CN112195215B - 一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法 - Google Patents

一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，步骤如下：将榆黄菇和松蕈分别接种于固体培养基上，23‑27℃条件下培养3‑6天；取榆黄菇菌丝体接种于种子培养基中培养2‑3天；取松蕈菌丝体接种到培养获得的榆黄菇种子液中并补加一定量的种子培养基，继续培养2‑3天；将培养获得的含有榆黄菇和松蕈的种子液以5‑20%发酵培养基体积的接种量接种到发酵培养基中并添加前体物质，发酵2‑4天后补加少量前体物质，继续发酵3‑4天；对发酵后的发酵液进行处理，得到含有麦角硫因的溶液。本申请选用榆黄菇和松蕈作为麦角硫因的生产菌种，两种菌在种子培养基和发酵培养基中均能发挥协同作用，麦角硫因的产率大幅度提高。

Description

一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法
技术领域
本申请涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法。
背景技术
麦角硫因 (L-Ergothioneine，EGT)，化学名为2-巯基组氨酸三甲基内盐，是一种稀有的天然手性氨基酸。麦角硫因在抗氧化、清除自由基、螯合金属离子、防紫外辐射损伤、抑制癌症等方面具有独特的生理功能，并且在某些方面具有比谷胱甘肽等天然抗氧化剂更优越的生理功能，目前广泛应用于食品添加剂、保健品、化妆品等领域。麦角硫因存在于很多动植物体内，但人体自身不能合成，只能从食物中摄取。许多微生物如真菌和放线菌都能够合成麦角硫因，在真菌中尤以食用菌中麦角硫因含量最高。
榆黄菇（Pleurotus citrinopileatus），也称为榆黄蘑、金顶侧耳，是一种常见的食用菌。榆黄菇子实体多，丛生或簇生，呈金黄色。菌盖喇叭状，光滑，宽2~10厘米，肉质，边缘内卷，菌肉白色。菌褶白色，延生，稍密，不等长。菌柄白色至淡黄色，偏生，长2~12厘米，粗0.5~1.5厘米，有细毛；多数子实体合生在一起。榆黄菇烹饪后有浓郁的香味、味道鲜美；而且榆黄菇中富含多种人体所必需的氨基酸、维生素、多种微量元素以及丰富的多糖类物质。此外，榆黄菇中所特有的麦角硫因成分也提高了榆黄菇的应用价值。
松蕈（Tricholoma matsutake），也称松菌、松蘑、松茸、鸡丝菌、大花菌、大脚菇、青岗菌，为白蘑科植物松蕈的子实体。菌盖扁半球形或稍平展，直径5-20cm，污白色，表面有栗褐色或黄褐色纤毛状鳞片，边缘内卷。菌肉厚，致密，白色或淡褐色。菌摆密，弯生，不等长，白色或浅乳黄色。菌柄长6-13.5cm，直径1.5-3cm，基部膨大，菌环以上污白色，被白粉，菌环以下土黄色，有栗褐色纤毛状鳞片，中实。菌环生于菌柄上部，白色或栗褐色，膜质或蛛丝状。松蕈鲜嫩爽滑、味道鲜美、香气逼人，同时富含多糖、多肽、氨基酸、菌蛋白、膳食纤维、不饱和脂肪酸、矿物质和微量元素等营养物质。最重要的是，松蕈中也含有大量的麦角硫因。
目前麦角硫因的生产方法多采用单一食用菌液体发酵方式，再将发酵后的产物进行后处理，最终获得麦角硫因。但采用现有的生产方法获得的麦角硫因产量普遍不高，不能满足日益增长的市场需求。
发明内容
针对现有生产方法不能获得高产量麦角硫因的问题，本申请的目的是提供一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，采用本申请菌丝体联合发酵方法能够显著提高麦角硫因的产量。
本申请的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，包括以下步骤：
a.将榆黄菇和松蕈的组织块分别接种于固体培养基上，23-27℃条件下培养3-6天；
b.取榆黄菇菌丝体接种于种子培养基中培养2-3天；
c.取松蕈菌丝体接种到步骤b培养获得的榆黄菇种子液中并补加一定量的新鲜种子培养基，继续培养2-3天；
d.将步骤c培养获得的含有榆黄菇和松蕈的种子液以5-20%发酵培养基体积的接种量接种到发酵培养基中并添加前体物质，发酵2-4天后再补加少量前体物质，继续发酵3-4天；
e.对发酵后的发酵液进行处理，得到含有麦角硫因的发酵液。
通过采用上述技术方案，本申请选取榆黄菇和松蕈作为麦角硫因的生产菌种，这是因为榆黄菇和松蕈在种子培养以及发酵麦角硫因的过程中均能发挥协同作用，二者通过菌丝体联合发酵能够显著提高麦角硫因的产量。本申请首先在固体培养基上对榆黄菇和松蕈菌分别进行菌丝体培养，然后将榆黄菇菌丝体先在种子培养基中培养一段时间，再向种子培养基中接入松蕈菌丝体，获得含有榆黄菇和松蕈的种子液，此操作步骤的目的是使榆黄菇和松蕈在种子培养基中进行共同生长，且二者在菌体生长过程中产生的次级代谢产物能够互相促进菌体生长，最终达到协同生长的状态，为后期的联合发酵打下基础。本申请再将获得的榆黄菇和松蕈的种子液接种到发酵培养基中进行菌丝体联合发酵生产麦角硫因，在菌丝体联合发酵过程中，榆黄菇和松蕈能够进一步发挥协同作用，从而大幅度提高麦角硫因的产量。另外，本申请在发酵培养基中加入麦角硫因的前体物质，榆黄菇和松蕈菌能够快速利用前体物质合成麦角硫因。并且，在发酵中期还对前体物质进行补加，从而进一步提高了麦角硫因的产量。发酵结束后，本申请通过简单的提取步骤，使细胞中的麦角硫因最大限度的溶出，最终获得高含量麦角硫因发酵液。
进一步的，步骤b、c中，种子培养基包括以下组分和含量：15-25g/L马铃薯、5-10g/L玉米粉、6-12g/L豆饼粉、0.5-0.8g/L MgSO4·7H2O、1-2g/L KH2PO4和0.001-0.003g/L维生素B1，调节pH至5-6.5（灭菌前）。
通过采用上述技术方案，本申请的种子培养基营养丰富，能够同时满足榆黄菇和松蕈菌体的生长，为后期菌丝体联合发酵提供了大量的活性菌体。同时，本申请种子培养基的成分容易获得，价格低廉，极大的降低了麦角硫因的生产成本。
进一步的，步骤b、c中，种子培养的培养条件为：23-27℃条件下，160-180r/min恒温震荡；步骤b中种子培养基的装液量为摇瓶容积的20%-25%。
通过采用上述技术方案，本申请的种子液培养条件能够同时满足榆黄菇和松蕈菌体的生长要求。另外，本申请精确控制种子液的装液量和摇床的搅拌转速，从而保证菌体在生长阶段对氧气的需求，使菌体更好的生长。
进一步的，步骤b中，将1-4cm2的榆黄菇菌丝体接种于种子培养基；步骤c中，将9-16cm2的松蕈菌丝体接种到榆黄菇种子液中。
通过采用上述技术方案，本申请严格限定榆黄菇和松蕈的接种量，可以在最短的时间内快速积累菌体量，为菌丝体联合发酵提供最有利的发酵条件。
进一步的，步骤c中，新鲜种子培养基的补加量为原种子培养基体积的1/4-1/3。
通过采用上述技术方案，本申请将松蕈菌丝体接种到榆黄菇种子液中后并补加一定量的新鲜种子培养基，一方面是为松蕈菌体的生长提供最适宜的条件，另一方面也进一步的控制三角瓶中的液体量，保证了种子培养过程中氧的通气量。
进一步的，步骤d中，发酵培养基包括以下组分和含量：10-15g/L葡萄糖、12-18g/L胰蛋白胨、3-7g/L尿素、0.2-0.3g/L MgSO4·7H2O、0.8-1.2g/L KH2PO4和0.001-0.003g/L维生素B1，调节pH至5-6.5（灭菌前）。
通过采用上述技术方案，本申请的发酵培养基的成分非常利于榆黄菇和松蕈的利用，榆黄菇和松蕈能够快速利用发酵培养基的成分进行菌丝体联合发酵，进而提高麦角硫因的产率，同时缩短了整个生产工艺的周期。
进一步的，步骤d中，所述前体物质选用组氨酸、组氨酸三甲基内盐、巯基组氨酸三甲基内盐、甜菜碱、半胱氨酸、γ-谷氨酸-半胱氨酸中的一种或多种；发酵培养基中前体物质的加入量为10-25mM，补加前体物质的量为4-9 mM。
通过采用上述技术方案，榆黄菇和松蕈能够充分利用本申请选用的前体物质，并且本申请还进一步限定了前体物质的加入量和加入时间，通过精确的发酵控制，提高麦角硫因产量的同时降低了生产成本。
进一步的，步骤d中，发酵培养的培养条件为：25-28℃条件下，180-220r/min恒温震荡；发酵培养基的装液量为摇瓶容积的15%-20%。
通过采用上述技术方案，本申请对发酵条件进行了优化，并着重通过发酵培养基的装液量对发酵过程中的氧气通入量进行了控制，这是因为榆黄菇和松蕈在发酵过程中对氧气的需求将严重影响最终产物的得率。
进一步的，步骤e中，发酵液的处理方法包括以下步骤：
Ⅰ.将发酵后的发酵液在功率为300-500W、温度为50-70℃的条件下进行微波处理3-5min；
Ⅱ.将微波处理后的发酵液再在400-500W的条件下进行超声处理3-5min；
Ⅲ.将超声处理后的发酵液进行固液分离，得到含有麦角硫因的溶液。
通过采用上述技术方案，本申请首先通过微波和超声联合的方式将发酵液中的细胞进行破碎处理，从而使细胞内的麦角硫因浸入发酵液中，最后采用固液分离的方式获得含有麦角硫因的发酵液。本申请采用微波和超声联合的方式进行细胞破碎，细胞破碎彻底，麦角硫因能够充分从细胞中浸出，而且可以最大限度的保留麦角硫因的活性，同时有效的缩短了发酵液处理的时间。另外，本申请严格限定微波和超声的功率、温度和时间，功率过小、温度过低或时间过短均不能使麦角硫因最大限度的溶出，从而得率降低；而功率过大、温度过高或时间过长均能加速麦角硫因的氧化、对其结构造成一定程度的破坏、加速分解，麦角硫因的产率也会降低。
进一步的，步骤Ⅲ中，采用离心的方式将处理后的发酵液进行固液分离，离心条件为12000-13000rpm/min，离心5-8min。
通过采用上述技术方案，本申请采用离心的方式进行发酵液的固液分离，并将离心转速提高到12000-13000rpm/min，可以有效的去除发酵液中的细胞碎片、蛋白和DNA等大分子，减少发酵液中的杂质，最终获得纯度较高的麦角硫因发酵液。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请选用榆黄菇和松蕈作为麦角硫因的生产菌种，榆黄菇和松蕈在种子培养基和发酵培养基中均能很好的发挥协同作用，麦角硫因的产率大幅度提高；
2、本申请采用微波和超声联合的方式对发酵液进行处理，使麦角硫因最大限度的从细胞中溶出，从而进一步提高麦角硫因的产量；
3、本申请的种子培养基和发酵培养基原料容易获得，价格低廉，降低了麦角硫因的生产成本。
具体实施方式
本申请的组氨酸、组氨酸三甲基内盐、巯基组氨酸三甲基内盐、甜菜碱、半胱氨酸、γ-谷氨酸-半胱氨酸购自北京索莱宝(Solarbio)科技有限公司。
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
实施例1
一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，包括以下步骤：
a.将榆黄菇和松蕈的组织块分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，23℃条件下培养3天；
b.取1cm2的榆黄菇菌丝体接种于含有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，在27℃、180r/min恒温震荡条件下培养2天；
c.取16cm2的松蕈菌丝体接种到步骤b获得的榆黄菇种子液中并补加25mL的新鲜种子培养基，在27℃、180r/min恒温震荡条件下继续培养3天；
种子培养基包括以下组分：15g/L马铃薯、10g/L玉米粉、6g/L豆饼粉、0.8g/LMgSO4·7H2O和1g/L KH2PO4、0.003g/L维生素B1，调节pH 至5；
d.将15mL步骤c培养获得的含有榆黄菇和松蕈的种子液接种到含有75mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，并添加10mM组氨酸，在25℃，220r/min恒温震荡条件下发酵4天后再补加9mM组氨酸，继续发酵3天；
发酵培养基包括以下组分：15g/L葡萄糖、12g/L胰蛋白胨、7g/L尿素、0.2g/LMgSO4·7H2O、1.2g/L KH2PO4、0.001g/L维生素B1，调节pH至6.5；
e.对发酵后的发酵液进行处理，得到含有麦角硫因的溶液；
Ⅰ.将发酵后的发酵液在功率为300W、温度为70℃的条件下进行微波处理3min；
Ⅱ.将微波处理后的发酵液再在500W的条件下进行超声处理3min；
Ⅲ.将超声处理后的发酵液进行离心，离心条件为12000rpm/min，离心8min，留取上清，得到含有麦角硫因的溶液。
实施例2
一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，包括以下步骤：
a.将榆黄菇和松蕈的组织块分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，27℃条件下培养6天；
b.取4cm2的榆黄菇菌丝体接种于含有125mL种子培养基的500mL三角瓶中，在23℃、160r/min恒温震荡条件下培养3天；
c.取9cm2的松蕈菌丝体接种到步骤b获得的榆黄菇种子液中并补加41.7mL的新鲜种子培养基，在23℃、160r/min恒温震荡条件下继续培养2天；
种子培养基包括以下组分：25g/L马铃薯、5g/L玉米粉、12g/L豆饼粉、0.5g/LMgSO4·7H2O和2g/L KH2PO4、0.001g/L维生素B1，调节pH至 6.5；
d.将5mL步骤c培养获得的含有榆黄菇和松蕈的种子液接种到含有100mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，并添加25mM组氨酸三甲基内盐，在28℃，180r/min恒温震荡条件下发酵2天后再补加4mM组氨酸三甲基内盐，继续发酵4天；
发酵培养基包括以下组分：10g/L葡萄糖、18g/L胰蛋白胨、3g/L尿素、0.3g/LMgSO4·7H2O、0.8g/L KH2PO4、0.003g/L维生素B1，调节pH至5；
e.对发酵后的发酵液进行处理，得到含有麦角硫因的溶液；
Ⅰ.将发酵后的发酵液在功率为500W、温度为50℃的条件下进行微波处理5min；
Ⅱ.将微波处理后的发酵液再在400W的条件下进行超声处理5min；
Ⅲ.将超声处理后的发酵液进行离心，离心条件为13000rpm/min，离心5min，留取上清，得到含有麦角硫因的溶液。
实施例3
一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，包括以下步骤：
a.将榆黄菇和松蕈的组织块分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，26℃条件下培养4天；
b.取1.5cm2的榆黄菇菌丝体接种于含有110mL种子培养基的500mL三角瓶中，在24℃、175r/min恒温震荡条件下培养2.2天；
c.取15cm2的松蕈菌丝体接种到步骤b获得的榆黄菇种子液中并补加35.2mL的新鲜种子培养基，在24℃、175r/min恒温震荡条件下继续培养2.8天；
种子培养基包括以下组分：18g/L马铃薯、8g/L玉米粉、7g/L豆饼粉、0.7g/LMgSO4·7H2O和1.2g/L KH2PO4、0.0025g/L维生素B1，调节pH值5.5；
d.将9mL步骤c培养获得的含有榆黄菇和松蕈的种子液接种到含有90mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，并添加20mM巯基组氨酸三甲基内盐，在26℃，190r/min恒温震荡条件下发酵3.5天后再补加5mM巯基组氨酸三甲基内盐，继续发酵3.2天；
发酵培养基包括以下组分：14g/L葡萄糖、13g/L胰蛋白胨、6g/L尿素、0.28g/LMgSO4·7H2O、0.9g/L KH2PO4、0.0015g/L维生素B1，调节pH至6.2；
e.对发酵后的发酵液进行处理，得到含有麦角硫因的溶液；
Ⅰ.将发酵后的发酵液在功率为450W、温度为55℃的条件下进行微波处理3.5min；
Ⅱ.将微波处理后的发酵液再在480W的条件下进行超声处理4.5min；
Ⅲ.将超声处理后的发酵液进行离心，离心条件为12200rpm/min，离心6min，留取上清，得到含有麦角硫因的溶液。
实施例4
一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，包括以下步骤：
a.将榆黄菇和松蕈的组织块分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，24℃条件下培养5天；
b.取3.5cm2的榆黄菇菌丝体接种于含有120mL种子培养基的500mL三角瓶中，在26℃、165r/min恒温震荡条件下培养2.8天；
c.取12cm2的松蕈菌丝体接种到步骤b获得的榆黄菇种子液中并补加33.6mL的新鲜种子培养基，在26℃、165r/min恒温震荡条件下继续培养2.2天；
种子培养基包括以下组分：22g/L马铃薯、6g/L玉米粉、10g/L豆饼粉、0.6g/LMgSO4·7H2O和1.8g/L KH2PO4、0.0015g/L维生素B1，调节pH至6.2；
d.将12mL步骤c培养获得的含有榆黄菇和松蕈的种子液接种到含有80mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，并添加15mM甜菜碱，在27℃，210r/min恒温震荡条件下发酵2.5天后再补加8mM甜菜碱，继续发酵3.8天；
发酵培养基包括以下组分：12g/L葡萄糖、16g/L胰蛋白胨、4g/L尿素、0.22g/LMgSO4·7H2O、1.1g/L KH2PO4、0.0025g/L维生素B1，调节pH至5.5；
e.对发酵后的发酵液进行处理，得到含有麦角硫因的溶液；
Ⅰ.将发酵后的发酵液在功率为350W、温度为65℃的条件下进行微波处理4.5min；
Ⅱ.将微波处理后的发酵液再在420W的条件下进行超声处理3.5min；
Ⅲ.将超声处理后的发酵液进行离心，离心条件为12800rpm/min，离心7min，留取上清，得到含有麦角硫因的溶液。
实施例5
一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，包括以下步骤：
a.将榆黄菇和松蕈的组织块分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，25℃条件下培养4.5天；
b.取3cm2的榆黄菇菌丝体接种于含有115mL种子培养基的500mL三角瓶中，在25℃、170r/min恒温震荡条件下培养2.5天；
c.取14cm2的松蕈菌丝体接种到步骤b获得的榆黄菇种子液中并补加34.5mL的新鲜种子培养基，在25℃、170r/min恒温震荡条件下继续培养2.5天；
种子培养基包括以下组分：20g/L马铃薯、7g/L玉米粉、8g/L豆饼粉、0.65g/LMgSO4·7H2O和1.5g/L KH2PO4、0.002g/L维生素B1，调节pH至6；
d.将10.2mL步骤c培养获得的含有榆黄菇和松蕈的种子液接种到含有85mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，并添加18mM半胱氨酸，在26.5℃，200r/min恒温震荡条件下发酵3天后再补加6mM半胱氨酸，继续发酵3.5天；
发酵培养基包括以下组分：13g/L葡萄糖、15g/L胰蛋白胨、5g/L尿素、0.25g/LMgSO4·7H2O、1g/L KH2PO4、0.002g/L维生素B1，调节pH至6；
e.对发酵后的发酵液进行处理，得到含有麦角硫因的溶液；
Ⅰ.将发酵后的发酵液在功率为400W、温度为60℃的条件下进行微波处理4min；
Ⅱ.将微波处理后的发酵液再在450W的条件下进行超声处理4min；
Ⅲ.将超声处理后的发酵液进行离心，离心条件为12500rpm/min，离心6.5min，留取上清，得到含有麦角硫因的溶液。
实施例6
一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，与实施例1的不同之处在于：步骤d中前体物质为γ-谷氨酸-半胱氨酸。
实施例7
一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，与实施例2的不同之处在于：步骤d中前体物质为组氨酸和甜菜碱的组合物，组氨酸和甜菜碱的物质的量比为1:1。
实施例8
一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，与实施例2的不同之处在于：步骤d中前体物质为组氨酸三甲基内盐和甜菜碱的组合物，组氨酸三甲基内盐和甜菜碱的物质的量比为1:1。
实施例9
一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，与实施例3的不同之处在于：步骤d中前体物质为半胱氨酸和甜菜碱的组合物，半胱氨酸和甜菜碱的物质的量比为1:1。
实施例10
一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，与实施例3的不同之处在于：步骤d中前体物质为γ-谷氨酸-半胱氨酸和甜菜碱的组合物，γ-谷氨酸-半胱氨酸和甜菜碱的物质的量比为1:1。
实施例11
一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，与实施例4的不同之处在于：步骤d中前体物质为组氨酸和半胱氨酸的组合物，组氨酸和半胱氨酸的物质的量比为1:1。
实施例12
一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，与实施例5的不同之处在于：步骤d中前体物质为组氨酸、半胱氨酸和甜菜碱的组合物，组氨酸、半胱氨酸和甜菜碱的物质的量比为1:1:1。
对比例1
一种生产麦角硫因的方法，包括以下步骤：
a.将榆黄菇的组织块接种于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，25℃条件下培养4.5天；
b.取3cm2的榆黄菇菌丝体接种于含有149.5mL种子培养基的500mL三角瓶中，在25℃、170r/min恒温震荡条件下培养5天；
种子培养基包括以下组分：20g/L马铃薯、7g/L玉米粉、8g/L豆饼粉、0.65g/LMgSO4·7H2O和1.5g/L KH2PO4、0.002g/L维生素B1，调节pH至6；
c.将10.2mL步骤b培养获得的榆黄菇种子液接种到含有85mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，并添加18mM半胱氨酸，在26.5℃，200r/min恒温震荡条件下发酵3天后再补加6mM半胱氨酸，继续发酵3.5天；
发酵培养基包括以下组分：13g/L葡萄糖、15g/L胰蛋白胨、5g/L尿素、0.25g/LMgSO4·7H2O、1g/L KH2PO4、0.002g/L维生素B1，调节pH至6；
d.对发酵后的发酵液进行处理，得到含有麦角硫因的溶液；
Ⅰ.将发酵后的发酵液在功率为400W、温度为60℃的条件下进行微波处理4min；
Ⅱ.将微波处理后的发酵液再在450W的条件下进行超声处理4min；
Ⅲ.将超声处理后的发酵液进行离心，离心条件为12500rpm/min，离心6.5min，留取上清，得到含有麦角硫因的溶液。
对比例2
一种生产麦角硫因的方法，包括以下步骤：
a.将松蕈的组织块接种于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，25℃条件下培养4.5天；
b.取14cm2的松蕈菌丝体接种于含有149.5mL种子培养基的500mL三角瓶中，在25℃、170r/min恒温震荡条件下培养5天；
种子培养基包括以下组分：20g/L马铃薯、7g/L玉米粉、8g/L豆饼粉、0.65g/LMgSO4·7H2O和1.5g/L KH2PO4、0.002g/L维生素B1，调节pH至6；
c.将10.2mL步骤b培养获得的松蕈种子液接种到含有85mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，并添加18mM半胱氨酸，在26.5℃，200r/min恒温震荡条件下发酵3天后再补加6mM半胱氨酸，继续发酵3.5天；
发酵培养基包括以下组分：13g/L葡萄糖、15g/L胰蛋白胨、5g/L尿素、0.25g/LMgSO4·7H2O、1g/L KH2PO4、0.002g/L维生素B1，调节pH至6；
d.对发酵后的发酵液进行处理，得到含有麦角硫因的溶液；
Ⅰ.将发酵后的发酵液在功率为400W、温度为60℃的条件下进行微波处理4min；
Ⅱ.将微波处理后的发酵液再在450W的条件下进行超声处理4min；
Ⅲ.将超声处理后的发酵液进行离心，离心条件为12500rpm/min，离心6.5min，留取上清，得到含有麦角硫因的溶液。
性能测试
麦角硫因标准品溶液的准备：精确称取麦角硫因标准品(上海晶抗生物工程有限公司10mg，于25mL容量瓶中以纯水配制成浓度为400mg/L的标准品贮备液。再用纯水将贮备液分别稀释成浓度为40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L、200mg/L的标准品溶液。
麦角硫因的检测：相同色谱条件下，对麦角硫因标准品与待测样品进行HPLC测定，将样品色谱图与麦角硫因标准溶液色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中的麦角硫因峰。以标准品麦角硫因的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线，在标准品与样品进样量相同的情况下，用外标法定量，计算出样品中麦角硫因的含量。HPLC检测条件：Agilent1260高效液相色谱仪，Eclipse XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，粒径5μm)，两根柱子串联使用；流动相为V(甲醇)∶V(纯水)＝2∶98，用硼酸调节流动相的pH至5.5；流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量10μL，紫外检测波长254nm。
实验结果参见表1。
Figure 656445DEST_PATH_IMAGE001
从表1可以看出，本实施例1-12联合发酵后的发酵液中麦角硫因的含量高达883.4±1.19 mg/L，而对比例1是采用榆黄菇单菌发酵生产麦角硫因，发酵液中麦角硫因的产量为222.5±1.35 mg/L，对比例2是采用松蕈单菌发酵生产麦角硫因，发酵液中麦角硫因的产量为301.8±1.40 mg/L。以上实验结果表明，榆黄菇和松蕈在菌体联合发酵过程中起到了协同发酵的作用，由于两种菌的协同作用，麦角硫因的产量明显高于两种菌单独发酵时得到的麦角硫因的产量之和，获得了意想不到的技术效果。
本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.将榆黄菇和松蕈的组织块分别接种于固体培养基上，23-27℃条件下培养3-6天；
b.取榆黄菇菌丝体接种于种子培养基中培养2-3天；
c.取松蕈菌丝体接种到步骤b培养获得的榆黄菇种子液中并补加一定量的新鲜种子培养基，继续培养2-3天；
d.将步骤c培养获得的含有榆黄菇和松蕈的种子液以5-20 %发酵培养基体积的接种量接种到发酵培养基中并添加前体物质，发酵2-4天后再补加少量前体物质，继续发酵3-4天；
e.对发酵后的发酵液进行处理，得到含有麦角硫因的发酵液；
所述榆黄菇为Pleurotus citrinopileatus，所述松蕈为Tricholoma matsutake；
所述前体物质选用组氨酸、组氨酸三甲基内盐、巯基组氨酸三甲基内盐、甜菜碱、半胱氨酸、γ-谷氨酸-半胱氨酸中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，其特征在于：步骤b、c中，种子培养基包括以下组分和含量：15-25g/L马铃薯、5-10g/L玉米粉、6-12g/L豆饼粉、0.5-0.8g/L MgSO4·7H2O、1-2g/L KH2PO4和0.001-0.003g/L维生素B1，调剂pH至5-6.5。
3.根据权利要求1所述的一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，其特征在于：步骤b、c中，种子培养的培养条件为：23-27℃条件下，160-180r/min恒温震荡；步骤b中种子培养基的装液量为摇瓶容积的20%-25%。
4.根据权利要求1所述的一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，其特征在于：步骤b中，将1-4cm2的榆黄菇菌丝体接种于种子培养基；步骤c中，将9-16cm2的松蕈菌丝体接种到榆黄菇种子液中。
5.根据权利要求1所述的一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，其特征在于：步骤c中，新鲜种子培养基的补加量为原种子培养基体积的1/4-1/3。
6.根据权利要求1所述的一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，其特征在于：步骤d中，发酵培养基包括以下组分和含量：10-15g/L葡萄糖、12-18g/L胰蛋白胨、3-7g/L尿素、0.2-0.3g/L MgSO4·7H2O、0.8-1.2g/L KH2PO4和0.001-0.003g/L维生素B1，调节pH至5-6.5。
7.根据权利要求1所述的一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，其特征在于：步骤d中，发酵培养基中前体物质的加入量为10-25mM，补加前体物质的量为4-9mM。
8.根据权利要求1所述的一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，其特征在于：步骤d中，发酵培养的培养条件为：25-28℃条件下，180-220r/min恒温震荡；发酵培养基的装液量为摇瓶容积的15%-20%。
9.根据权利要求1所述的一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，其特征在于：步骤e中，发酵液的处理方法包括以下步骤：
Ⅰ.将发酵后的发酵液在功率为300-500W、温度为50-70℃的条件下进行微波处理3-5min；
Ⅱ.将微波处理后的发酵液再在400-500W的条件下进行超声处理3-5min；
Ⅲ.将超声处理后的发酵液进行固液分离，得到含有麦角硫因的溶液。
10.根据权利要求9所述的一种榆黄菇松蕈菌丝体联合发酵生产麦角硫因的方法，其特征在于：步骤Ⅲ中，采用离心的方式将处理后的发酵液进行固液分离，离心条件为12000-13000rpm/min，离心5-8min。
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