TWI786573B - 麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體及使用其生產麩胱甘肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種新穎麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體及使用其生產麩胱甘肽的方法。
Description
本發明是有關一種新穎麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體（glutamate–cysteine ligase variant）及使用其生產麩胱甘肽（glutathione）的方法。
作為存在於大多數細胞中的常見有機硫化合物，麩胱甘肽（GSH）為由三種胺基酸所構成的三肽（tripeptide）：甘胺酸（glycine）、麩胺酸（glutamate）及半胱胺酸（cysteine）。
麩胱甘肽是以麩胱甘肽之還原形式（GSH）及麩胱甘肽的氧化形式（GSSG）存在於生物體中。在正常情形下以相對高比例存在的麩胱甘肽之還原形式（GSH）主要分散在人體的肝臟及皮膚細胞中，且具有諸如分解並移除氧自由基（reactive oxygen）的抗氧化功能、移除諸如有毒物質等外來化合物（xenobiotic compounds）的解毒功能、抑制黑色素等產生的美白功能等的重要角色。
由於麩胱甘肽的產生隨著老化過程進行而遞減，且對於抗氧化及解毒功能扮演重要角色之麩胱甘肽之產生的減少促進氧自由基的累積，而此是導致老化的一個主要因素，因此，有需要麩胱甘肽的外來補充（Sipes IGet al
., 麩胱甘肽在外來化合物之毒性的角色：藉由麩胱甘肽之1,2-二溴乙烷的代謝活化（The role of glutathione in the toxicity of xenobiotic compounds: metabolic activation of 1,2-dibromoethane by glutathione），Adv Exp Med Biol
. 1986; 197: 457–67.）。
由於具有如上所述之各種功能，麩胱甘肽已在作為諸如製藥、保健機能食品、化妝品等各種領域的材料上吸引諸多注意，且也用於製備嘗味成分（taste ingredients）、食物及飼料添加劑中。已知的是麩胱甘肽對於增加原料的嘗味及維持濃厚風味（rich flavors）上有顯著的效果，且藉由單獨使用或與其他物質組合而被使用作為濃厚風味（kokumi
flavor）增強劑。通常，濃厚風味物質已知相較於諸如核酸(nucleic acids)、味精(MSG)等現有的鮮味（umami
）物質具有更濃厚的風味（richer flavors），且能藉由熟化（ripening）期間之蛋白質分解而產生。
儘管對於可使用在各種領域中之麩胱甘肽的需求增加，由於合成麩胱甘肽的合成酵素之過程基於高生產成本而未被商業化，且培養維生物並自其萃取麩胱甘肽之方法的產率過低，故基於麩胱甘肽之工業生產需要可觀的成本，該市場仍未被活化。
[欲解決的技術問題]
經進行大量努力以解決上述問題，結果，本發明的發明人等已研發一種新穎麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體，且發現導入該新穎麩胺酸-半胱胺酸連接酶的菌株之麩胱甘肽生產力有顯著增加，藉此完成本發明。
[解決問題的技術手段]
本發明提供一種新穎麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體，其中對應於SEQ ID NO: 1的胺基酸序列從N端起算第86個位置的胺基酸是以一不同的胺基酸所取代。
本發明提供一種編碼該變異體的多核苷酸及包括其的載體。
本發明提供藉由包括以下的至少一者而生產麩胱甘肽的微生物：該變異體；編碼該變異體的該多核苷酸；以及包含該多核苷酸的該載體。
本發明提供生產麩胱甘肽的方法，包括培養該微生物。本發明的有益功效
本發明之該新穎麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體顯著增加麩胱甘肽生產且因此可被用於高產率之麩胱甘肽的生產中。由於以高產率產生麩胱甘肽之酵母、其乾燥產物、萃取物、培養物和溶解產物，以及所產生之麩胱甘肽具有抗氧化、解毒及增強免疫的效果，其可被有效地用於化妝品組成物、食品組成物、飼料組成物，及藥學組成物，以及其等的製備中。
[最佳實施方式]
本發明將於以下內容中被詳細敘述。同時，揭示於本揭露內容中的各說明內容及實施例可被應用於其他說明內容及實施例。即，本揭露內容中所揭示的各種組件（components）的所有組合落於本發明的範圍內。另外，本發明的範圍並不受限於以下提供的說明。
所屬技術領域具有通常知識者將理解或是能夠確認在不使用多於例行實驗的情形下之本發明的特定實施例之許多等效內容（equivalents）。再者，這些等效內容意欲被解讀為落於隨後的申請專利範圍的範圍內。
本發明的一個態樣提供一種麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體，其中對應於SEQ ID NO:1之胺基酸序列從N端起算第86個位置的胺基酸是以一不同的胺基酸所取代。
該變異體可為包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列中至少一個胺基酸取代的麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體，其中該取代包括將對應於SEQ ID NO: 1從N端起算第86個位置的該胺基酸以一不同的胺基酸取代。
具體而言，該變異體可以是SEQ ID NO: 1之該胺基酸序列之N端起算第86個胺基酸以一不同的胺基酸所取代的蛋白質變異體。
本發明之該「麩胺酸-半胱胺酸連接酶（glutamate-cysteine ligase，GCL）」係亦稱為「麩胺酸-半胱胺酸連結酵素（glutamate-cysteine linking enzyme）」或「γ-穀胺酸半胱胺酸合成酶（gamma-glutamyl cysteine synthetase，GCS）」之酵素。該麩胺酸-半胱胺酸連接酶已知催化下列反應：
左旋麩胺酸 + 左旋半胱胺酸 + ATP ↔ γ-穀胺酸半胱胺酸 + ADP + Pi
另外，已知由該麩胺酸-半胱胺酸連接酶催化的該反應係作為麩胱甘肽合成的第一步驟。
作為衍生自酵母的序列，該麩胺酸-半胱胺酸連接酶可為包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列的蛋白質，但不限於此。
在本發明中，SEQ ID NO:1之該胺基酸序列為由gsh1
基因編碼的胺基酸序列，亦可被稱為「GSH1蛋白質」或「麩胺酸-半胱胺酸連接酶」。構成本發明之麩胺酸-半胱胺酸連接酶的該胺基酸序列可自該NCBI GenBank的已知資料庫獲得。例如，該胺基酸序列可衍生自啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae
），但不限於此，且可不受限地包括具有與該胺基酸序列相同活性的任何序列。
另外，雖然該麩胺酸-半胱胺酸連接酶是界定為包括本發明中之SEQ ID NO:1之胺基酸序列的蛋白質，其不排除可能自然發生的突變，或是藉由SEQ ID NO:1之胺基酸序列之上游或下游的無意義序列添加而可能發生的突變，或是自然發生的突變，或是其緘默突變（silent mutation），且對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者顯見的是具有與包括SEQ ID NO:1之該胺基酸序列的蛋白質相同或相等活性的任何蛋白質屬於本發明的該麩胺酸-半胱胺酸連接酶。
例如，本發明的該麩胺酸-半胱胺酸連接酶可為包括SEQ ID NO:1之該胺基酸序列，或與其之間具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性（homology）或相等性（identity）之胺基酸序列的一蛋白質。再者，顯見的是，只要該胺基酸序列保有上述同源性或相等性且具有與該蛋白質相等的功效，具有其中一或多個胺基酸之刪除、修飾、取代或添加的胺基酸序列的任何蛋白質是在本發明的範圍內。
換句話說，雖然在本發明中使用「具有一預定SEQ ID NO:之胺基酸序列的蛋白質或多肽」及「包括一預定SEQ ID NO:之胺基酸序列的蛋白質或多肽」的表示方式，顯見的是，只要該蛋白質具有與由該預定胺基酸序列所組成之該多肽相同或相等的活性，具有一或多個胺基酸之刪除、修飾、取代或添加的胺基酸序列的任何蛋白質亦可被用於本發明中。例如，顯見的是，「包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列的多肽」屬於「由SEQ ID NO:1之胺基酸序列所組成的多肽」，只要前者與後者具有相同或相等的活性。
如此處所使用的，「變異體」之用語是指由與所記載之序列不同的至少一胺基酸的保留取代（conservative substitution）及／或修飾，同時保有蛋白質之功能或特性所獲得的蛋白質，且基於本發明的目的，可為其中對應於SEQ ID NO:1之胺基酸序列從N端起算第86個位置的胺基酸以半胱胺酸之外的胺基酸所取代的麩胺酸-半胱胺酸連接酶的變異體。該變異體是藉由取代、刪除或添加數個胺基酸而被辨識為與該序列不同。此等變異體通常可藉由修飾該蛋白質的上述胺基酸序列之一者並評估經修飾之蛋白質的特性而辨認。意即，該變異體的能力可相對於一原始蛋白質（native protein）被增強。另外，一些變異體可包括至少一部分，諸如N端前導序列（leader sequence）或跨膜區域（transmembrane domain）被移除的變異體。其他變異體可包括其中一部分自一成熟蛋白質的N-及／或C-端移除的變異體。該用語「變異體」亦可與其他用語互換使用，諸如修飾（modification）、經修飾之蛋白質（modified protein）、經修飾之多肽（modified polypeptide）、突變體（mutant）、突變蛋白（mutein）及趨異體（divergent），且用於指示變化的任何用語亦可不受限地被使用。有鑑於本發明的目的，該變異體可具有相較於野生種或未修飾之蛋白質更增強之活性，但不限於此。
如此處所使用的，該用語「保留取代」是指以具有相似結構及／或化學特性的一不同胺基酸取代一個胺基酸。該變異體可在保有至少一個生物活性之下具有至少一個保留取代。此胺基酸取代通常可基於殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性，及／或兩親性（amphipathic）本質之相似性而發生。
變異體亦可包括對於多肽的特性及二級結構有最小影響的胺基酸之刪除或添加。例如，該多肽可共軛於一蛋白質之N-端的一訊號（或前導）序列，而該蛋白質共轉錄（co-translationally）或後轉錄（post-translationally）地引導該蛋白質的轉移（transfer）。該多肽亦可共軛於另一序列或連接子（linker）以辨認、純化或合成該多肽。
在本發明中，只要取代後之胺基酸是與取代前之胺基酸不同，「以一不同的胺基酸取代」並未被特別限制。意即，以一不同的胺基酸取代SEQ ID NO: 1之該胺基酸序列的N端起算第86個胺基酸的半胱胺酸亦可被表示為「以半胱胺酸以外的胺基酸取代該第86個胺基酸」。同時，在本發明中，顯見的是除非給予「以一不同胺基酸所取代」之表示方式，「以一預定胺基酸所取代」之表達方式表示取代後之胺基酸是與取代前之胺基酸不同。
本發明之該「麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體」亦可被稱為「具有該麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性的一（變異體）多肽」或「GSH1變異體」，其相較於修飾前的蛋白質、野生種多肽或未經修飾的多肽能增加麩胱甘肽的生產，但不限於此。
於該變異體中，SEQ ID NO:1之該胺基酸序列的至少一胺基酸可以不同的胺基酸所取代。具體而言，該變異體可包括以半胱胺酸之外的胺基酸取代對應於SEQ ID NO:1之該胺基酸序列的第86個位置之該胺基酸。該不同的胺基酸可選自於甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、天門冬胺酸、離胺酸、精胺酸，及組胺酸。
在本發明中，顯見的是該「其中SEQ ID NO:1之該胺基酸序列從N端起算第86個胺基酸以一不同胺基酸取代的變異體」包括其中對應於SEQ ID NO:1之該胺基酸序列從N端起算第86個胺基酸以一不同胺基酸取代的變異體，雖然由於在SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的N-或C-端或中央的胺基酸之刪除／添加／取代而使該胺基酸所在位置並非在第86個位置。
再者，雖然其中SEQ ID NO:1之該胺基酸序列從N端起算第86個胺基酸以一不同胺基酸取代的變異體是作為本發明中的該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體的一個實例而揭示，本發明的該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體並非限制於SEQ ID NO: 1之該胺基酸序列的變異體，且顯見的是其中以在具有該麩胺酸-半胱胺酸連接酶活性的任何胺基酸序列中之不同胺基酸取代「對應於SEQ ID NO:1之胺基酸序列的第86個位置的胺基酸」的變異體亦落於本發明之該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體的範圍內。
在任何胺基酸序列中，該「對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的第86個位置的胺基酸」可藉由各種本領域中已知的序列對準（sequence alignment）方法而辨認。
本發明之其中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的N端起算之第86個位置的胺基酸是以不同胺基酸取代的該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體，可為包括SEQ ID NO: 1之該胺基酸序列的蛋白質，或是包括與其之間具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%，或99%同源性或相等性，且其中對應於SEQ ID NO: 1之第86個位置的胺基酸是以一不同胺基酸所取代之胺基酸序列的蛋白質。
根據本發明之SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的N端起算第86個胺基酸是以半胱胺酸之外的胺基酸所取代的該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體可包括SEQ ID NOS: 3至21之胺基酸序列之一者。具體而言，該變異體可實質上由SEQ ID NOS: 3至21之胺基酸序列的一者所組成，且更具體而言，其可由SEQ ID NOS: 3至21之胺基酸序列的一者所組成，但不限於此。
再者，該變異體可包括SEQ ID NOS: 3至21的胺基酸序列的一者，或包括該固定之第86個胺基酸（即，在該變異體的胺基酸序列中，對應於SEQ ID NO: 3至21的第86個位置處的胺基酸是與SEQ ID NO: 3至21的第86個位置處的胺基酸相同）並具有與其至少80%同源性或相等性的胺基酸序列，但不限於此。
具體而言，本發明的該變異體可包括具有SEQ ID NOS: 3至21之胺基酸序列之一者的多肽，及具有與SEQ ID NOS: 3至21之胺基酸序列之一者之間具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%，或99%之同源性或相等性的多肽。再者，顯見的是，只要該蛋白質保有上述同源性或相等性以及與該變異體等效的效果，具有包括在第86個位置之外之位置的一或多個胺基酸之刪除、修飾、取代，或添加的胺基酸序列的任何蛋白質是落於本發明的範圍內。
此處所使用的用語「同源性」或「相等性」是指在兩個給定的胺基酸序列或鹼基序列（base sequence）之間的相關度（degree of relevance），且可被以百分比表示。該用語「同源性」及「相等性」通常可被彼此互換使用。
保留多核苷酸（conserved polynucleotide）或多肽之序列同源性或相等性可藉由標準對位演算法（standard alignment algorithms）而決定，且可與藉由程式所確立的預設空位罰分（default gap penalty）一起使用。實質上，同源或相等的序列可與該整個序列或該序列的全長之至少約50%、60%、70%、80%或90%，在中等或高度嚴密條件下彼此雜交。在經雜交之多核苷酸中，包含簡併密碼子而不是密碼子的多核苷酸亦可被考量。
兩個給定多肽或多核苷酸之間的序列同源性、相似性或相等性可以藉由已知的電腦演算法，諸如「FASTA」程式使用預設參數而決定，例如Pearsonet al
., (1988)Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 85: 2444所導入者。或者是，於The European Molecular Biology Open Software Suite的Needleman程式EMBOSS組合（Riceet al
., 2000,Trends Genet
. 16:276–277）（5.0.0或更新之版本）中進行的Needleman-Wunsch演算法（1970,J. Mol. Biol.
48:443–453）可被用以決定序列同源性、相似性或相等性（包括GCG program package (Devereux, J.,et al
.,Nucleic Acids Research
12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F.,et al
.,J MOLEC BIOL
215: 403 (1990)；Guide to Huge Computers
, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994，及CARILLOet al
. (1988)SIAM J Applied Math
48: 1073)）。舉例而言，該同源性、相似性或相等性可使用國家生物技術資訊中心資料庫（National Center for Biotechnology Information database，NCBI）的BLAST或ClustalW來決定。
多核苷酸或多肽之間的同源性、相似性或相等性可藉由使用GAP電腦程式比對序列資訊而決定，此種程式諸如揭露於Smith and Waterman,Adv. Appl. Math
(1981) 2:482中之Needlemanet al
. (1970)，J Mol Biol
. 48 : 443所介紹者。總而言之，該GAP程式將相似性界定為相似的經對齊之符號（亦即核苷酸或胺基酸）之數量除以兩個序列之較短者中的符號之總數所獲得之值。該GAP程式的預設參數可包括：(1)二進位比較矩陣（包含表示相同的數值1及表示不同的數值0）以及揭露於 Schwartz and Dayhoff, eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure
, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) 中的 Gribskovet al
. (1986)Nucl . Acids Res
. 14: 6745之加權比較矩陣（或EDNAFULL (NCBI NUC4.4之EMBOSS版本) 取代矩陣）；(2)對各空位（gap）之3.0的罰分（penalty）以及各空位中每個符號額外0.10的罰分（或是一個空位開啟10罰分，且一空位延伸0.5罰分）；以及(3)對於終端空位無罰分。
再者，兩個給定多核苷酸或多肽序列之間的序列同源性、相似性或相等性可藉由於南方雜交法實驗中，於經界定之嚴密條件下比較其等的序列而確認，且經界定之嚴密雜交條件是在本技術領域的範圍內且可由所屬技術領域具有通常知識者所熟知的方法界定（例如，J. Sambrooket al
.,Molecular Cloning
,A Laboratory Manual, 第二版
, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, 紐約, 1989；F. M. Ausubelet al
.,Current Protocols in Molecular Biology
, John Wiley & Sons, Inc., 紐約）。
本發明的另一態樣提供一種編碼該變異體的多核苷酸。
如此處所使用的，該用語「多核苷酸」是指核苷酸之聚合物，其中核苷酸單體是彼此藉由共價鍵連結成長鏈形狀，且通常意指具有某些最小長度的DNA或RNA股，更具體而言為編碼該變異體的一多核苷酸片段。
編碼根據本發明之該蛋白質之該變異體的該多核苷酸可包括編碼具有增強之活性的麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體的任何核苷酸序列，但不限於此。
編碼本發明之該麩胺酸-半胱胺酸連接酶的一基因可為gsh1
基因。該基因可衍生自酵母。具體而言，該基因可衍生自屬於酵母（Saccharomyces
）屬，更具體而言屬於啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae
）的微生物。具體而言，該基因可為編碼SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的基因，更具體而言可為編碼包括SEQ ID NO: 2之鹼基序列的序列的基因，但不限於此。
本發明的該多核苷酸可包括在編碼區中所做的各種修飾，只要不藉由密碼子簡併（codon degeneracy）改變自該編碼區所表現之該多肽的胺基酸序列，或者該等修飾是考量多肽將於其中表現之生物體所偏好的密碼子。具體而言，編碼一對應於SEQ ID NO: 1之第86個位置的位置處的胺基酸是以一不同胺基酸取代之蛋白質變異體的任何多核苷酸序列可被包括於其中而不受限於此。舉例而言，本發明之該多核苷酸可具有編碼本發明之該蛋白質變異體的一多核苷酸序列，特別是包括SEQ ID NOS: 3至21之胺基酸序列的一者的蛋白質，或與其具有同源性或相等性的多肽，但不限制於此。該同源性或相等性是如上所述。
另外，該多核苷酸可包括以使用已知基因序列 - 例如，對該核苷酸序列完全或部分互補的核苷酸序列 - 建構的探針在嚴密條件下進行雜交以編碼該對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的第86個位置的胺基酸是以一不同的胺基酸所取代之蛋白質變異體的核苷酸序列，但不受限於此。
該用語「嚴密條件」是指允許多核苷酸之間特定雜交反應的條件。這種條件詳細揭露於已知文件中（例如，J. Sambrooket al
.）。舉例而言，該等條件可包括在具有高同源性，例如，80%或更高，具體而言90%或更高，更具體而言95%或更高，再具體而言97%或更高，且最具體而言99%或更高的同源性的基因之間進行雜交反應，而不在具有低於上述同源性的同源性之基因之間進行雜交反應，或是以南方雜交法之習知清洗條件，即，在對應於60°C、1× SSC，及0.1% SDS；具體而言，60°C、0.1× SSC，及0.1% SDS；及更具體而言68°C、0.1× SSC，及0.1% SDS之溫度及鹽濃度下進行一次，具體而言進行兩次或三次雜交反應。然而，該嚴密條件並不限制於此，且可由本發明所屬技術領域中具有通常知識者根據其目的而適當調整。
雜交需要包含互補序列之兩個多核苷酸，雖然依據該雜交的嚴密性，鹼基之間的錯位是可能發生的。該用語「互補」是用於敘述可彼此雜交之核苷酸鹼基之間的關係。舉例而言，對於DNA，腺苷酸是與胸腺嘧碇互補，而胞嘧啶是與鳥糞嘌呤互補。因此，本發明可包括不只實質上相似的核酸序列，還可包括對整個序列互補的獨立核酸片段。
具體而言，具有同源性或相等性的多核苷酸可在使用包括55°C之Tm
值之雜交程序的上述雜交條件所偵測。再者，該Tm
值可為60°C、63°C，或65°C，但不限於此，且可被適當地由所屬技術領域具有通常知識者依據其目的而調整。
用於雜交多核苷酸的適當嚴密性可依據該多核苷酸之長度及互補性的等級而定，且這些變數在所屬技術領域中為已知的。
本發明的另一態樣提供包括編碼該蛋白質變異體的多核苷酸的載體。
如此處所使用的，該用語「載體」是指包括編碼目標蛋白之多核苷酸的鹼基序列的DNA建構體，其是可操作地連結至適當的調節序列（regulatory sequence）以在合適的宿主細胞中表現該目標蛋白。該調節序列可包括允許起始轉錄的促進子、用於調節該轉錄的運算子序列（operator sequence）、編碼合適的mRNA核醣體結合位置的序列，以及調節轉錄及轉譯之終止之序列。在該載體被導入合適之宿主細胞後，其可相對於該宿主基因組獨立複製或發揮功能，且可被整合至基因組本身。
用於本發明之該載體不特別限制，且任何本領域中已知的載體可被使用。作為由酵母表現的載體，整合酵母質體（integrative yeast plasmids，YIp）及染色體外質體載體可被使用。該染色體外質體載體可包括附加型酵母質體（episomal yeast plasmids，YEp）、複製型酵母質體（replicative yeast plasmids，YRp），及酵母著絲點質體（yeast centromer plasmids，YCp）。再者，人工酵母染色體（YACs）亦可被用作本發明的載體。作為具體實例，可用的載體可包括pESCHIS、pESC-LEU、pESC-TRP、pESC-URA、閘道（Gateway） pYES-DEST52、pAO815、pGAPZ A、pGAPZ B、pGAPZ C、pGAPα A、pGAPα B、pGAPα C、pPIC3.5K、pPIC6 A、pPIC6 B、pPIC6 C、pPIC6α A、pPIC6α B、pPIC6α C、pPIC9K、pYC2/CT、pYD1 酵母顯示載體（Yeast Display Vector）、pYES2、pYES2/CT、pYES2/NT A、pYES2/NT B、pYES2/NT C、pYES2/CT、pYES2.1、pYES-DEST52、pTEF1/Zeo、pFLD1、PichiaPinkTM、p427-TEF、p417-CYC、pGAL-MF、p427-TEF、p417-CYC、PTEF-MF、pBY011、pSGP47、pSGP46、pSGP36、pSGP40、ZM552、pAG303GAL-ccdB、pAG414GAL-ccdB、pAS404、pBridge、pGAD-GH、pGAD T7、pGBK T7、pHIS-2、pOBD2、pRS408、pRS410、pRS418、pRS420、pRS428、酵母微米A型（yeast micron A form）、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pYJ403、pYJ404、pYJ405，以及pYJ406，但不限於此。
舉例而言，編碼染色體中的目標蛋白質的多核苷酸可使用用於將染色體插入細胞的載體，被經突變的多核苷酸所取代。多核苷酸對該染色體的插入可藉由本領域中任何已知的方法進行，例如同源重組，但不限於此。可進一步包括一選擇標記（selection marker）以確認染色體的插入。該選擇標記是用以選擇以該載體轉化的細胞，即，確認目標多核苷酸的插入，且選擇標記的實例可包括提供可選擇之表現型（selectable phenotypes），諸如抗藥性、營養缺陷性（auxotrophy）、對細胞毒性劑（cell toxic agent）之抗性，或表面變異多肽之表現的標記。在以選擇性試劑處理的環境中，只有表現該選擇標記的細胞可以存活或顯現其他的表現型，且因此該等被轉化的細胞可被選擇。
如此處所使用的，「轉化作用（transformation）」之用語係指導入包括編碼該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體之多核苷酸的載體至宿主細胞中，使得由該多核苷酸所編碼的蛋白質被表現於該宿主細胞中之程序。該經轉化的多核苷酸可以是插入宿主細胞之染色體中的形式，或位於染色體外部的形式，只要該蛋白質被表現於該宿主細胞中。再者，該多核苷酸包括編碼該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體的DNA及RNA。只要該多核苷酸被導入至該宿主細胞且該蛋白質於其中被表現，該多核苷酸可以任何形式被導入宿主細胞。舉例而言，該多核苷酸可以表現匣（expression cassette）的形式被導入至宿主細胞中，其是包括對於其自我複製（self-replication）為必須的所有必要元素的基因建構（gene construct）。該表現匣一般可包括可操作地連結至該多核苷酸的引子、轉錄終止訊號（transcription terminator signal）、核醣體結合位置，及轉譯終止訊號（translation terminator signal）。該表現匣可呈自我複製表現載體的形式。另外，該多核苷酸可以其原始形式被導入至宿主細胞並可操作地連結至對於宿主細胞中之表現所需的序列，但不限於此。
另外，此處所使用的用語「可操作地連結（operably linked）」意指編碼本發明之該多肽的多核苷酸序列及一啟動子序列之間的功能性連結（functional linkage），且該啟動子序列起始及調解（mediates）該多核苷酸序列的轉錄。根據本發明之轉化方法包括能夠將載體導入細胞中的任何方法，且可藉由依據該宿主細胞選擇本領域中所熟知的合適標準技術進行。例如，可使用電穿孔法（electroporation）、磷酸鈣（CaPO4
）沉澱法、氯化鈣（CaCl2
）沉澱法、顯微注射法（microinjection）、聚乙二醇（PEG）法、DEAE-聚葡萄糖法（DEAE-dextran method）、陽離子型脂質體方法，以及醋酸鋰-DMSO方法，但本發明不限於此。
本發明可藉由包括下列之至少一者而提供生產麩胱甘肽的微生物：該變異體；編碼該變異體的多核苷酸；及包括該多核苷酸的載體。
該微生物可為表現該變異體的微生物，或該變異體被導入其中的微生物。
如此處所使用的，該用語「包括該變異體的微生物」、「變異體被導入其中的微生物」，或「表現該變異體的微生物」可指藉由增強本質具有低麩胱甘肽生產力之微生物的生產麩胱甘肽的能力而製備的微生物，或藉由將生產麩胱甘肽的能力提供給無法生產麩胱甘肽的母株而製備的微生物。具體而言，該微生物可為表現該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體的微生物，該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體包括SEQ ID NO: 1之胺基酸序列中的至少一個胺基酸突變，且該胺基酸突變可包括將對應於自N端起算第86個位置的胺基酸以一不同胺基酸取代者。另外，該微生物可為表現麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體的微生物，該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體中對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的第86個位置的胺基酸是以一不同的胺基酸取代，但不限於此。
該麩胺酸-半胱胺酸連接酶及其變異體是如上所述。
如此處所述的，蛋白質「將被表現/被表現（to be expressed/being expressed）」是指一個其中一目標蛋白質被導入微生物中或於微生物中被表現之狀態。在該蛋白質存在於該微生物的情形中，相較於其原生蛋白質或修飾前之蛋白質的活性，該蛋白質的活性被增強。有鑑於本發明的目的，該「目標蛋白質」可為上述麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體。
具體而言，該用語「導入蛋白質」是指將一特定蛋白質之活性提供給不具有該蛋白質的一微生物，或是相較於該蛋白質的内在活性（intrinsic activity）或修飾前之活性，增強該蛋白質的活性。舉例而言，導入蛋白質可指將編碼特定蛋白質的多核苷酸導入染色體中，或將包括編碼該特定蛋白質的該多核苷酸的片段或載體導入微生物中，藉此表現該蛋白質的活性。另外，「增強活性」可指相較於内在活性或修飾前的活性，微生物的特定蛋白質之活性被增強。該用語「内在活性」是指當微生物藉由自然或人工基因變化而轉化時，在轉化之前的母株所具有的特定蛋白質之活性。
具體而言，根據本發明之活性的增強可藉由下列至少一種方法進行：增加編碼該蛋白質變異體之基因的複製數（copy number）的方法、將突變導入編碼該蛋白質變異體之基因的表現控制序列的方法、以具有較強活性的序列替代編碼該蛋白質變異體之基因的表現控制序列的方法、以編碼該蛋白質變異體之基因替代編碼野生種蛋白質之染色體基因的方法、額外導入突變至編碼該蛋白質變異體之基因以增強該蛋白質變異體的活性的方法，以及將該蛋白質變異體導入微生物中的方法，但不限於此。
雖然不特別限制於此，增加基因之複製數是以可操作地連結至載體的形式，或以整合至宿主細胞之染色體的形式而進行。具體而言，此方法可藉由將與宿主無關而複製及發揮功能的載體導入宿主細胞中且可操作地連結至編碼本發明之蛋白質的多核苷酸而進行。或者是，基因的複製數可藉由將載體導入宿主細胞中而增加，該載體將該多核苷酸插入該宿主細胞的染色體且是可操作地連結至該多核苷酸。將該多核苷酸插入該染色體可藉由本技術領域中任何已知的方法，例如，同源重組（homologous recombination）而進行。
接著，修飾該表現調節序列以增加該多核苷酸的表現可藉由通過刪除、插入、非保留取代、保留取代，或其等之任意組合而誘導該核苷酸序列的變異以進一步增強該表現調節序列的活性，或藉由以具有較強活性的核苷酸序列取代該核苷酸序列而進行，但不限制於此。該表現調節序列可包括一啟動子、一操作子序列、一核醣體結合位置編碼序列（ribosome binding site encoding sequence），及用於調節轉錄及轉譯的序列，但不限於此。
較本質啟動子強的啟動子可連結於該核苷酸表現單元之上游，但不限於此。舉例而言，當該宿主細胞為酵母，可用的啟動子可包括TEF1啟動子、TEF2啟動子、GAL10啟動子、GAL1啟動子、ADH1啟動子、ADH2啟動子、PHO5啟動子、GAL1-10啟動子、TDH3啟動子（GPD啟動子）、TDH2啟動子、TDH1啟動子、PGK1啟動子、PYK2啟動子、ENO1啟動子、ENO2啟動子，及TPI1啟動子，但不限於此。另外，所述之染色體上的多核苷酸序列的修飾可藉由通過刪除、插入、非保留取代、保留取代，或其等之任意組合而誘導該表現調節序列的變異以進一步增強該多核苷酸序列的活性，或藉由以被修飾以具有較強活性的核苷酸序列取代該核苷酸序列而進行，但不限於此。
一般而言，該蛋白質活性的導入及增強可將該蛋白質的活性或濃度自一野生種或未經修飾之微生物菌株的活性或濃度增加1%、10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%或500%，至1000%或2000%的最大值，但不限於此。
如此處所使用的，該用語「未經修飾之微生物」不排除具有可能自然發生於微生物中之突變的菌株，且可為一野生種菌株、不包括該蛋白質變異體的微生物，或未以包括編碼該蛋白質變異體的多核苷酸之載體所轉化的微生物。
在本發明中，包括該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體或編碼其的該多核苷酸的微生物可為，例如，由以包括該多核苷酸之載體轉化微生物而製備的重組微生物，但不限於此。該重組微生物可為酵母，例如，屬於酵母菌屬的微生物，具體而言如啤酒酵母菌。舉例而言，該微生物可為具有寄存號碼KCCM12659P的啤酒酵母菌菌株，但不限於此。
如此處所使用的，該用語「麩胱甘肽」可與「GSH」互換使用且是指由三個胺基酸所組成的三肽化合物：麩胺酸、半胱胺酸及甘胺酸。麩胱甘肽可被用作藥品、健康機能食品、嚐味成分、食物及飼料添加劑、化妝品及類似者的原料，但不限於此。
如此處所使用的，該用語「生產麩胱甘肽之微生物」包括由天然或人工基因修飾而修飾的微生物，且可指具有經由通過基因修飾而導入外源基因或是增強或去活化內源基因而使特定機制被削弱或增強以生產麩胱甘肽的微生物。有鑑於本發明的目的，該生產麩胱甘肽的微生物可指包括該麩胺酸-半胱胺酸連接酶且相較於野生種或未經修飾之微生物能夠大量生產目標麩胱甘肽之微生物。該「生產麩胱甘肽之微生物」可與「生產麩胱甘肽的微生物」、「具有生產麩胱甘肽之能力的微生物」、「生產麩胱甘肽之菌株」、「具有生產麩胱甘肽之能力的菌株」或類似者互換使用。
該生產麩胱甘肽之微生物可為重組微生物。該重組微生物是如上所述。
該生產麩胱甘肽之微生物的種類不特別限定，只要能由其生產麩胱甘肽，但可為屬於酵母菌屬的微生物，具體而言，可為啤酒酵母菌，但不限於此。
包括該變異體的生產麩胱甘肽之微生物的一母株未特別限制，只要該菌株具有生產麩胱甘肽的能力。該微生物可包括用於增強生物合成途徑的修飾以增加麩胱甘肽生產能力、釋放回饋抑制（feedback inhibition），以及將減弱該分解途徑或生物合成途徑的基因去活化，且這些修飾不排除自然發生的修飾。然而，本發明並不限制於此。
本發明的另一態樣是提供生產麩胱甘肽的方法，其包括培養該微生物。該微生物及麩胱甘肽如上所述。麩胱甘肽可藉由培養該等菌株而被累積於該菌株中。
針對用於培養本發明之菌株的培養基或其他培養條件，任何常用於培養屬於酵母菌屬的微生物的培養基可被使用而不限於此。具體而言，本發明之該菌株可於包含適當碳源、氮源、磷源、無機化合物、胺基酸，及／或維他命的一般培養基中，在好氧或厭氧條件下，於調整溫度、pH值及類似者下被培養。
在本發明中，作為碳源，碳水化合物，諸如葡萄糖、果糖、蔗糖及麥芽糖；糖醇，諸如甘露醇及山梨醇；有機酸，諸如丙酮酸、乳酸及檸檬酸；及胺基酸，諸如麩胺酸、甲硫胺酸及離胺酸可被使用，但不限制於此。另外，諸如澱粉水解物、糖蜜（molasses）、廢糖蜜（blackstrap molasses）、米糠（rice bran）、木薯（cassava）、甘蔗糖蜜（sugar cane molasses）及玉米浸液的天然有機營養物可被使用，且諸如葡萄糖及滅菌預處理之糖蜜（即被轉化成還原糖的糖蜜）等的碳水化合物可被使用，且合適量的任何其他碳源亦可不受限地被使用。這些碳源可被單獨使用或以其至少兩種的組合而使用。
作為氮源，諸如氨（ammonia）、硫酸銨、氯化銨、醋酸銨、磷酸銨、碳酸銨、硝酸銨等無機氮源；以及諸如胺基酸、蛋白腖（peptone）、NZ-胺（NZ-amine）、肉品萃取物、酵母萃取物、麥芽精萃取物、玉米浸液、酪蛋白水解物（casein hydrolysate）、魚或其等的分解產物、以及脫脂大豆餅或其等的分解產物等有機氮源可被使用。這些氮源可被單獨使用或其等之二或多者相互組合而使用。
作為磷源，磷酸二氫鉀（monopotassium phosphate）、磷酸氫二鉀（dipotassium phosphate）、或對應其等的含鈉之鹽類等可被使用。作為該等無機化合物，氯化鈉、氯化鈣、氯化鐵、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳、碳酸鈣及類似物可被使用。
該培養基可進一步包括胺基酸、維生素，及／或合適的前驅物。具體而言，左旋胺基酸或類似物可被添加至該培養基供該菌株使用。具體而言，甘胺酸、麩胺酸鹽，及／或半胱胺酸可被添加至該培養基，且若有需要，諸如離胺酸的左旋胺基酸可被進一步添加，但本發明不限制於此。
該培養基或前驅物可被以批次（in a batch）或連續模式添加至該培養物，但不限制於此。
在本發明中，於該菌株的培養過程期間，諸如氫氧化銨（ammonium hydroxide）、氫氧化鉀、氨水、磷酸及硫酸等化合物可被適當添加至該等培養物以調整該等培養物的pH值。再者，諸如脂肪酸聚乙二醇酯（fatty acid polyglycol ester）的消泡劑（defoaming agent）可被添加以抑制培養期間泡沫的形成。另外，氧氣或含氧氣體可被注入該培養物以維持該培養物的好氧狀態（aerobic state），而氮氣、氫氣或二氧化碳氣體可被注入該等培養物，或是不注入任何其他氣體至該等培養物，以維持該等培養物的厭氧（anaerobic）或微好氧（microaerobic）狀態。
該等培養物的溫度可被維持於25°C至40°C，且更具體而言，28°C至37°C，但並不限制於此。培養可持續進行直到所欲之量的所欲物質被獲得，具體而言，繼續進行1至100小時，但並不限於此。
用於生產麩胱甘肽的方法可進一步包括在培養步驟之後的一額外程序。該額外程序可根據麩胱甘肽的使用目的而被適當地選擇。
具體而言，生產麩胱甘肽的方法可包括在培養該微生物後，自選自於該菌株、該菌株的一乾燥產物、該菌株的一萃取物、該菌株的一培養物以及該菌株的一溶解產物的至少一者收集麩胱甘肽。
該方法可進一步包括在回收步驟之前或與回收步驟同步溶解該菌株的步驟。該菌株之溶解可藉由本發明所屬技術領域中任何已經常使用的方法進行，例如，藉由熱處理或藉由使用用以溶解的緩衝溶液、一超音波振盪器（sonicator）及法式壓碎機（French press）。再者，該溶解步驟可包括酵素反應，該酵素反應是藉由細胞壁溶解酵素（cell wall lytic enzyme）、核酸酶（nuclease）、核苷酸基轉移酶（transnucleotidase）、蛋白酶或類似物進行，但並不限制於此。
有鑑於本發明的目的，各自具有高麩胱甘肽含量的乾燥酵母、酵母萃取物、酵母萃取物混合粉末，及純麩胱甘肽可藉由生產麩胱甘肽的方法被製備。然而，本發明並不限制於此，且這些產品可根據所欲的產物而被適當製備。
在本發明中，乾燥酵母可與「該菌株之乾燥產物」互換使用。該乾燥酵母可藉由將其中累積有麩胱甘肽的酵母菌株乾燥而製備，且具體而言，其可被包括於一飼料組成物、一食物組成物及類似物中，但不限制於此。
在本發明中，該酵母萃取物可與諸如「菌株之萃取物」之用語互換使用。該菌株之萃取物可指在將細胞壁自該等菌株分離後剩餘的物質。具體而言，該菌株的萃取物可指藉由細胞之溶解所獲得之組分除去細胞壁的剩餘組分。該菌株之萃取物包括麩胱甘肽及麩胱甘肽之外的選自於下列之一或多個其他組分：蛋白質、碳水化合物、核苷酸，及纖維，但不限於此。
該回收步驟可使用本技術領域中任何已知的適合方法而進行，且麩胱甘肽可做為目標物質而被回收。
該回收步驟可包括一純化過程。該純化過程可藉由自該菌株僅分離麩胱甘肽而進行。經由該純化過程，純麩胱甘肽可被製備。
若有需要，製備麩胱甘肽的方法可進一步包括將賦形劑與選自於下列之一者混合：該菌株、該菌株的乾燥產物、該菌株的萃取物、該菌株的培養物，及該菌株的溶解產物，以及自其等回收的麩胱甘肽。藉由混合步驟，酵母萃取物混合粉末可被製備。
該賦形劑可根據其目標用途或其形式而被適當地選擇及使用，且可為，例如，選自於澱粉、葡萄糖、纖維素、乳糖、肝醣、右旋甘露醇（D-mannitol）、山梨醇、乳糖醇、麥芽糊精、碳酸鈣、合成矽酸鋁、正磷酸氫鈣（calcium monohydrogen phosphate）、硫酸鈣、氯化鈉、碳酸氫鈉、純化羊毛酯（lanolin）、糊精、海藻酸鈉、甲基纖維素、膠體二氧化矽膠（colloidal silica gel）、羥丙澱粉（hydroxypropyl starch）、羥丙基甲基纖維素、丙二醇、酪蛋白（casein）、乳酸鈣、羧甲基澱粉鈉（primogel）及阿拉伯膠，且具體而言，其可包括選自於澱粉、葡萄糖、纖維素、乳糖、糊精、肝醣、右旋甘露醇及麥芽糊精的至少一者，但不限於此。
該賦形劑可包括，例如，一防腐劑（preservative）、一濕潤劑（humectant）、一分散劑、一懸浮劑、一緩衝劑、一穩定劑，或一等滲劑（isotonic agent），但不限於此。
本發明的另一態樣提供用於生產麩胱甘肽之麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體的用途。本發明的另一態樣提供用於生產麩胱甘肽之微生物的用途。該麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體、該微生物及麩胱甘肽如上所述。[ 發明模式 ]
此後，本發明將參照下列實例及實驗例而被更詳細地敘述。然而，該等實例及實驗例僅用於例示本發明，而本發明的範圍為並未限制於此。
實例
1
：選擇生產麩胱甘肽之菌株及確認生產麩胱甘肽之能力
菌株由包含各種菌株的酵母塊（yeast block）獲得，且其等的特徵被改良以選擇具有麩胱甘肽生產能力的菌株。
具體而言，諸如米、大麥、綠豆及燕麥的穀物樣品係收集自韓國京畿道（Gyeonggi Province）之諸如華城（Hwaseong）、平澤（Pyeongtaek）、龍仁（Yongin）及類似者等20個區域，經過粉化、研磨、包裹於布中、緊壓以成形、以稻草包裹以進行發酵10天，並緩慢乾燥以製備酵母塊。
下列實驗被進行以將各種菌株自經製備的酵母塊分離。45毫升（mL）的鹽水水溶液（saline solution）被添加至5克（g）的酵母塊並使用混合器粉化。對於純分離（purely isolating）酵母菌株，產物藉由系列的稀釋過程而被稀釋、分布於YPD洋菜（每1升蒸餾水中，10克/升酵母萃取，20克/升細菌用蛋白腖（bacto peptone），及20克/升葡萄糖）上，並於30°C下培養48小時。接著，根據菌落的型態及微觀驗證（microscopic verification），酵母的菌落於YPD洋菜上呈紋路狀（streaked）。25毫升之YPD培養液被播種於250毫升錐形瓶中，且該純分離菌株被接種於其上並於一搖晃培養器（shaking incubator）中在30°C及200 rpm下培養48小時。菌株藉由辨識麩胱甘肽的生產而篩選。
為了改良主要分離的菌株，隨機突變被導入該等分離的菌株中。具體而言，被確認具有麩胱甘肽生產能力的一菌株自該酵母塊分離，並指定為CJ-37菌株。該CJ-37菌株被於固態培養基中培養並接種至培養液（broth）中以獲得其培養溶液，且使用UV燈而使該培養溶液被暴露於UV光下。在暴露於UV射線的該培養溶液被放置於盤狀培養基上後，只有已形成菌落的突變菌株被分離，且其麩胱甘肽生產被辨認。
結果，在該等突變菌株中，展現最大的麩胱甘肽生產的菌株被選擇作為生產麩胱甘肽之菌株，命名為CJ-5菌株，依照布達佩斯條約於2019年7月31日寄存於韓國微生物保藏中心（Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM），並指定有KCCM12568P之寄存編號。
實例
2
：用以進一步改良麩胱甘肽生產能力的實驗
突變以下列方式被誘發以進一步改良該CJ-5菌株的麩胱甘肽生產能力。
該CJ-5菌株於固態培養基中被培養且接種至一培養液中以獲得一培養溶液，且使用UV燈而使該培養溶液被暴露於UV光下。在暴露至UV光的培養溶液被設置於盤狀培養基上後，只有形成菌落的突變菌株被分離。展現最大麩胱甘肽生產的菌株被分離，命名為CC02-2490菌株，依照布達佩斯條約於2020年1月17日寄存於韓國微生物保藏中心（KCCM），並指定有KCCM12659P之寄存編號。作為分析麩胱甘肽生物合成基因之該gsh1
之鹼基序列的結果，對於該菌株的麩胱甘肽生產能力的增強，已確認的是由該gsh1
基因編碼之該GSH1蛋白質的第86個胺基酸之半胱胺酸已以精胺酸所取代。
實例
3
：對於
GSH1 C86
殘基之
突變的實驗
考量基於實例2之結果，該GSH1蛋白質的第86個位置處的胺基酸對於麩胱甘肽生產為重要的，啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae ， S. cerevisiae
）CEN.PK2-1D及啤酒酵母菌（S. cerevisiae
）CJ-5之突變菌株被製備，使得其中該GSH1蛋白質之第86個位置的半胱胺酸以不同胺基酸取代的蛋白質變異體被表現，且麩胱甘肽生產的增加被辨識。
為了製備啤酒酵母菌之GSH1蛋白質的第86個位置處的半胱胺酸被以精胺酸取代的菌株， pWAL100及pWBR100質體在參考Lee THet al.
的論文（J. Microbiol. Biotechnol
. (2006), 16(6), 979–982）下被使用。具體而言，聚合酶鏈反應（PCR）使用該CJ-5菌株之基因體DNA作為模板而如下所示般進行。包括N端BamHI毗鄰序列（flanking sequence）、GSH1 ORF初始密碼子，及C86R編碼突變序列（mutation-encoding sequence）的該GSH1蛋白質的N端的部分序列藉由使用SEQ ID NOS: 22及23作為引子進行PCR而獲得，且包括C端Xhol毗鄰序列、GSH1 ORF終止密碼子，及一C86R編碼突變序列的該GSH1蛋白質的C端的部分序列藉由使用SEQ ID NOS: 24及25之引子進行PCR而獲得。隨後，作為使用以SEQ ID NOS: 22及23之引子作為模板的兩個序列而進行重疊PCR的結果，一GSH1 ORF區段，包括編碼GSH1-修飾蛋白質的序列被獲得，其中第86個位置的半胱胺酸以精胺酸取代，以及N端BamHI及C端Xhol限制酶序列。該ORF區段被以BamHI及Xhol處理且接著複製至以相同酵素處理之pWAL100載體中以製備一pWAL100-GSH1(C86R)載體。
再者，包括N端Spel及C端Ncol限制酶序列的GSH1 ORF終止密碼子下游之500 bp藉由使用CJ-5菌株之基因體DNA作為模板及SEQ ID NOS: 26及27之引子進行PCR並以Spel及Ncol限制酵素處理而獲得。隨後，該產物被複製於以相同酵素處理的pWBR100中以製備pWBR100-GSH1載體。
為了製備被導入至該酵母的最終DNA區段，包括編碼精胺酸突變及KIURA3之一部分的序列的PCR產物使用如上述方式製備之pWAL100-GSH1(C86R)載體作為模板及SEQ ID NOS: 22及28之引子而獲得，且包括KIURA3的一部份及該GSH1終止密碼子下游之500 bp的PCR產物使用該pWBR100-GSH1載體做為模板及SEQ ID NOS: 29及27之引子而獲得。啤酒酵母菌CEN.PK2-1D及啤酒酵母菌CJ-5以PCR產物在相同莫耳比轉化。PCR經由95°C，5分鐘的變性作用，53°C，1分鐘的退火，以及72°C，每公斤1分鐘的聚合作用而進行，且該酵素的轉化根據從揭露於Geitz之論文（Nucleic Acid Research
, 20(6), 1425）的方法修飾而來的醋酸鋰方法而進行。具體而言，具有0.7至1.2之OD的酵母細胞以醋酸鋰/TE緩衝液清洗兩次並與該等PCR產物及單股DNA（Sigma D-7656）混合。該等細胞在靜態培養條件下，於醋酸鋰/TE/40% PEG緩衝液，在30°C下培養30分鐘及在42°C下培養15分鐘。接著，該等細胞於不包括尿嘧啶的SC（2%葡萄糖）洋菜盤中培養，直到菌落為可見地以獲得該GSH1 C86R編碼突變序列及該KIURA3基因被導入其中的菌株。隨後，為了移除KIURA3，該等菌株於2毫升之YPD隔夜培養，以1/100的比例稀釋，設置於包括0.1% 5-FOA之SC（2%葡萄糖）洋菜盤上以製備啤酒酵母菌CEN.PK2-1D GSH1 C86R突變菌株及啤酒酵母菌CJ-5 GSH1 C86R突變菌株，其中一尿嘧啶標記被移除。得以表現其中半胱胺酸以精胺酸之外的18種胺基酸取代的GSH1-修飾蛋白質的菌株亦以相同方式被製備，除了使用SEQ ID NOS: 23及24之引子對的情形中編碼第86個精胺酸的序列以編碼一不同胺基酸的序列所取代。
表1
| 引子 | 5′→3′ 序列 |
| F_BamHI_GSH1 (SEQ ID NO: 22) | GGTAGGATCCATGGGACTCTTAGCTTTGGGCAC |
| R_GSH1_C86R (SEQ ID NO: 23) | TTAGCCTCCCT AAGGGACGAATCCT |
| F_GSH1_C86R (SEQ ID NO: 24) | CGTCCCTTAGG GAGGCTAACGATGT |
| R_XhoI_GSH1 (SEQ ID NO: 25) | ATGACTCGAGTTAACATTTGCTTTCTATTGAAGGC |
| F_SpeI_GSH1_DW (SEQ ID NO: 26) | TAGAACTAGTACTCCTTTTATTTCGGTTGTGAA |
| R_NcoI_GSH1_DW (SEQ ID NO: 27) | GCTGCCATGGGAATAGTGTGAACCGATAACTGTGT |
| R_AL killer (SEQ ID NO: 28) | GAGCAATGAACCCAATAACGAAATCTT |
| F_BR killer (SEQ ID NO: 29) | CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAG |
在培養以上述方式製備之菌株26小時後，所生產之麩胱甘肽（GSH）的濃度被量測且列於表2及3中。
表2
表3
基於實驗結果，已確認的是相較於該野生種GSH1蛋白質所獲得之麩胱甘肽生產能力，藉由以不同胺基酸取代該GSH1蛋白質之第86個位置的半胱胺酸所獲得的麩胱甘肽生產能力增加高達27%。
基於此，已確認的是藉由以不同胺基酸取代該GSH1蛋白質之第86個位置的半胱胺酸所製備的該GSH1變異體具有顯著改良的麩胱甘肽生產能力。
實例
4
：另一
Cys
殘基對麩胱
甘肽生產之功效的確認
作為比較例，該GSH1蛋白質的另一Cys殘基被修飾，且藉由修飾而獲得的麩胱甘肽生產能力被辨識。結果顯示於下表4中。
表4
參考實驗結果，第86個位置之半胱胺酸之外的半胱胺酸殘基對於增加麩胱甘肽之生產沒有效果，但反而降低麩胱甘肽之生產。
基於此，已證實的是，並非存在於該蛋白質中的所有半胱胺酸殘基對於增加麩胱甘肽之生產為有效的。再者，已確認的是，本發明中所研發的該新穎GSH1變異體已增加麩胱甘肽之生產。
由於生產麩胱甘肽的該酵母具有高產率，其乾燥產物、萃取物、培養物及溶解產物，以及所生產的麩胱甘肽具有抗氧化、解毒及增強免疫的功效，其可被有效地用以製備化妝品組成物、食品組成物、飼料組成物，及醫藥組成物。
本發明之以上說明是被提供用於解說的目的，且對所屬技術領域中具有通常知識者而言可以理解的是，各種改變及修飾可在不改變本發明之技術概念及必要特徵下被進行。因此，能被清楚了解的是上述實施例在所有態樣中為說明性地且不限制本發明。此處所揭露的各種實施例並非意欲為限制性地，而本發明的真正範圍及精神是以下列申請專利範圍所表示。本發明僅由所附之申請專利範圍的內容，以及這些申請專利範圍所具備之完整等效範圍所限制。
寄存機構：韓國微生物保藏中心(KCCM)
寄存編號：KCCM12568P
寄存日期：2019年7月31日
寄存機構：韓國微生物保藏中心(KCCM)
寄存編號：KCCM12659P
寄存日期：2020年1月17日
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<400> 29
（無）
Claims (11)
- 一種麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體，其中，對應於SEQ ID NO：1之胺基酸序列的N端起算第86個位置的胺基酸是以一不同胺基酸所取代。
- 如請求項1所述之麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體，其中，對應於第86個位置的該胺基酸是以甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、天門冬胺酸、離胺酸、精胺酸或組胺酸所取代。
- 如請求項1所述之麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體，其中，該變異體包含選自於SEQ ID NOS：3至21的一個胺基酸序列。
- 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至3之任一項的麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體。
- 一種載體，其包含如請求項4之多核苷酸。
- 一種生產麩胱甘肽的微生物，其包含下列至少一者：如請求項1至3之任一項所述的麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體；編碼該變異體的一多核苷酸；以及包含該多核苷酸的一載體。
- 如請求項6所述的微生物，其中該微生物為屬於酵母菌屬(genus Saccharomyces)的一微生物。
- 如請求項6所述的微生物，其中該微生物為啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。
- 如請求項6所述的微生物，其中該微生物為寄存於韓國微生物保藏中心(KCCM)、寄存編號為KCCM12659P的啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。
- 一種生產麩胱甘肽的方法，該方法包含於一培養基中培養包含下列至少一者的微生物：如請求項1至3之任一項所述的麩胺酸-半胱胺酸連接酶變異體；編碼該變異體的一多核苷酸；以及包含該多核苷酸的一載體。
- 如請求項10所述的方法，進一步包含自選自於下列之至少一者回收麩胱甘肽：經培養之該微生物、該微生物之一乾燥產物、該微生物之一萃取物、該微生物之一培養物，以及該微生物之一溶解產物。
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