JP2005073638A - キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を用いて改変されたキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養し、得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することにより、γ−グルタミルシステイン、システイン又はシステニルグリシン含有食品を製造する。
【選択図】 なし
Description
γ−グルタミルシステインは、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)では、γ−グルタミルシステイン合成酵素の働きによりシステインとグルタミン酸を基質にして合成される。また、グルタチオンはグルタチオン合成酵素の働きによりγ−グルタミルシステインとグリシンを基質にして合成される。γ−グルタミルシステインを高含有する酵母は、特許文献1、非特許文献1〜3などで報告されている。しかし、これらの報告は全てサッカロマイセス・セレビシエを用いてなされた検討であり、キャンディダ・ユティリスを用いた報告例はない。
(1)下記(A)又は(B)に示すタンパク質をコードするDNA。
(2)下記(a)又は(b)に示すDNAである(1)のDNA。
(3)(1)又は(2)のDNAを用いてグルタチオン合成酵素活性が0.003μmolGSH/mgタンパク質/時間以下になるように改変されたキャンディダ・ユティリス
(4)(1)又は(2)のDNAを用いてグルタチオン合成酵素活性が上昇するように改変されたキャンディダ・ユティリス。
(5) 下記(c)又は(d)に示すDNAを用いてグルタチオン合成酵素活性が0.003μmolG
SH/mgタンパク質/時間以下になるように改変されたキャンディダ・ユティリス。
(d)配列番号1の塩基番号58〜981の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
(6)配列番号3のDNAを用いてγ−グルタミルシステイン合成酵素活性が上昇するように改変された(3)〜(5)のいずれかのキャンディダ・ユティリス。
(7)(3)〜(6)のいずれかのキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物、若しくはグルタチオン及び/又はγ−グルタミルシステインを含む前記培養物の分画物、又は熱処理或は酵素処理によりガンマ位のグルタミン酸が遊離したこれらの培養物もしくは分画物を含む飲食品。
(8)(3)〜(6)のいずれかのキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物を用いて製造された酵母エキス。
(9)(3)〜(6)のいずれかのキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養し、得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することを特徴とする、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有食品の製造法。
<1>キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子
本発明のDNAは、下記の(A)又は(B)のタンパク質をコードするDNAである。
(B) 配列番号2に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質。
いる変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等をもたらす変異には、グルタチオン合成酵素を保持するキャンディダ・ユティリスの菌株の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutationまたはvariation)も含まれる。上記のような変異を有するDNAを、サッカロミセス・セレビシエ等の適当な細胞で発現させ、その細胞のグルタチオン合成酵素活性を調べることにより、グルタチオン合成酵素と実質的に同一のタンパク質をコードするDNAが得られる。
<2>本発明のキャンディダ・ユティリス
本発明のキャンディダ・ユティリスは、本発明のDNAの全部又はその一部を用いることにより、グルタチオン合成酵素活性が野生株より上昇又は減少するように改変されたものであり、より望ましくは、さらに配列番号3記載のDNAを併用することにより、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が上昇するように改変されたものである。キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素活性が野生株より減少するように改変するために用いるDNAは、配列番号1の塩基番号58〜981の塩基配列を含むDNA、または配列番号1の塩基番号58〜981の塩基配列もしくは同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。
酵素活性が検出限界以下であることが好ましい。
グルタチオン合成酵素活性が低下した菌株は、メチルグリオキサールに対する感受性を指標として選択することができる(Ohtake, Y. et al., Agri. Biol. Chem., 54(12), 3145-3150, 1990)。グルタチオンを一定量生合成できる合成酵素活性を有する菌株(グルタチオン合成酵素活性及びγ-GC(グルタミルシステイン)合成酵素活性を有する菌株)は、メチルグリオキサールに耐性を示す。また、グルタチオンを含有しない培地での生育を調べることによっても、グルタチオン合成酵素活性が低下していることを確認することができる。更に、グルタチオン合成酵素活性が低下した菌株は、MNNG(N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン)濃度勾配プレートを利用することにより効率的に取得することができる。(国際公開第03/046154号パンフレット)
一方、遺伝子組換え技術を利用してグルタチオン合成酵素活性を上昇させるには、グルタチオン合成酵素活性が上昇するようにグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子が改変されていてもよいし、グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子の発現量が上昇するように改変されていてもよい。例えば、グルタチオン合成酵素活性は、配列番号1記載のグルタチオン合成酵素遺伝子を発現可能な形態でキャンディダ・ユティリスに導入することによって、増強することができる。
み込む方法がある(Kondo, K. et al., J. Bacteriol., 177, 7171-7177 (1995))。具体的には、前記遺伝子置換と同様にして行うことができる。
<3>本発明の酵母エキス、飲食品及びその製造法
上記のようにして得られるグルタチオン合成酵素活性を改変した酵母を好適な条件で培養して得られた培養物又はその分画物は、グルタチオン或はγ−グルタミルシステインを含有する。培養物は、酵母菌体を含む培養液であってもよいし、それから採取された酵母菌体、菌体破砕物、又は菌体抽出物(酵母エキス)であってもよい。菌体破砕物又は酵母エキスから、グルタチオンあるいはγ−グルタミルシステインを含む画分を得てもよい。
(1)キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素をコードすると予測される遺伝子の取得
キャンディダ・ユティリスATCC15239株をYPD試験管培地で30℃で振とう培養し、Genとるくん酵母用(宝酒造(株)、Code9084)を用いて、菌体から染色体を回収した。
〔YPD培地組成〕
グルコース 2%
ペプトン 1%
酵母エキス 1%
(pH5.0)
サッカロマイセス・セレビシエ(クリスら、Molecular Biology of the Cell., 8, 1699-1707, 1997)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(クリスら、Molecular Biology of the
Cell., 8, 1699-1707, 1997)、及びラット(クリスら、Molecular Biology of the Cell., 8, 1699-1707, 1997)のグルタチオン合成酵素のアミノ酸配列から、以下の相同性が高い配列を選定した。
(i)QEVAVVYYR(配列番号5)
(ii)GSKKIQQ(配列番号6)
(iii)VLKPOREGGGNNVLKPQREGGGNN(配列番号7)
(iv)ISELGIYG(配列番号8)
(v)GGVAAGF(配列番号9)
各々のアミノ酸配列から縮重プライマーを設計し、(i)と(ii)、(i)と(iii)、(i)と(iv)、(i)と(v)、(ii)と(iii)、(ii)と(iv)、(ii)と(v)、(iii)と(iv)、(iii)と(v)、及び(iv)と(v)の各々の組み合わせに対応する宿重プライマーを用いて、degenerated PCRを行なった。PCR産物をアガロースゲルで電気泳動し、予想される大きさの領域を切り出し、DNAを回収した。さらに、この回収DNAを鋳型としてnested PCRを行なったが、目的の断片を取得することはできなかった。
(vi)GSKKIQQ(配列番号6)
(vii)EGGGNN(配列番号10)
(viii)PQREGGG(配列番号11)
上記(vi)のアミノ酸配列に対応するプライマー(GGT TCY AAG AAG ATY CAR CA(配列番号12))と、(vii)のアミノ酸配列に対応するプライマー(CCA CCA CCY TCT CTY TGT GG(配列番号13))を用いてPCRを行った。PCRは、KOD dash(TOYOBO社 コードLDP-101)を使用して、製造者の指示に従い、次の条件で行った。94℃ 2分 → 94℃1分、55℃(1サイクル毎に0.5℃づつ温度減少)1分、74℃ 40秒を22サイクル → 94℃1分、50℃1分、74℃40秒を15サイクル。
1回目PCR:AAG ATA TAC CCA TTG GAT GG(配列番号15)及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
2回目PCR:TCA GAT CTT GGT AAA GAG GC(配列番号16)及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
3回目PCR:AGA CTG GCA TTT GAG TCT CC(配列番号17)及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
PCRは、KOD dash(TOYOBO社 コードLDP-101)を使用し、製造者の指示に従い、次の条件で行った。94℃2分 1サイクル → 94℃1分、50℃30秒、74℃40秒を30サイクル。
cDNA調製用プライマー:TTG ACA CCA ACT CGG AGA CAT CAG A(配列番号18)
nested PCR:GAG AGT ACC TTC TCA TCC GTC AAG A(配列番号19)及びキット付属のGeneRacer 5'Nested Primerを用いた。
プライマーF1:TAG CCA ATA CAA CCA GCA ACA C(配列番号20)
プライマーR1:GAA GGA ATT CTA ATT CGT GAG G(配列番号21)
このようにして増幅したPCR産物の塩基配列を常法に従って決定したところ配列番号1に示す塩基配列と一致した。また、この塩基配列によりコードされると予想されるグルタチオン合成酵素のアミノ酸配列を配列番号2に示す。このようにして、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子ホモログを取得した。
(2)キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードすると予測される遺伝子の取得
サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベのγ−グルタミルシステイン合成酵素のアミノ酸配列(Ohtake et al (Yeast 1991 Dec;7(9):953-961)、Mutoh et al (J Biochem(Tokyo) 1995 Feb;117(2):283-288))から、以下の相同性が高い配列を選定した。
(ix)MGFGMG(配列番号22)
(x)GWRVEFR(配列番号23)
各々のアミノ酸配列から縮重プライマーを設計し、degenerated PCRを行なった。(ix)の領域に相当するプライマーとして、プライマーF1(ATG GGN TTY GGN ATG GG) (配
列番号24)を、(x)の領域に相当するプライマーとしてプライマーR1(RAA YTC NAC NCK CCA)(配列番号25)を設計した。DNA polymeraseとしてKOD dash(TOYOBO社)を用いて製造者の指示に従ってPCRを行なった。PCRの条件は94℃3分を1サイクル→94℃1分, 52℃1分, 74℃1分を30サイクルで行なった。
1回目のPCR:TGA ACA GAG CTC GTT ACC TC(配列番号26)
及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
2回目のPCR:TCA TGG GCT AAT TTT GCA CC(配列番号27)
及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
3回目のPCR:TTC CTA GCA TTG ACG GCA GC(配列番号28)
及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
PCRは、KOD dashを使用し、製造者の指示に従い、次の条件で行なった。94℃2分1サイクル→94℃1分、50℃30秒、74℃40秒を30サイクル。PCR産物をpGEM-T Easy vectorに連結し、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体がもつインサートの塩基配列を解析し、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を含んでいると予測される遺伝子断片情報を取得した。
AGC ACC AGA AAT GAC GTT C(配列番号29)
製造者の指示に従って作製したcDNAライブラリーより、以下のプライマーを用いて3回のPCRを行なった。PCRは、KOD dashを使用し、製造者の指示に従い、次の条件で行なった。94℃2分1サイクル→94℃1分、50℃30秒、74℃40秒を30サイクル。
1回目のPCR:CCA TCT GAC GAC ATC CTG CTG(配列番号30)及びキットに付属のAUAPプライマー
2回目のPCR:GTC AGC TAA GTG GCC TTT G(配列番号31)及びキットに付属のAUAPプライマー
3回目のPCR:CAC TGG CGC TGC TGC CGT C(配列番号32)及びキットに付属のAUAPプライマー
PCR産物をpGEM-T Easy vectorに連結し、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体がもつインサートの塩基配列を解析し、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を含んでいると予測される遺伝子断片情報を取得した。他の生物の相同性より全長をクローニングしていないと考え、更に5’RACEを行なった。
cDNA一次鎖調製のためのRTに用いたプライマーは以下の通りである。
TGA TCT TCT GCT GTT CAT GTT(配列番号33)
製造者の指示に従って作製したcDNAライブラリーより、以下のプライマーを用いて3回のPCRを行なった。
1回目のPCR:CTC CAC GTA CAA GTA GTT CTC(配列番号34)及びキットに付属のAUAPプライマー
2回目のPCR:CAG CGA ATC ACC GTT GTA CGG(配列番号35)及びキットに付属のAUAPプライマー
3回目のPCR:AGC CAG CGG TGT CGC CTC(配列番号36)及びキットに付属のAUAPプライマー
PCR産物をpGEM-T Easy vectorに連結し、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体がもつインサートの塩基配列を解析し、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を含んでいると予測される遺伝子断片情報を取得した。
プライマーF2:GGG TTT GTT GTC TAT CGG CTT AAG(配列番号37)
プライマーR2:AGC TGT CTT GGT CGT CAT ATC CAT(配列番号38)
このようにして増幅したPCR産物の塩基配列を常法に従って決定した。結果を配列番号3に示す。また、この塩基配列によりコードされると予測されるγ−グルタミルシステイン合成酵素のアミノ酸配列を配列番号4に示す。このようにして、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子ホモログを取得した。
上記のようにして判明したキャンディダ・ユティリス由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子及びグルタチオン合成酵素遺伝子ホモログをサッカロマイセス・セレビシエにおいて発現させその機能を調べた。各遺伝子ホモログのサッカロマイセス・セレビシエにおける発現ベクターを作成し、グルタチオン合成酵素活性を弱化させたサッカロマイセス・セレビシエ又はγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を弱化させたサッカロマイセス・セレビシエに導入し、各々のホモログの機能を調べた。
<2>γ−グルタミルシステイン合成酵素活性が低下したサッカロマイセス・セレビシエの取得
(1)GSH1遺伝子置換カセットの作製
まず、前記Nα1株の染色体DNAを鋳型として、サッカロマイセス・セレビシエのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子(GSH1)(配列番号39)の中流領域から末端領域までをPCR法により増幅した。PCR反応は、KOD dash(TOYOBO社)を使用して、製造者の指示に従い、次の条件で行った。下記に示す組成の反応液を用いて、94℃1分の後、94℃30秒、60℃40秒、74℃1分を30サイクル繰り返すことにより行った。プライマーはGF1(gtg gac gac cgt act ccg aag)(配列番号41) 及びGR1(acc caa atc gat aat gtc aac)(配列番号42) を用いた。
Easy(Promega社)に連結し、GSH1dash/pGEMを得た。次に、部位特異的変異法により、GSH1dash/pGEMに含まれるγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子(配列番号39)の、同遺伝子がコードするγ−グルタミルシステイン合成酵素(配列番号40)の372番目、373番目に対応するアミノ酸セリン及びリジンに対応するコドンを終止コドンに置換した。この操作は、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE社)を用い、製造者のプロトコルに従って行った。プライマーはQCF1(ctt ttc ttg ggt ggg tag taa ttt ttc aat agg act)(配列番号43)、QCR1(agt cct att gaa aaa tta cta ccc acc caa
gaa aag)(配列番号44)を用いた。このようにしてプラスミドGSH1Mdash/pGEMを作製した。
(2)GSH1遺伝子置換カセットのサッカロマイセス・セレビシエへの導入
上記のようにして作製した遺伝子置換カセットを用いて、Nα1株のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の遺伝子置換を行った。Nα1株を前培養した後に、培養物を50mlのYPD培地に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を1Mソルビトールに懸濁し、遺伝子置換カセットを混和して、エレクトロポレーションにより形質転換を行った。形質転換株を1mMのグルタチオンを含むSDプレートで培養し、生育する株を選択した。遺伝子置換カセットが染色体上の目的の位置に組み込まれたことをPCRによって確認し、得られた株をNα4中間体とした。次に、変異型γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子のみを染色体上に残す為、以下の操作を行った。Nα4中間体を1mMのグルタチオンを添加したYPD培地で培養し、培養産物を1mMのグルタチオンを含むSDFOAプレートに蒔いた。プレート上に生育してきた株のグルタチオン合成酵素遺伝子の配列を決定し、目的の部位の配列が正しく置換されていることを確認し、Nα4株を得た(図2)。
で培養し、対数増殖期の細胞内のγ−グルタミルシステイン及びグルタチオン含有量を測定したが、γ−グルタミルシステインは検出されず、グルタチオンは0.01%であった。また、Nα4株は2mMのメチルグリオキサールに感受性を示したことから、YH1株と同様にγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子が置換されていることが確認された。
<3>キャンディダ・ユティリス由来のグルタチオン合成酵素ホモログの発現ベクターの構築
キャンディダ・ユティリスの染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子ホモログ(CGSH2)のORF領域を増幅した。 PCRは、Pyrobest (宝酒造)を用いて製造者の指示に従って次の条件で行った。98℃2分→98℃20秒、55℃30秒、72℃2分を40サイクル。N末端側には制限酵素KpnI切断部位を付加したプライマーCGSH2F1(AGA TTG GGT ACC ATG AGT ATT CCT CAG TTA TCT G)(配列番号45)を、C末端側にはXbaI切断部位CGSH2R1(ATC CGG TCT AGA CTA TTG GAG AGC AAC ACC ATC)(配列番号46) をそれぞれ用いて以下の条件でPCRを行い、増幅産物をQIAquick PCR purification Kitを用いて精製した。精製したPCR産物及びpAUR123ベクター(宝酒造)を、各々制限酵素KpnI、XbaIで切断した後連結し、大腸菌JM109コンピテントセルを形質転換した。このようにしてCGSH2/pAUR123ベクターを作製した。次に、CGSH2/pAUR123ベクター及びpYES2ベクターを制限酵素BamHIで切断した。CGSH2/pAUR123ベクターからはCGSH2のORFとpAUR123ベクター由来のプロモーターを含む領域を回収し、切断末端を脱リン酸化したpYES2ベクターと連結し、大腸菌JM109コンピテントセルを形質転換した。このようにして、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素ホモログの発現ベクターCGSH2/pYES2ベクタベクターを作製した(図3)。
<4>キャンディダ・ユティリス由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素ホモログの発現ベクターの構築
キャンディダ・ユティリスの染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子ホモログ(CGSH1)のORF領域を増幅した。 PCRは、Pyrobest (宝酒造)を用いて製造者の指示に従って次の条件で行った。98℃2分→98℃20秒、55℃30秒、72℃2分を40サイクル。N末端側には制限酵素KpnI切断部位を付加したプライマーCGSH1F1(GAG TAC GGT ACC ATG GGG CTG CTA TCA TTA GGG AC)(配列番号47)を、C末端側にはXbaI切断部位CGSH1R1(CCC TTA TCT AGA TTA AGC CTT TGG GTT GTT TAT C)(配列番号48) をそれぞれ用いて以下の条件でPCRを行い、増幅産物をQIAquick PCR purification Kitを用いて精製した。精製したPCR産物及びpAUR123ベクター(宝酒造)を、各々制限酵素KpnI、XbaIで切断した後連結し、大腸菌JM109コンピテントセルを形質転換した。このようにしてCGSH1/pAUR123ベクターを作製した。次に、CGSH1/pAUR123ベクター及びpYES2ベクターを制限酵素BamHIで切断した。CGSH1/pAUR123ベクターからはCGSH1のORFとpAUR123ベクター由来のプロモーターを含む領域を回収し、切断末端を脱リン酸化したpYES2ベクターと連結し、大腸菌JM109コンピテントセルを形質転換した。このようにして、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素ホモログの発現ベクターCGSH1/pYES2ベクターを作製した(図4)
<3>相補実験
次に、CGSH1/pYES2ベクター又はCGSH2/pYES2ベクターをNα3株及びNα4株に導入した形質転換体を取得した。Nα3株又はNα4株を前培養した後に、培養物を50mlの液体培地(1mMのグルタチオンを含有するYPD培地)に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を1Mソルビトールに懸濁し、CGSH1/pYES2ベクターを混和して、エレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換株を1mMのグルタチオンを含むSDプレートで培養し、生育する株を選択した。Nα3株及びNα4株はウラシル要求性を示し、CGSH1/pYES2ベクター又はCGSH2/pYES2ベクターを含有する場合のみSD培地で生育することができる。得られた形質転換体がCGSH1/pYES2ベクター又はCGSH2/pYES2ベクターを含有することを常法により確認し
た。
[参考例1]キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットの作製
キャンディダ・ユティリスATCC15239より回収した染色体DNAを鋳型として、配列番号49及び50のプライマーを用いてPCRを行った。PCRは、Pyrobest(宝酒造(株))を用いて、製造者の指示にしたがい、次の条件で行った。98℃2分 → 98℃20秒、55℃30秒、72℃2分を40サイクル。
〔1度目の変異導入(HindIII切断部位の導入)〕
GAA GCC TCA GCA TGA AGC TTG TGG TAA TAA CAT TTA C(配列番号51)
G TAA ATG TTA TTA CCA CAA GCT TCA TGC TGA GGC TTC(配列番号52)
〔2度目の変異導入(KpnI切断部位の導入)〕
CGA CCA ATC GAC TGG TAC CGT TAT CAA AAA CTC TG(配列番号53)
CA GAG TTT TTG ATA ACG GTA CCA GTC GAT TGG TCG(配列番号54)
一方、キャンディダ・ユティリスATCC15239より回収した染色体DNAを鋳型として、以下のプライマーを用いてPCRを行い、URA3遺伝子を含む断片を増幅した。PCRは、KOD dash(TOYOBO社 コードLDP-101)を使用して、製造者の指示に従い、次の条件で行った。94℃ 2分 → 94℃ 1分、54℃ 30秒、74℃40秒を30サイクル。
CCC AAG CTT CTC TAC TTG CTT CTG CTC AAC(配列番号55)
GCA GGT ACC AAC TTC CGA AAA CAG TAA TGA AC(配列番号56)
増幅産物をpGEMT-Easyベクターに導入し、CURA3/pGEMT-Easyベクターを得た。
[参考例2]ウラシル要求性キャンディダ・ユティリス ATCC15239ura-株の取得
常法(Luisらの手法、FEMS Microbiology Letters 165(1998)335-340)に従い、ATCC15239由来のウラシル要求性株ATCC15239ura-株を取得した。ATCC15239ura-株は、後述するようにURA3遺伝子によって相補されたことから、ura3変異株であると推定される。
[参考例3]キャンディダ・ユティリス由来のγ−グルタミルシステイン産生酵母(ATCC15239Δgsh2株)の取得
まず、ATCC15239ura-株をYPD試験管培地で一晩30℃で培養した。培養産物をYPDフラスコ培地(坂口フラスコ500ml容、50ml張り込み)に植菌し、30℃で振とう培養した。対数増殖期に集菌し、4℃に冷やした1Mソルビトール溶液で、菌体を3回洗浄した。洗浄菌体を冷やした1Mソルビトール溶液に懸濁した。懸濁液に、50μl(2μg)の上記グルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットを加え、0.2cmキュベット中でよく混合し、エレクトロポレーション(Gene Pulser system(BioRad社)を使用、インピーダンス200Ω、キャパシタンス125μF、設定電圧1.5kVに設定)を行なった。キュベットに、1mlの冷やした1Mソルビトールを注ぎ、キュベットを10分間氷上で冷却した。菌体懸濁液をSDプレートにスプレッドし、30℃で静地培養した。
[参考例4]ATCC15239Δgsh2株のグルタチオン合成酵素活性の測定
ATCC15239Δgsh2株をYPD培地に植菌し、30℃で振とう培養した。培養物をSD培地(2L容フィン付三角フラスコに400ml張り込み)に2%植菌し、30℃で振とう培養した。対数増殖期に菌体を集菌し、4℃に冷やした1Mソルビトールで菌体を2回洗浄した。洗浄菌体を0.1
mMのPMSF(フェニルメタンスルフォニルフルオリド)を含む10mM Tris-HClバッファー(pH7.5)0.5mlに懸濁した。懸濁液にガラスビーズ(GLASS BEADS 425-600microns Acid-washed (SIGMA社、コードG-8772))を加え、BEAD-BEATER(和研薬株式会社)を用いて細胞を破砕した。細胞の破砕は顕微鏡で確認した。その後、1mlの前記バッファーを加え、遠心操作により、ガラスビーズ及び細胞デブリを取り除いた。このようにして、細胞粗抽出液を得た。細胞粗抽出液をULTRAFREE-15 Biomax10(MILLIPORE社、Cat.No UFV2BGC40)を用いて精製し、酵素液を得た。酵素液の蛋白量は、Bradford法により定量した。発色はプロテインアッセイCBB溶液(ナカライ社、Code29449-15)を用いて行い、595nmの吸収を測定した。標準曲線はAlbumin standard(PIERCE社、No.23210)を用いて作成した。
〔反応液〕
100mM γ−グルタミルシステイン 100μl
100mM MgCl2 100μl
50mM ATP 100μl
100mM Gly 100μl
1M Tris-HCl(pH8.0) 85.5μl
160mM PEP 12.5μl
1mg/ml PK 2μl
酵素液(1〜10mg蛋白)
精製水
合計 2ml
PEP:ホスホエノールピルビン酸(SIGMA社、Code P-7127)
PK :ピルビン酸キナーゼ(SIGMA社、Code P-1903)
上記組成の反応液を、酵素量1〜10mg蛋白の範囲で30℃で0〜2時間反応させた。メタクリル酸を1/5当量加えて反応を停止させた後、反応液のpHを8.0に調整し、生成したGSH量を定量した。この時の酵素活性は検出限界以下であり、検出されなかった。次に、ATCC15239Δgsh2株の親株であるATCC15239株のグルタチオン合成酵素活性を同様にして測定した。その結果、ATCC15239株のグルタチオン合成酵素活性は0.383μmol-GSH/mg蛋白/時間であった。このように、本願発明に係る遺伝子を用いることにより、グルタチオン合成酵素活性が0.003μmolGSH/mgタンパク質/時間以下になるように改変されたキャンディダ・ユティリスを得ることができた。
Claims (9)
- 下記(A)又は(B)に示すタンパク質をコードするDNA。
(A) 配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B) 配列番号2に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質。 - 下記(a)又は(b)に示すDNAである請求項1に記載のDNA。
(a) 配列番号1の塩基番号58〜1485の塩基配列を含むDNA。
(b) 配列番号1の塩基番号58〜1485の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 請求項1又は2記載のDNAを用いてグルタチオン合成酵素活性が0.003μmolGSH/mgタンパク質/時間以下になるように改変されたキャンディダ・ユティリス。
- 請求項1又は2記載のDNAを用いてグルタチオン合成酵素活性が上昇するように改変されたキャンディダ・ユティリス。
- 下記(c)又は(d)に示すDNAを用いてグルタチオン合成酵素活性が0.003μmolGSH/mgタンパク質/時間以下になるように改変されたキャンディダ・ユティリス。
(c)配列番号1の塩基番号58〜981の塩基配列を含むDNA、又は
(d)配列番号1の塩基番号58〜981の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。 - 配列番号3記載のDNAを用いてγ−グルタミルシステイン合成酵素活性が上昇するように改変された請求項3〜5のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリス。
- 請求項3〜6のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物、若しくはグルタチオン及び/又はγ−グルタミルシステインを含む前記培養物の分画物、又は熱処理或は酵素処理によりガンマ位のグルタミン酸が遊離したこれらの培養物もしくは分画物を含む飲食品。
- 請求項3〜6のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物を用いて製造された酵母エキス。
- 請求項3〜6のいずれか一項に記載のキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養し、得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することを特徴とする、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有食品の製造法。
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