的添加量在0.02g/L～0.5g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以亮氨酸添加量为0.1g/L时麦角硫因的含量最高，达到133.3mg/L，比对照组提高了11.9％。
表14.亮氨酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000014
实施例14：添加天冬氨酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.05g/L、0.5g/L、1g/L、5g/L、7g/L、9g/L的天冬氨酸，同时以不添加天冬氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表15。
试验结果表明天冬氨酸的添加量在0.05g/L～9g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以天冬氨酸添加量为5g/L时麦角硫因的含量最高，达到135.9mg/L，比对照组提高了14.1％。
表15.天冬氨酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000015
实施例15：添加谷氨酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的谷氨酸，同时以不添加谷氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表16。
试验结果表明谷氨酸的添加量在1μmol/L～100μmol/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以谷氨酸添加量为10μmol/L时麦角硫因的含量最高，达到131.2mg/L，比对照组提高了9.1％。
表16.谷氨酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000016
实施例16：添加甜菜碱提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L的甜菜碱，同时以不添加甜菜碱的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表17。
试验结果表明甜菜碱的添加量在50mmol/L～250mmol/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以甜菜碱添加量为150mmol/L时麦角硫因的含量最高，达到146.6mg/L，比对照组提高了22％。
表17.甜菜碱的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000017
实施例17：添加组氨酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L的组氨酸，同时以不添加组氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的 含量，结果见表18。
试验结果表明组氨酸的添加量在0.1mmol/L～3mmol/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以组氨酸添加量为1mmol/L时麦角硫因的含量最高，达到129.5mg/L，比对照组提高了7.7％。
表18.组氨酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000018
实施例18：添加半胱氨酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加2mmol/L、9mmol/L、15mmol/L、25mmol/L、35mmol/L、45mmol/L的半胱氨酸，同时以不添加半胱氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表19。
试验结果表明半胱氨酸的添加量在2mmol/L～45mmol/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以半胱氨酸添加量为15mmol/L时麦角硫因的含量最高，达到175.5mg/L，比对照组提高了46％。
表19.半胱氨酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000019
实施例19：半胱氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累的影响
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制 备发酵液，不同之处在于分别在发酵前向发酵基础培养基和发酵第2天、4天、6天、8天、10天向发酵液中额外添加15mmol/L的半胱氨酸，同时以不添加半胱氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表20。
试验结果表明在发酵前至发酵第10天添加半胱氨酸均可促进麦角硫因的积累，发酵第6天添加半胱氨酸，发酵液中麦角硫因的含量最高，达193.8mg/L，比对照组提高了56％。
表20.半胱氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000020
实施例20：添加蛋氨酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加3mmol/L、9mmol/L、15mmol/L、25mmol/L、35mmol/L、45mmol/L的蛋氨酸，同时以不添加蛋氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表21。
试验结果表明蛋氨酸的添加量在3mmol/L～45mmol/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以蛋氨酸添加量为15mmol/L时麦角硫因的含量最高，达到179.6mg/L，比对照组提高了49.4％。
表21.蛋氨酸的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000021
实施例21：蛋氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累的影响
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别在发酵前向发酵基础培养基和发酵第2天、4天、6天、8天、10天向发酵液中额外添加15mmol/L的蛋氨酸，同时以不添加蛋氨酸的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表22。
试验结果表明在发酵前至发酵第10天添加蛋氨酸均可提高麦角硫因的积累量，发酵第4天添加蛋氨酸，发酵液中麦角硫因的含量最高，达202.6mg/L，比对照组提高了63.1％。
表22.蛋氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000022
实施例22：添加氨基酸组合物提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别在发酵前向发酵基础培养基和发酵第2天、4天、6天、8天向发酵液中额外添加“15mmol/L蛋氨酸+1mmol/L组氨酸”的组合物，同时以不添加氨基酸组合物的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表23。
试验结果表明在发酵前和发酵过程中添加蛋氨酸与组氨酸的组合 物均可提高麦角硫因的积累量，在发酵前添加氨基酸组合物，发酵液中麦角硫因的含量最高，达179.8mg/L，比对照组提高了51.9％。
表23.蛋氨酸与组氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000023
实施例23：添加氨基酸组合物提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别在发酵前向发酵基础培养基和发酵第2天、4天、6天、8天向发酵液中额外添加“15mmol/L半胱氨酸+1mmol/L组氨酸”的组合物，同时以不添加氨基酸组合物的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表24。
试验结果表明在发酵前和发酵过程中添加半胱氨酸与组氨酸的组合物均可提高麦角硫因的积累量，在发酵前添加氨基酸组合物，发酵液中麦角硫因的含量最高，达168.2mg/L，比对照组提高了42.1％。
表24.半胱氨酸与组氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000024
实施例24：添加氨基酸组合物提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例l的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别在发酵前向发酵基础培养基和发酵第2天、4天、6天、8天向发酵液中额外添加“15mmol/L蛋氨酸+15mmol/L半胱氨酸”与“7.5mmol/L蛋氨酸+7.5mmol/L半胱氨酸”的组合物，同时以不添加氨基酸组合物的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中 麦角硫因的含量，结果见表25和表26。
试验结果表明在发酵前和发酵过程中添加蛋氨酸与半胱氨酸的组合物均可提高麦角硫因的积累量，在发酵前添加7.5mmol/L蛋氨酸与7.5mmol/L半胱氨酸，发酵液中麦角硫因的含量最高，达208.3mg/L，比对照组提高了75.9％。
表25.蛋氨酸与半胱氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000025
表26.蛋氨酸与半胱氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000026
实施例25：添加氨基酸组合物提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别在发酵前向发酵基础培养基和发酵第2天、4天、6天、8天向发酵液中额外添加“15mmol/L蛋氨酸+15mmol/L半胱氨酸+1mmol/L组氨酸”和“7.5mmol/L蛋氨酸+7.5mmol/L半胱氨酸+1mmol/L组氨酸”的组合物，同时以不添加氨基酸组合物的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表27和表28。
试验结果表明在发酵前和发酵过程中添加蛋氨酸、半胱氨酸与组氨酸的组合物均可提高麦角硫因的积累量，在发酵前添加7.5mmol/L蛋氨酸、7.5mmol/L半胱氨酸和1mmol/L组氨酸，发酵液中麦角硫因的含量最高，达206.8mg/L，比对照组提高了74.6％。
表27.蛋氨酸、半胱氨酸与组氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000027
表28.蛋氨酸、半胱氨酸与组氨酸的添加时间对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000028
实施例26：添加吐温60提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加2g/L、5g/L、10g/L、20g/L、40g/L、50g/L的吐温60，同时以不添加吐温60的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表29。
试验结果表明吐温60的添加量在2g/L～50g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以吐温60添加量为10g/L时麦角硫因的含量最高，达到212.7mg/L，比对照组提高了74.9％。
表29.吐温60的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000029
另外，还测定了胞外滤液中麦角硫因的含量，发现添加上述浓度的吐温60均可提高胞外麦角硫因的含量，其中添加5g/L时，胞外滤液中麦角硫因的含量最高，达到16.24mg/L，比对照组8.73mg/L提高了86％。
实施例27：添加吐温80提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.5g/L、2g/L、5g/L、10g/L、20g/L、40g/L的吐温80，同时以不添加吐温80的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表30。
试验结果表明吐温80的添加量在0.5g/L～40g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以吐温80添加量为10g/L时麦角硫因的含量最高，达到217mg/L，比对照组提高了78.5％。
表30.吐温80的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000030
另外，还测定了胞外滤液中麦角硫因的含量，发现添加上述浓度 的吐温80均可提高胞外麦角硫因的含量，其中添加10g/L时，胞外滤液中麦角硫因的含量最高，达到18.72mg/L，比对照组8.73mg/L提高了114.4％。
实施例28：添加司盘80提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.2g/L、0.5g/L、1g/L、3g/L、5g/L、10g/L的司盘80，同时以不添加司盘80的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表31。
试验结果表明司盘80的添加量在0.2g/L～10g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以司盘80添加量为3g/L时麦角硫因的含量最高，达到196.5mg/L，比对照组提高了69.7％。
表31.司盘80的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000031
实施例29：添加壳聚糖提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35g/L、0.4g/L的壳聚糖，同时以不添加壳聚糖的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表32。
试验结果表明壳聚糖的添加量在0.2g/L～0.4g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以壳聚糖添加量为0.3g/L时麦角硫因的含量最高，达到128.8mg/L，比对照组提高了11.2％。
表32.壳聚糖的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000032
实施例30：添加氟康唑提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加2mg/L、5mg/L、20mg/L、50mg/L、80mg/L的氟康唑，同时以不添加氟康唑的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表33。
试验结果表明氟康唑的添加量在2mg/L～80mg/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以氟康唑添加量为50mg/L时麦角硫因的含量最高，达到146.4mg/L，比对照组提高了19.6％。
表33.氟康唑的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000033
另外，还测定了胞外滤液中麦角硫因的含量，发现添加上述浓度的氟康唑均可提高胞外麦角硫因的含量，其中添加50mg/L时，胞外滤液中麦角硫因的含量最高，达到7.67mg/L，比对照组2.85mg/L提高了169.1％。
实施例31：添加咪康唑提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L和50mg/L的咪康唑，同时以不添 加咪康唑的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表34。
试验结果表明咪康唑的添加量在0.5mg/L～15mg/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以咪康唑添加量为5mg/L时麦角硫因的含量最高，达到152.9mg/L，比对照组提高了24.9％。
表34.咪康唑的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000034
另外，还测定了胞外滤液中麦角硫因的含量，发现添加上述浓度的咪康唑均可提高胞外麦角硫因的含量，其中添加50mg/L时，胞外滤液中麦角硫因的含量最高，达到9.14mg/L，比对照组2.85mg/L提高了220.4％。
实施例32：添加酮康唑提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、50mg/L的酮康唑，同时以不添加酮康唑的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表35。
试验结果表明酮康唑的添加量在0.5mg/L～50mg/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以酮康唑添加量为5mg/L时麦角硫因的含量最高，达到134.1mg/L，比对照组提高了9.6％。
表35.酮康唑的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000035
另外，还测定了胞外滤液中麦角硫因的含量，发现添加上述浓度的酮康唑均可提高胞外麦角硫因的含量，其中添加50mg/L时，胞外滤液中麦角硫因的含量最高，达到5.77mg/L，比对照组2.85mg/L提高了102.5％。
实施例33：添加组合物提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加“4g/L NH4Cl+0.64g/L叶酸”、“4g/L NH4Cl+0.64g/L叶酸+0.1g/L VB1”、“7.5mmol/L蛋氨酸+7.5mmol/L半胱氨酸”三种不同的组合物，同时以不添加组合物的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表36。
试验结果表明三种组合物的添加促进了麦角硫因的积累，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以添加“7.5mmol/L蛋氨酸+7.5mmol/L半胱氨酸”的组合物时发酵液中麦角硫因的含量最高，达到210.7mg/L，比对照组提高了80.2％。
表36.组合物的添加对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000036
实施例34：增加培养基中酪蛋白胨的含量提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于增大发酵基础培养基中酪蛋白胨的含量分别达到40g/L、50g/L、60g/L、70g/L和80g/L，同时以酪蛋白胨含量为35g/L的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表37。
试验结果表明培养基中酪蛋白胨的含量在40g/L～80g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以酪蛋白胨的含量为50g/L时麦角硫因的含量最高，达到157.5mg/L，比对照组提高了33.6％。
表37.培养基中酪蛋白胨的含量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000037
实施例35：增加培养基中甘油的含量提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于将发酵基础培养基中酪蛋白胨的含量调整为50g/L，同时增大发酵基础培养基中甘油的含量分别达到65g/L、75g/L、85g/L和95g/L，以酪蛋白胨含量为50g/L和甘油含量为50g/L的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表38。
试验结果表明培养基中甘油的含量在65g/L～95g/L范围内时，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以甘油的含量为75g/L时麦角硫因的含量最高，达到170.2mg/L，比对照组提高了8.5％。
表38.培养基中甘油的含量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000038
实施例36：添加蛋氨酸和半胱氨酸的组合物提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于将发酵基础培养基中甘油的含量调整为75g/L，酪蛋白胨的含量调整为50g/L，再分别向该发酵基础培养基额外添加不同浓度的蛋氨酸与半胱氨酸的组合物，同时以不添加组合物且甘油含量调整为75g/L，酪蛋白胨含量调整为50g/L的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表39。
试验结果表明添加不同浓度的蛋氨酸与半胱氨酸的组合物促进了麦角硫因的积累，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组，其中以添加“14mmol/L蛋氨酸+7.5mmol/L半胱氨酸”的组合物时发酵液中麦角硫因的含量最高，达到315.7mg/L，比对照组提高了82.1％。
表39.蛋氨酸与半胱氨酸组合物的添加量对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000039
实施例37：发酵过程中温度调控提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别在发酵过程中适当调节发酵温度，同时以发酵过程中初始温度25℃恒温控制的实验组作为对照组，对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中 麦角硫因的含量，结果见表40。在表40中，例如，调控时间(天)为“0-4-12-15”且调控温度(℃)为“25-28-31所在列的数据表示的是，第0-3天的温度是25℃，第4-11天的温度是28℃，第12-15天的温度是31℃的结果。以此类推。
试验结果表明在发酵过程中适当调节发酵温度利于促进麦角硫因的积累，发酵液中麦角硫因的含量均高于对照组。
表40.发酵过程中过温度的调控对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000040
实施例38：发酵过程中pH调控提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于在发酵第4天调节发酵液的pH至4.8、5.0、5.5、6.0、6.3，并控制上述pH至发酵结束，同时以发酵过程中不控制pH的实验组作为对照组(其中，自然初始pH为5.4，发酵过程中缓慢上升，发酵结束pH为6.8左右)，对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见表41。
试验结果表明在发酵第4天调节发酵液的pH至4.8-6.3利于促进发酵液中麦角硫因的积累，其中在发酵第4天调节pH至6.0，发酵液中麦角硫因的含量最高，达到136.9mg/L，比对照组提高了17.7％。
表41.发酵第4天pH调控对麦角硫因发酵积累量的影响
Figure PCTCN2015000372-appb-000041
实施例39：容积75L自动控制发酵罐发酵麦角硫因的发酵积累
摇瓶种子培养基：玉米粉30g/L、豆饼粉15g/L、α-淀粉酶80U/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L，其余为水，1L三角瓶中的装液量为300mL，121℃灭菌20min。
容积75L发酵罐的培养基：甘油50g/L、酪蛋白胨35g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁1.5g/L，其余为水，罐内装液量45.6L，121℃灭菌20min。
挑取PDA斜面菌种CGMCC No.6232的菌苔接入种子培养基，25℃、150rpm摇床培养4.5天，得到种子液。将种子液按体积比6.6％的接种量接入发酵罐，罐压0.05MPa，培养温度25℃，初始通风量10L/min，初始搅拌转数100rpm，溶氧与通风量及搅拌转速同时偶联，控制发酵过程中溶氧30％。发酵14天，测定胞外滤液中麦角硫因的含量为24.3mg/L，发酵液中麦角硫因的含量为144.7mg/L。
实施例40：容积75L自动控制发酵罐添加氨基酸提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例39的方法进行75L罐麦角硫因发酵，不同之处在于发酵罐培养基中甘油的含量为75g/L，酪蛋白胨的含量为50g/L，另添加14mmol/L的蛋氨酸和7.5mmol/L的半胱氨酸。发酵过程的第0～7天，控制溶氧30％，发酵过程的第8～14天，控制溶氧15％。发酵14天结束，测定胞外滤液中麦角硫因的含量为56.2mg/L，发酵液中麦角硫因的含量为258.2g/L。
实施例41：增加发酵罐的罐压和溶氧提高麦角硫因发酵的积累量
按照实施例40的方法进行容积75L发酵罐的麦角硫因发酵，不同之处在于罐压为0.1MPa，发酵过程中溶氧控制在30％。发酵12.5天结束，测定胞外滤液中麦角硫因的含量为61.7mg/L，发酵液中麦角硫因的含量为352.8mg/L。
实施例42：添加EDTA提高胞外滤液中麦角硫因的含量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制 备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.05g/L、0.1g/L、0.3g/L和0.5g/L的乙二胺四乙酸(EDTA)，同时以不添加EDTA的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定胞外滤液中麦角硫因的含量，发现添加EDTA可提高胞外麦角硫因的含量，其中添加0.5g/L时，胞外滤液中麦角硫因的含量最高，达到9.28mg/L，比对照组4.85mg/L提高了91.3％。
实施例43：添加异丙醇提高胞外滤液中麦角硫因的含量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.5％和2％(V/V)的异丙醇，同时以不添加异丙醇的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定胞外滤液中麦角硫因的含量，发现添加异丙醇可提高胞外麦角硫因的含量，其中添加2％时，胞外滤液中麦角硫因的含量最高，达到10.04mg/L，比对照组3.61mg/L提高了178.1％。
实施例44：添加二甲基亚砜提高胞外滤液中麦角硫因的含量
按照实施例1的方法，以15g/L豆饼粉作为种子培养基的氮源制备发酵液，不同之处在于分别向发酵基础培养基中额外添加0.5％和2％(V/V)的二甲基亚砜，同时以不添加二甲基亚砜的发酵基础培养基作为对照组。对糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体进行发酵培养，发酵结束，测定胞外滤液中麦角硫因的含量，发现添加异丙醇可提高胞外麦角硫因的含量，其中添加2％时，胞外滤液中麦角硫因的含量最高，达到10.18mg/L，比对照组3.61mg/L提高了182％。
以上实施例说明，使用豆饼粉作为糙皮侧耳CGMCC No.6232发酵合成麦角硫因的种子培养基的氮源，适当提高发酵培养基中碳源和氮源的含量，向发酵基础培养基中添加上述的任意一种或多种化合物，在发酵过程中适当调控发酵温度，在发酵过程中适当调节发酵液pH，并且/或者在发酵过程中适当调节压力和溶氧，可显著提高麦角硫因的 发酵水平。特别地，在发酵基础培养基中添加吐温、氟康唑、咪康唑、酮康唑、乙二胺四乙酸(EDTA)、异丙醇和二甲基亚砜中的任意一种或多种化合物还可以提高胞外发酵液中麦角硫因的含量。以上实施例仅示例说明了部分化合物组合添加的实例，但本领域技术人员能够理解，上述其它化合物的不同组合也能显著提高麦角硫因的发酵水平，甚至具有协同效应。
工业应用性
本发明提供一种制备麦角硫因的方法，可以显著提高麦角硫因的发酵水平，获得较高的麦角硫因产率，适于工业应用。
尽管本文对本发明作了详细说明，但本发明不限于此，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。

Claims (15)

  1. 一种制备麦角硫因的方法，所述方法包括如下步骤：
    (a)将糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)CGMCC No.6232的菌种接种至种子培养基，培养制备种子液，其中所述种子培养基使用豆饼粉作为氮源；和
    (b)将种子液接种至发酵基础培养基，然后培养得到糙皮侧耳菌丝体发酵液。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中的培养操作在19～31℃进行至少3天，步骤(b)中的培养操作在19～31℃进行至少6天，且步骤(b)中的接种量为4～20(V/V)％。
  3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述种子培养基包括玉米粉15～50g/L、豆饼粉5～35g/L、α-淀粉酶20～80U/L、磷酸二氢钾1～6g/L、硫酸镁0.2～5g/L，其余为水。
  4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述豆饼粉的含量为15～35g/L。
  5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵基础培养基包括甘油10～95g/L、酪蛋白胨10～80g/L、磷酸二氢钾2～4g/L、硫酸镁0.5～2g/L，其余为水。
  6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述发酵基础培养基包括甘油65～95g/L。
  7. 根据权利要求5所述的方法，其中所述发酵基础培养基包括酪蛋白胨40～80g/L。
  8. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在所述发酵基础培养基中添加以下的任一种或多种物质：NH4Cl、NH4NO3、NaCl、聚 乙二醇、叶酸、维生素B1(VB1)、吲哚丁酸、柠檬酸、丙酮酸、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、吐温、司盘、壳聚糖、氟康唑、咪康唑、酮康唑、乙二胺四乙酸(EDTA)、异丙醇和二甲基亚砜。
  9. 根据权利要求8所述的方法，其中在所述发酵基础培养基中添加以下的任一种或多种物质：吐温、氟康唑、咪康唑、酮康唑、乙二胺四乙酸(EDTA)、异丙醇和二甲基亚砜。
  10. 根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在所述发酵基础培养基中添加以下量的任一种或多种物质：NH4Cl 0.5g/L～12g/L、NH4NO3 0.5g/L～10g/L、NaCl 0.5g/L～20g/L、聚乙二醇0.2g/L～5g/L、叶酸0.08g/L～2.56g/L、VB1 0.01g/L～0.8g/L、吲哚丁酸0.1mg/L～4mg/L、柠檬酸0.01g/L～0.8g/L、丙酮酸0.05g/L～4.5g/L、精氨酸0.1g/L～7g/L、赖氨酸0.1g/L～8g/L、亮氨酸0.02g/L～0.5g/L、天冬氨酸0.05g/L～9g/L、谷氨酸1μmol/L～100μmol/L、甜菜碱50mmol/L～250mmol/L、组氨酸0.1mmol/L～3mmol/L、半胱氨酸2mmol/L～45mmol/L、蛋氨酸3mmol/L～45mmol/L、吐温0.5g/L～50g/L、司盘0.2g/L～10g/L、壳聚糖0.2g/L～0.4g/L、氟康唑2mg/L～80mg/L、咪康唑0.5mg/L～50mg/L、酮康唑0.5mg/L～50mg/L、乙二胺四乙酸(EDTA)0.05g/L～0.5g/L、异丙醇0.5％～2％(V/V)和二甲基亚砜0.5％～2％(V/V)。
  11. 根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在步骤(b)的发酵过程中调控发酵温度至25～31℃。
  12. 根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其在步骤(b)的发酵过程中调节发酵液pH至4.8～6.3。
  13. 根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中在步骤(b)的发酵过程中调节压力为0.05～0.1MPa，调节溶氧为15～30％。
  14. 一种制备麦角硫因的方法，所述方法包括如下步骤：
    (a)将糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)CGMCC No.6232的菌种接种至种子培养基，在25～28℃培养3～5天制备种子液，其中所述种子培养基包括25～40g/L玉米粉、15～35g/L豆饼粉、30～80U/Lα-淀粉酶、2～4.5g/L磷酸二氢钾、0.2～3g/L硫酸镁，其余为水；和
    (b)将种子液以4～20(V/V)％的接种量接种至发酵基础培养基，在25～31℃培养至少6天，得到糙皮侧耳菌丝体发酵液，所述发酵基础培养基包括65～95g/L甘油、40～80g/L酪蛋白胨、2～4g/L磷酸二氢钾、0.5～2g/L硫酸镁、7.5～15mmol/L蛋氨酸、7.5～15mmol/L半胱氨酸，其余为水。
  15. 一种制备麦角硫因的方法，所述方法包括如下步骤：
    (a)将糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)CGMCC No.6232的菌种接种至种子培养基，在25℃培养4天制备种子液，其中所述种子培养基包括30g/L玉米粉、15g/L豆饼粉、80U/Lα-淀粉酶、3g/L磷酸二氢钾、1.5g/L硫酸镁，其余为水；和
    (b)将种子液以5(V/V)％的接种量接种至发酵基础培养基，在25℃培养3天然后将pH调节至6.0并在31℃培养12天，得到糙皮侧耳菌丝体发酵液，所述发酵基础培养基包括75g/L甘油、50g/L酪蛋白胨、3g/L磷酸二氢钾、1.5g/L硫酸镁、14mmol/L蛋氨酸、7.5mmol/L半胱氨酸，其余为水。
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