TW202332775A

TW202332775A - 用於生產寡肽之重組酵母

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Publication number: TW202332775A
Application number: TW111105055A
Authority: TW
Inventors: 西蒙娜戴利; 斯特凡諾加利亞尼; 伊瑪科拉塔布謝洛; 馬泰奧格里吉斯; 奧羅羅伯托塔利亞尼
Original assignee: 法國商樂斯福公司
Priority date: 2022-02-11
Filing date: 2022-02-11
Publication date: 2023-08-16

Abstract

本發明係關於一種重組酵母，其中PEP4基因不活化。該酵母可用於生產寡肽。

Description

用於生產寡肽之重組酵母

本發明係關於經基因修飾之酵母，其可用於醱酵生產寡肽，尤其生產γ-麩胺醯基-半胱胺醯基-甘胺酸。

麩胱甘肽(J. De Rey Pallade, Bull. Chem. Soc. France 31, 987-91, 1904)為一種三肽(γ-麩胺醯基-半胱胺醯基-甘胺酸，通常表示為GSH)，通常存在於動物細胞中且作為酶的受質參與許多生化過程，主要具有解毒劑(消除麩胱甘醯基衍生物形式之毒素)、金屬螯合劑及還原劑之作用。在後一種作用中，其一般在減少自由基及抵抗細胞老化過程中具有相當大的重要性。麩胱甘肽易於氧化，形成以存在二硫橋鍵為特徵之二聚體，且通常表示為GSSG或「氧化麩胱甘肽」。氧化及還原兩種形式在活體內共存。鑒於其生理學上的重要性，麩胱甘肽(氧化及還原形式)用作醫藥產品、營養製劑產品及美容產品配方中之活性成分。

麩胱甘肽可藉由化學合成來製備，但通常藉由生物技術來生產係更便宜且產生光學純形式之產物(Li等人, Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 233-42, 2004)。將生質自醱酵液中分離，且可隨後進行溶解以將麩胱甘肽釋放至上清液中；隨後將麩胱甘肽純化且以固體形式分離。最常見的純化方法涉及與銅氧化物或銅鹽反應(US2702799)，且隨後與氫硫酸或其鹽反應(CN106220708)或電化學還原(EP2439312、EP2963156)。或者(EP1391517)，麩胱甘肽可僅藉由層析純化，因此出於安全及環境考慮避免使用銅及H ₂S。

文獻中之各種實例描述在酵母菌屬(Saccharomyces)、畢赤酵母菌屬(Pichia)及念珠菌屬(Candida)之野生型或經基因修飾之酵母中(EP1391517、EP1512747、US2018/0135142)或在其他細菌來源之微生物(諸如經基因修飾之大腸桿菌)中(EP2088153)生產麩胱甘肽。

GSH可積聚於生質中，或排泄至上清液中(M.Rollini等人, Production of glutathione in extracellular form by Saccharomyces cerevisiae, Process Biochemistry 45, 441-445, 2010)。

釀酒酵母菌(S. cerevisiae)中麩胱甘肽之生物合成涉及2個連續反應。第一個反應，由酶麩胺酸-半胱胺酸連接酶催化，以L-麩胺酸及半胱胺酸為起始物質合成γ-L-麩胺醯基-半胱胺酸。第二個反應由酶麩胱甘肽合成酶催化，該酶將甘胺酸與二肽γ-L-麩胺醯基-半胱胺酸結合，由此形成麩胱甘肽或三肽γ-L-麩胺醯基-L-半胱胺醯甘胺酸(γ-Glu-Cys-Gly)。可用分子生物學技術增加重組菌株之生物合成。

在與生物合成方法競爭的同時，亦存在生物降解方法，其防止麩胱甘肽在生質中之積聚；麩胱甘肽藉由相應酶催化之反應代謝且再轉化為三種構成胺基酸。在主要已知降解路徑中，第一種酶γ-麩胺醯基轉肽酶(由基因ECM38編碼)水解γ-L-麩胺醯基，形成二肽半胱胺醯基-甘胺酸且釋放麩胺酸；第二種酶半胱胺醯甘胺酸肽酶水解二肽，釋放半胱胺酸及甘胺酸。因此，麩胱甘肽降解形成二肽半胱胺醯基-甘胺酸(Cys-Gly)。

已在主要路徑缺失之重組釀酒酵母菌菌株中假定第二條GSH降解路徑(Kumar等人, FEMS Microbiology Lett 219, 187-94, 2003)。該第二條路徑隨後經鑑別，且經證明由「dug複合物」催化，該複合物包含由基因DUG1、DUG2及DUG3編碼之三種酶。特定言之，其涉及肽酶(DUG2)及麩醯胺酸醯胺轉移酶(DUG3)以及蛋白酶(DUG1，亦稱為二肽酶)之聯合作用(Bachhawat等人, Genetics 175, 1137-51, 2007)。

對於工業生產而言，重要的是在醱酵結束時限制麩胱甘肽降解，此時生質中之濃度已達到最大水準；處理工業量之生質必然需要數個小時之處理時間，在此期間，產物之降解涉及產量之減少且使純化變得複雜。因此，考慮藉由使由基因ECM38編碼之γ-GT路徑及由基因DUG1、DUG2及DUG3編碼之DUG路徑不活化來防止降解為合理的，如Kumar等人, J Biol Chem 287, 4552-61,2012中所述。

然而，該兩個麩胱甘肽降解路徑之雙重缺失為不夠的，如下所述。

現已發現，存在第三條麩胱甘肽降解路徑。事實上，攜帶上述兩條降解路徑之雙重缺失的重組酵母仍能夠降解麩胱甘肽；醱酵結束時生質之GSH含量往往會迅速下降，比可歸因於化學(自發)降解快得多。因此，該降解為酵素性且顯然對工業生產中可獲得的產率具有不利影響。

現已令人驚訝地發現，一種已知且通常存在於酵母中之酶，亦即稱為天冬胺醯蛋白酶或蛋白酶A且由PEP4基因編碼之蛋白酶(Ammerer等人, Mol Cell Biology, 6, 2490-2499,1986)，藉由將麩胱甘肽水解成甘胺酸及γ-L-麩胺醯基-半胱胺酸(γ-Glu-Cys)來降解麩胱甘肽。

蛋白酶A為存在於釀酒酵母菌之液泡中的一種蛋白水解酶，其早已知且歸類為胃蛋白酶樣天冬胺醯蛋白酶；天冬胺醯蛋白酶廣泛分佈於脊椎動物、真菌、植物及反轉錄病毒中，具有不同的功能及不同的最佳pH範圍。功能差異反映於編碼屬於該家族之酶的基因體序列之間的低同源性(Parr等人, Yeast, 2007)。

在啤酒生產中，釀酒酵母菌蛋白酶A參與降解有助於浮沫形成之蛋白質；PEP4基因之缺失使得啤酒上之浮沫品質更好且穩定性更高(Wang等人, Int J of Food Microbiol, 2007；CN1948462)。

蛋白酶A之不活化亦在畢赤巴斯德酵母菌(Pichia pastoris)之重組菌株中有所描述，該菌株用於生產人類副甲狀腺激素，以防止該副甲狀腺激素之蛋白水解降解(Wu等人, J Ind Microbiol Biotechnol, 2013)。

然而，從未描述蛋白酶A可對麩胱甘肽進行的導致其降解形成γ-Glu-Cys二肽的作用。因此，無法預期使PEP4基因不活化將提高生質中麩胱甘肽之穩定性。

事實上，已證明活性形式之蛋白酶A的存在對生質中部分水解之麩胱甘肽的積聚產生不利影響。正如根據麩胱甘肽降解路徑所預期，水解產物不是半胱胺醯-甘胺酸(Cys-Gly)二肽，而是γ-L-麩胺醯-半胱胺酸二肽(γ-Glu-Cys)。因此，活性形式之蛋白酶A的存在對產生之麩胱甘肽的穩定性具有不利影響。此尤其在醱酵製程結束與麩胱甘肽溶解、提取及純化之後續階段之間的時段內觀察到。在該製程條件下，觀察到生質之麩胱甘肽含量減少及γ-L-麩胺醯-半胱胺酸二肽(γ-Glu-Cys)含量同時增加。

γ-L-麩胺醯-半胱胺酸二肽(γ-Glu-Cys)亦為難以與麩胱甘肽分離之雜質，因為其化學特徵(存在游離硫醇，具有還原及金屬錯合能力)及生化特徵(分子量、等電點)與麩胱甘肽非常相似。因此，高濃度γ-Glu-Cys二肽之存在可干擾麩胱甘肽純化製程。因此，PEP4基因缺失之另一個優點為自酵母菌株獲得之麩胱甘肽的純化製程更有效。

本發明由一種酵母菌株組成，其中PEP4基因功能已例如藉由改變基因結構或表現而降低，或已藉由部分或完全基因缺失而抑制；因此蛋白酶A酶不產生，或以無催化活性之形式產生。此增加由細胞產生且包含於生質中之麩胱甘肽隨時間推移的穩定性，且維持γ-Glu-Cys二肽之低濃度，有利於產物品質及製程產率。

使酶不活化之另一方式為添加蛋白酶抑制劑，更具體地，天冬胺醯蛋白酶抑制劑。該等物質抑制酶之活性，繼而不能再發揮其麩胱甘肽降解活性。

因此，該等作用之最終結果為提高麩胱甘肽製造過程之效率。

本發明之主題為一種能夠生產麩胱甘肽之重組微生物，其特徵在於編碼蛋白酶A之PEP4基因在中該微生物已不活化。

本發明之一個態樣需要該微生物為酵母，諸如單倍體或二倍體酵母。在本發明之一特定具體例中，該微生物為二倍體酵母，其中PEP4基因之兩個複本均已不活化。

根據本發明，PEP4基因可藉由其全部或部分缺失，或藉由突變誘發或插入外源DNA，諸如使用同源重組方法插入選擇標記而不活化。在任何情況下，基因之不活化消除或減少蛋白酶A之表現，或引起非功能性蛋白酶A之表現。

本發明證明： -PEP4基因之不活化提高所產生之麩胱甘肽的穩定性，而其滴度值在室溫下保持穩定 -PEP4基因之不活化減少醱酵條件下γ-麩胺醯-半胱胺酸二肽(γ-Glu-Cys)之存在 -在非醱酵條件下，在產物純化(下游)期間，麩胱甘肽降解為γ-L-麩胺醯-半胱胺酸(γ-Glu-Cys)亦減少。

在一較佳具體例中，本發明藉由使PEP4基因及至少一個經由γ-GT或DUG路徑參與麩胱甘肽降解之基因不活化來提供經基因修飾之酵母。該經由γ-GT或DUG路徑參與麩胱甘肽降解之基因較佳選自ECM38、DUG1、DUG2及DUG3。

在酵母中，特定目標基因可藉由重組機制不活化，該機制將給定基因置換為另一(標記)基因，諸如賦予對抗生素或另一種有毒物質之抗性的基因、營養缺陷型標記或其他基因。為便於後續步驟，標記基因經構築以使其側接由特定重組酶識別之短重複序列，該等重組酶催化移除DNA片段，且隨後消除標記基因。舉例而言，可以此方式使用稱為「Cre」或「R」之重組酶所識別之序列LoxP或LoxR，且存在許多實質上等效的替代方法。

根據本發明，微生物之其他基因修飾，經設計以提高麩胱甘肽之生物合成能力，亦可例如藉由插入GSH1及GSH2基因之一或多個複本來實現，如下所述。

在本發明之一特定具體例中，藉由PEP4基因不活化獲得之重組微生物為屬於釀酒酵母菌物種之微生物。釀酒酵母菌之PEP4基因由1218個核苷酸組成(NCBI參考序列：NM_001183968.1)，位於釀酒酵母菌基因體之染色體XVI中，二倍體細胞中存在其2個複本。

儘管根據本發明之一代表性具體例，能夠產生麩胱甘肽之重組微生物來源於釀酒酵母菌，但可使用屬於酵母組群之任何微生物。該等微生物之實例包括屬於念珠菌屬(諸如產朊假絲酵母(C. utilis))、畢赤酵母菌屬(諸如畢赤巴斯德酵母(P. pastoris))、克魯維酵母菌屬(諸如克魯維乳酸酵母(K. lactis))及裂殖酵母菌屬(諸如粟酒裂殖酵母(S. pombe))之酵母。

根據本發明之重組微生物所源自的酵母較佳為釀酒酵母菌二倍體菌株GN2361或GN2362或GN2373，其天然含有PEP4基因，編碼具有蛋白酶活性之蛋白質。釀酒酵母菌菌株GN2361、GN2362及GN2373又來源於釀酒酵母菌菌株BY4742，其保存於美國菌種保存中心(ATCC)，分配編碼ATCC 201389。自菌株BY4742開始，藉由根據已知技術進行的工程改造活動，使所有先前已知的由ECM38、DUG2及GCG1基因編碼之麩胱甘肽降解路徑不活化(Ganguli等人 2007, Genetics及Baudouin-Cornu等人 2012, J. Biol. Chem.)。

然而，儘管代謝路徑去活化，但自該等菌株獲得之生質在下游階段導致麩胱甘肽降解；在產物純化期間，觀察到麩胱甘肽含量減少以及後來鑑別為γ-麩胺醯-半胱胺酸(γ-Glu-Cys)之雜質增加。

隨後使另一個與麩胱甘肽之生物合成路徑或已知代謝路徑無關的基因(亦即PEP4基因)不活化，獲得其中消除麩胱甘肽生化降解為γ-Glu-Cys之生質；該等生質具有改良穩定性，與工業加工時間相容，且因此提供更好的產物純化之優勢。

令人驚訝地，該等生質在醱酵結束時在醱酵液中亦表現出較低的γ-Glu-Cys存在。藉由在相同的條件下醱酵含有PEP4基因之原始菌株及不含蛋白酶A之相應衍生菌株，在後者菌株中獲得更好的所需產物(麩胱甘肽)與不合需要的產物(γ-Glu-Cys)之間的比率。

本發明表明，在麩胱甘肽之醱酵生產中，PEP4基因之不活化產生品質更好的生質，且同時促進生質之工業可加工性。

根據本發明之重組微生物可源自的另一種酵母為釀酒酵母菌單倍體菌株GN2357，其中PEP4基因同樣位於基因體中之染色體XVI中；然而，單倍體細胞中僅存在其一個複本。

重組二倍體或單倍體微生物中PEP4基因之不活化可藉由將該基因之核苷酸序列置換為外源基因之序列來達成，該外源基因賦予對G418之抗性，G418為一種結構類似於建它黴素(gentamicin)之胺基醣苷抗生素。插入的外源基因隨後藉由酵母細胞中之重組過程而移除。結果為PEP4基因之缺失及其功能之喪失。

用於獲得由於PEP4基因不活化而能夠積聚具有更大穩定性之麩胱甘肽之釀酒酵母菌重組菌株的方法一般可應用於其他麩胱甘肽穩定性有待提高的酵母。

在本發明之一具體例中，畢赤巴斯德酵母菌株中麩胱甘肽降解及γ-Glu-Cys產生減少；特定言之，在相同實驗條件下，不含PEP4基因之菌株表現出較低的γ-Glu-Cys產生，即使歷經長時段。

以下實施例更詳細地說明本發明。實施例1 (比較)

如EP1391517實施例3中所述培養酵母釀酒酵母菌菌株NCYC2958；在醱酵結束時，將酵母離心，且隨後在離心機中用去礦物質水洗滌。將所得生質分散於10體積含有葡萄糖及所述其他營養物之水溶液中，以增加生質之還原麩胱甘肽含量；在該程序結束時，將整個醱酵液離心且用去礦物質水洗滌生質以消除上清液。

隨後，富含GSH之酵母生質進行熱酸溶解，接著經由孔隙率為0.2微米之陶瓷膜微過濾，如EP 1391517之實施例1中所述。將所得幾乎澄清的溶液施加於離子交換樹脂管柱上，隨後施加於吸附樹脂上，且最後藉由奈米過濾濃縮，如該專利之段落[0060]及[0061]中所述。

藉由噴霧乾燥自純化的水溶液獲得呈粉末形式之還原麩胱甘肽；所得產物符合歐洲藥典中規定的純度規格。實施例2 構築缺失ECM38及DUG2之釀酒酵母菌重組菌株

自菌株BY4742開始，藉由如先前技術中所述進行之工程改造活動(Ganguli等人 2007, Genetics, Baudouin-Cornu等人, 2012, J Biol Chem)，使先前已知的由ECM38及DUG2基因編碼之麩胱甘肽降解路徑不活化。

在菌株BY4742中，藉由用側接2個重複loxP序列之克魯維乳酸酵母菌之URA3基因(釀酒酵母菌之URA3基因之同源物)取代來消除DUG2基因(圖1)。

使用包含LoxP-URA3-LoxP卡匣且側接DUG2基因5'及3'區域之DNA片段來轉型菌株BY4742；針對在無尿嘧啶之合成培養基上生長的能力選擇之轉型體經純化及分析，以確認DUG2基因經URA3標記取代。隨後將含有催化麩胱甘肽生物合成所需之2種酶的GSH1及GSH2基因之表現卡匣插入最初含有DUG2基因之基因座中。

按照與關於DUG2所述相同的步驟，藉由用克魯維乳酸酵母菌之LEU2基因標記(釀酒酵母菌之LEU2基因的同源物)取代，消除ECM38基因(在DUG2已缺失之菌株中)。最後，後續重組酶誘導消除2個URA3及LEU2標記基因。

由此獲得一種菌株，其除了DUG2及ECM38基因(負責麩胱甘肽降解)缺失外，亦含有增加麩胱甘肽生物合成及生產之基因GSH1及GSH2的額外複本。實施例3 構築釀酒酵母菌之重組PEP4缺失菌株

先前實施例之微生物用含有賦予對化合物G418之抗性之序列(KanMX4)的DNA片段轉型。作為轉型之結果，該序列插入內源性PEP4基因之位置，從而誘導其剔除。對於單倍體菌株，結果為剔除微生物基因體中存在之PEP4基因的唯一複本；對於二倍體酵母，重複該過程以亦消除PEP4基因之第二複本。

用於轉型之DNA片段含有KanMX4基因之序列(810 bp)，兩側為兩個FRT(翻轉酶識別目標)重組序列及兩個與PEP4基因同源之區域(圖2之第一部分)，其用以允許該片段在PEP4基因座中之定點重組。

KanMX4基因係藉由使用引子P1及P2之結合位點自質體pWKW (Storici等人 1999, Yeast 15:271-283)擴增獲得。

兩個不同的DNA片段，其中之每一者經由一對特定的寡核苷酸獲得，用於剔除微生物基因體中存在之PEP4基因的兩個複本中之每一者。

以下寡核苷酸用於擴增第一片段及剔除PEP4基因之第一複本： FOR1 REV1

以下寡核苷酸用於擴增第二片段及剔除PEP4基因之第二複本： FOR2 REV2

由此獲得之片段1及2經純化且藉由乙酸鋰方法用於微生物之轉型(Kawai等人 2010 Bioeng bugs 1(6) 395- 403)。

酵母用片段1轉型且塗鋪於含有選擇劑G418之YPD培養基上；獲得且分離3個G418抗性菌落。為了驗證轉型及PEP4基因座中片段1之重組，使用以下引子及條件藉由PCR擴增分析3個菌落：與F1及R1配合使用與F2及R2配合使用

藉由0.8%凝膠電泳分析PCR產物，正如所預期，鑑別出953 bp片段及720 bp片段。

將3個轉型體接種於液體YPD培養基中，且在200 rpm、30℃下在攪拌下生長20小時。在細胞培育期間，釀酒酵母菌F1p/FRT之內源重組系統經活化，導致異源KanMX4基因之切除(Park YN等人 Yeast 28(9) 673-681, 2011)。將3種培養物中之每一者適當稀釋塗鋪於YPD培養基上(在無選擇劑G418存在下)。隨後，藉由複製塗鋪將培養盤上生長之菌落轉移至YPD+G418培養基之培養盤。即使在該等培養盤上仍無法生長之菌落為由於Flp/FRT重組而失去異源KanMX4基因之菌落。該等菌落自原始YPD培養盤分離且使用以下引子及條件藉由PCR分析：

藉由0.8%凝膠電泳分析PCR產物，正如所預期，鑑別出600 bp片段，證實PEP4基因之第一複本的剔除。實施例4 構築釀酒酵母菌之重組二倍體菌株

構築菌株GN2363 (來自GN2361)、GN2364 (來自GN2362)及GN2376 (來自GN2373)。如實驗2中所述，對原始菌株GN2361、GN2362及GN2373進行該程序，獲得相應的PEP4缺失菌株：GN2363、GN2364及GN2376。

該程序經證明可複製且適用於各種酵母菌株。

酵母GN2363寄存且登記於獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心(NPMD) (日本，根據布達佩斯條約之國際寄存機構)，登記號為NITE BP-03590。

酵母GN2364寄存且登記於獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心(NPMD) (日本，根據布達佩斯條約之國際寄存機構)，登記號為NITE BP-03591。實施例5 實驗室規模之酵母培養及GSH穩定性試驗

菌株GN2361及GN2363 (原始及重組)在相同條件下使用液體培養中之生長過程在錐形瓶中培養，包含營養階段及隨後的生產階段。

營養階段係藉由將0.5 ml細胞儲備液(冷凍且儲存於-80℃下)接種於20 ml營養培養基(1%酵母提取物、2%蛋白腖、2%葡萄糖)中來獲得。使培養物在28℃下在以200 rpm攪拌下生長16小時。在培育期結束時，將10 ml營養培養物接種於90 ml生產培養基(2%酵母提取物、8%葡萄糖、0.2%半胱胺酸、0.2%甘胺酸、0.2% L-麩胺酸)中。使培養物在28℃下在以250 rpm攪拌下生長48小時。

在培育期結束時，將培養物分成2個相等的等分試樣，以獲得2個相等的樣品用於穩定性試驗。

對於各培養物，立即對等分試樣中之一者進行熱溶解，且藉由HPLC方法分析其麩胱甘肽及γ-Glu-Cys二肽含量。第二等分試樣在25℃下培育24小時。在培育期後，對樣品進行熱溶解，且分析其麩胱甘肽及γ-Glu-Cys二肽含量。

結果列於表1中，其顯示自4個獨立樣品獲得之平均值。表1

菌株	時間(小時)	GSH mg/L	% GSH	γ- GC	% γ-GC
GN2361	0	1083	100	42.7	0
24	1025	95	90.7	112
GN2363	0	949	100	12.0	0
24	927	98	14.3	19

結果表明，PEP4缺失之菌株GN2363產生較少量的γ-Glu-Cys二肽，且此即使在25℃下培育24小時後仍保持不變。原始菌株GN2361 (其含有PEP4基因)呈現γ-Glu-Cys二肽之量增加112%，以及表現出更大的GSH降解(95% GSH殘基對比98%)。實施例6 實驗室規模之酵母培養及生質中麩胱甘肽之穩定性試驗

使用與實施例4中所述相同的程序，培養菌株GN2362及GN2364 (原始及重組)，且在實驗室規模上進行對GSH及γ-Glu-Cys二肽含量之穩定性試驗。

結果列於表2中，其顯示自4個獨立樣品獲得之平均值。表2

菌株	時間 (小時)	GSH mg/L	% GSH殘基	γ-GC mg/L	% γ-GC增加
GN2362	0	1147	100	42.1	0
24	1095	95	79.3	88
GN2364	0	924	100	13.6	0
24	890	96	15.5	14

結果表明，菌株GN2364 (對應於GN2362之 pep4)產生之γ-Glu-Cys二肽的量比親本菌株少。菌株GN2364中γ-Glu-Cys之增加顯著低於親本菌株GN2362 (24小時培育後之14%對比88%)。實施例7 實驗室規模之酵母培養及GSH穩定性試驗

使用與實施例4中所述相同的程序，培養菌株GN2373及GN2376 (原始及重組)，且在實驗室規模上進行對GSH及γ-Glu-Cys二肽含量之穩定性試驗。

結果列於表3中，其顯示自4個獨立樣品獲得之平均值。表3

菌株	時間 (小時)	GSH mg/L	% GSH殘基	γ-GC mg/L	% γ-GC增加
GN2373	0	1056	100	41.5	0
24	1054	100	71.0	71
GN2376	0	926	100	20.9	0
24	918	99	20.1	-3

結果表明，重組菌株GN2376產生較少量的γ-Glu-Cys二肽，其在25℃下培育24小時後保持不變。原始菌株GN2373 (其仍含有PEP4基因)呈現γ-Glu-Cys二肽之量增加71%。實施例8 實驗室規模之單倍體釀酒酵母菌培養及GSH穩定性試驗

使用與實施例4中所述相同的程序，培養菌株GN2357及GN2357-Δpep4，且在實驗室規模上進行對GSH及γ-Glu-Cys二肽含量之穩定性試驗。

結果列於表4中，其顯示自4個獨立樣品獲得之平均值。表4

菌株	時間 (小時)	GSH mg/L	% GSH殘基	γ-GC mg/L	% γ-GC增加
GN2357	0	594.1	100	77.0	0
24	565.7	95	112.5	46
GN2357-Δpep4	0	683.1	100	20.8	0
24	661.4	97	21.3	2

結果表明，菌株GN2357-Δpep4產生較少量的γ-Glu-Cys二肽，其即使在25℃下培育24小時後仍保持不變。實際上，仍含有PEP4基因之菌株呈現γ-Glu-Cys二肽之量增加46%。實施例9 中試規模之酵母培養及GSH穩定性試驗

菌株GN2361及相應的GN2363 (重組Δpep4)藉由在液體培養基中之生長過程進行培養，包含在錐形瓶中之前營養階段及營養階段，以及在生物反應器中之醱酵階段及生產階段。

前營養階段如實施例4中所述進行。

營養階段係藉由將0.1 ml前營養培養物轉移至錐形瓶中之400 ml營養培養基(1%酵母提取物、2%蛋白腖、2%葡萄糖)中來進行。培養物在28℃下在以240 rpm攪拌下培育24小時。

醱酵階段係藉由轉移至含有生產培養基(酵母提取物、葡萄糖、銨、磷酸鹽、硫酸鹽及維生素及礦物質補充劑)之7L生物反應器中，在28℃、充氣(1-2 VVM空氣)及攪拌(600-1200 rpm)下進行。

收穫醱酵培養物之生質，藉由離心濃縮至其體積的一半，且在28℃下再引入含有生產培養基(葡萄糖、銨、磷酸鹽、硫酸鹽、半胱胺酸、甘胺酸及麩胺酸)之7L生物反應器中，充氣(1 VVM空氣)且攪拌(600 rpm)。

在培育期結束時，將培養物分成4個相等的等分試樣，以獲得4個相等的樣品用於穩定性試驗。

對於各培養物，立即對一個等分試樣進行熱溶解，且藉由HPLC方法分析其麩胱甘肽及γ-Glu-Cys二肽含量。其餘3個等分試樣分別在25℃下培育24、48及72小時。在各培育期後，對樣品進行熱溶解，且分析其麩胱甘肽及γ-Glu-Cys二肽含量。

結果列於下表中，其顯示用原始菌株GN2361獲得之資料及用相應的經基因修飾之酵母GN2363進行兩次獨立試驗之資料。表5

菌株	時間(h)	GSH %	γ-GC (mg/1)	γ-GC %
GN2361	0	100	1326	100
24	68	2983	225
48	44	2932	221
GN2363試驗1	0	100	100	100
24	92	130	130
48	71	135	135
GN2363試驗2	0	100	180	100
24	93	278	154
48	84	270	150

GSH及γ-GC：麩胱甘肽及γ-麩胺醯-半胱胺酸之HPLC滴度

資料表明，經基因修飾之生質中麩胱甘肽的穩定性增加，總體降解較少(滴度降低%)且酶促降解幾乎消除(γ-GC增加有限)。實施例10 中試規模之酵母培養及GSH穩定性試驗

如實施例9中所述培養菌株GN2362及其相應的菌株GN2364 (經修飾之 pep4)。

結果列於下表及圖3中。表6

菌株	時間(h)	GSH %	γ-GC (mg/l)	γ-GC %
GN2362	0	100	1503	100
24	70	4170	277
48	56	4451	296
GN2364	0	100	548	100
24	99	428	78
48	90	300	55

GSH及γ-GC：麩胱甘肽及γ-麩胺醯-半胱胺酸之HPLC滴度

資料表明，經基因修飾之生質中麩胱甘肽的穩定性更高，總體降解較少(滴度降低%)且酶促降解幾乎消除(γ-GC增加有限)。γ-GC藉由化學過程緩慢降解。

在GN2362中，細胞溶解迅速釋放蛋白酶A，而γ-Glu-Cys之生長較快，隨後由於自發降解而緩慢下降。

在GN2364中，全細胞及溶解細胞之γ-Glu-Cys生長均較慢。實施例11 畢赤巴斯德酵母菌醱酵及麩胱甘肽穩定性試驗

將菌株畢赤巴斯德酵母菌X-33 (其含有PEP4)、SMD1168H (其不含PEP4)及GN2364 (重組釀酒酵母菌，上文所述)在適合之培養基中在28℃及250 rpm下培養48小時。在醱酵結束時，藉由離心收穫細胞生質且再懸浮於dH ₂O中，獲得各菌株之一種懸浮液。

製備濃度為150 g/l之麩胱甘肽於dH ₂O中之儲備溶液。將儲備溶液之一個等分試樣添加至細胞生質懸浮液中，獲得10 g/l之最終GSH濃度。將添加有GSH之細胞生質分成1.5 ml等分試樣，在25℃之控制溫度下在以900 rpm攪拌下培育。監測γ-Glu-Cys之形成長達96小時，藉由HPLC分析來分析培育不同時間之樣品。所得資料列於圖4中。

資料表明，畢赤酵母菌X-33菌株降解麩胱甘肽得到γ-Glu-Cys，而不含PEP4基因之兩種酵母，畢赤酵母菌SMD1168H及酵母菌GN2364表現出相同的行為且不增加γ-Glu-Cys之產生。

圖1：藉由用側接2個重複loxP序列之乳酸克魯維酵母之URA3基因取代來使DUG2基因缺失。圖2：藉由用側接兩個FRT序列及兩個與PEP4基因同源之區域的KanMX4基因取代來使PEP4基因缺失。圖3：GSH之穩定性 - 該圖顯示在不同時間釀酒酵母菌生質中存在之γ-Glu-Cys二肽的水準。圖4：GSH之穩定性 - 該圖顯示在不同時間巴斯德畢赤酵母生質中存在之γ-Glu-Cys二肽的水準。

寄存國家　　JP日本寄存機構　　獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心(NPMD) 寄存日期　　2022/01/21 寄存號碼　　NITE BP-03590

                        序列表
          <![CDATA[<110>  樂斯福公司]]>
          <![CDATA[<120>  用於生產寡肽之重組酵母]]>
          <![CDATA[<130>  11636MEST(EN)]]>
          <![CDATA[<160>  12    ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  90]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  未知]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          ttgttatcta cttataaaag ctctctagat ggcagaaaag gatagggcgg agaagtaaga       60
          aaagtttagc aaaaataggc gtatcacgag                                        90
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          caaaactaac tcgatgataa gctgtcaaac                                        90
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          <![CDATA[<211>  90]]>
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          <![CDATA[<400>  3]]>
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Claims

一種經基因修飾之酵母，其藉由PEP4基因及至少一個經由γ-GT或DUG路徑參與麩胱甘肽降解之基因不活化。
如請求項1之酵母，其中，該經由γ-GT或DUG路徑參與麩胱甘肽降解之基因係選自ECM38、DUG1、DUG2及DUG3。
如請求項1至2中任一項之酵母，其中，該PEP4基因之不活化係藉由全部或部分基因缺失，或藉由突變誘發或藉由插入外源DNA，尤其與外源DNA同源重組來獲得。
如請求項1至3中任一項之酵母，其為單倍體或二倍體，且其中一個或兩個PEP4基因複本不活化。
如請求項1至4中任一項之酵母，其屬於選自酵母菌屬(Saccharomyces)及畢赤酵母菌屬(Pichia)。
如請求項5之酵母，其係選自釀酒酵母菌(S. cerevisiae)及畢赤巴斯德酵母(P. pastoris)。
如請求項1至6中任一項之酵母，其藉由引入GSH1或GSH2基因之一或多個額外複本而進一步經基因修飾。
如請求項1至7中任一項之酵母，其屬於釀酒酵母菌物種，其菌株寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心(NPMD)，登記號為NITE BP-03590或NITE BP-03591。
一種用於生產麩胱甘肽之醱酵方法，其包含以下步驟： (i)培養請求項1至7中所定義之酵母，從而形成生質， (ii)自該生質分離及純化麩胱甘肽。
一種用於麩胱甘肽生產之生質，其可藉由請求項9之方法的步驟(i)獲得。
一種請求項1至8中所定義之酵母的用途，其係用於製備麩胱甘肽。