KR20050027009A - 캔디다 유틸리스 기원의 글루타티온 신테타제 암호화 유전자 - Google Patents

캔디다 유틸리스 기원의 글루타티온 신테타제 암호화 유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 기원의 글루타티온 신테타제 암호화 유전자 및 적합한 조건하에 글루타티온 신테타제 암호화 유전자가 변형된 캔디다 유틸리스를 배양하고 수득한 배양물 또는 이의 분획물 또는 열처리된 배양물 또는 이의 분획물을 식품 또는 음료 원료와 혼합하여 식품 또는 음료를 가공함에 의해 제조되는, γ-글루타밀시스테인, 시스테인 또는 시스테닐글라이신 함유 식품에 관한 것이다.

Description

캔디다 유틸리스 기원의 글루타티온 신테타제 암호화 유전자{Gene encoding glutathione synthetase from Candida utilis}
본 발명은 캔디다 유틸리스 기원의 글루타티온 신테타제 암호화 유전자 및 글루타티온의 세포내 함량이 당해 유전자에 의해 증가되거나 감소된 캔디다 유틸리스, 및 당해 캔디다 유틸리스를 사용한 식품에 관한 것이다. 이로부터 제조된 γ-글루타밀시스테인 및 시스테인 또는 이로부터 제조된 글루타티온 및 시스테닐글라이신은 식품 제조에 유용하다.
시스테인은 식품 향 및 맛 등을 개선시킬 목적으로 사용된다. 단백질 분해 방법 및 반합성 방법등은 시스테인을 제조하기 위한 방법으로서 공지되어 있고 현재, 단백질 분해 방법 및 반합성 방법이 주로 사용되고 있다. 식품의 향 및 맛을 개선시키는데 시스테인을 사용하기 위해, 시스테인의 함량이 높은 천연 식품 원료가 요구된다. 그러나, 당해 종류의 천연 식품 원료는 지금까지 거의 공지되지 않았다. 한편, 시스테인의 함량이 높은 식품 원료가, γ-글루타밀시스테인을 함유하는 효모 추출물을 가열하거나 효소로 처리함으로써 수득될 수 있음이 보고되었다[문헌참조: WO00/30474].
시스테닐글라이신은, 시스테인 및 글라이신이 서로가 펩타이드 결합에 의해 결합되어 있는 디펩타이드이다. 고기 향 증진용 원료가 시스테닐글라이신과 당을 함께 가열함으로써 수득될 수 있다는 것이 보고되었다. 시스테닐글라이신이 펩타이드 합성 방법에 의해 제조되는 것으로 공지되어 있지만 이것이 천연 원료로부터 제조된다는 것은 지금까지 거의 공지되지 않았다. 한편, 시스테닐글라이신의 함량이 높은 식품 원료가 글루타티온을 함유하는 효모 추출물의 열 처리 또는 효소 처리에 의해 수득될 수 있음이 보고되었다[문헌참조: JP2001-321117A].
사카로마이세스 세레비지애에서, γ-글루타밀시스테인은 기질로서 시스테인 및 글루탐산을 사용하여 γ-글루타밀시스테인 신테타제와 반응시킴으로써 합성된다. 추가로, 글루타티온은 기질로서 γ-글루타밀시스테인 및 글라이신을 사용하여 글루타티온 신테타제와 반응시켜 합성된다. γ-글루타밀시스테인의 함량이 높은 효모는 문헌[참조: WO00/30474; Otake et al., Agri. Biol. Chem., 54(12):3145-3150(1990); Chris et al., Molecular Biology of the Cell., 8, 1699-1707; Inoue et al., Biochimica et Biophysics Acta, 1395, 315-320(1998)]등에 보고되었다. 그러나, 모든 당해 보고는 사카로마이세스 세레비지애를 사용하는 연구에 관한 것이고 캔디다 유틸리스에 관한 연구는 보고되지 않았다.
캔디다 유틸리스는 글루타티온, 몇몇 종류의 아미노산 및 효소를 함유하는 생물학적으로 중요한 물질의 제조에 사용될 수 있는 산업적으로 중요한 미생물이다[문헌참조: Journal of Bacteriology, 1995, vol. 177, No. 24, p7171-7177]. 캔디다 유틸리스는 사카로마이세스 세레비지애와 비교하여 펜토스 포스페이트 사이클로부터의 에너지 대부분을 피리딘 염기를 제조하는데 소비한다는 특징을 갖고 보다 약한 이화 생성물 억제를 보여준다[문헌참조: Biotechnology, 3, 30(1983)]. 추가로, 사카로마이세스 세레비지애가 보편적으로 연구 목적을 위해 사용되고 있기 때문에, 캔디다 유틸리스에 대해서는 별로 밝혀지지 않았다. 그러한 상황하에서, 캔디다 유틸리스가 글루타티온을 합성하는 방법에 대해 보고되지 않았고 단지, 아연 내성 균주로서 수득된 특정 캔디다 유틸리스 균주가 효모의 정상적인 배양 온도보다 5℃이상 낮은 온도에서 대량의 글루타티온을 생산하는 것으로 보고되었다.
따라서, 글루타티온 신테타제 암호화 유전자는 캔디다 유틸리스에서 보고되지 않았고 글루타티온의 세포내 함량을 조절함에 의해 산업적으로 유용한 물질을 제조하는 방법이 보고되지 않았다.
본 발명의 목적은 캔디다 유틸리스 기원의 글루타티온 신테타제를 암호화하는 유전자, 글루타티온 및/또는 γ-글루타밀시스테인의 함량이 높은 캔디다 유틸리스 및 이의 추출물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 글루타티온, γ-글루타밀시스테인, 시스테인 또는 시스테닐글라이신을 함유하는 식품 및 이를 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
사카라이드 유니트당 캔디다 유틸리스의 성장은 사카로마이세스 세레비지애의 성장보다 우수한 것으로 보고되었다[문헌참조: Biotechnology, vo.3, p30(1983)]. 추가로, 절대 혐기 조건하에서 부산물로서 에탄올을 생산하지 않기 때문에(문헌참조: Kondo et al. J. Bacteriology, Dec., 1995, pp. 7171-7177), 배양동안에 에탄올 부산물에 신결쓸 필요가 적다. 따라서, 본 발명의 발명자는 γ-글루타밀시스테인의 함량이 높은 캔디다 유틸리스를 사용함에 의해 제조된 효모 추출물이 사카로마이세스 세레비지애를 사용하여 제조되는 효모 추출물보다 저렴함에 따라서 산업용 제조를 위해 바람직할 것으로 고려하고 있다.
당해 개념을 기준으로, 본 발명의 발명자는 상기 언급된 목적을 해결하기 위해 주도 면밀하게 연구하였다. 결과로서, 본 발명자들은, 기타 유기체 기원의 효소와의 상동성을 기준으로, 캔디다 유틸리스 기원의 글루타티온 신테타제 암호화 유전자 및 γ-글루타밀시스테인 신테타제 암호화 유전자를 클로닝하는데 성공하였다. 본 발명자들은 당해 유전자가 변형된 캔디다 유틸리스가 γ-글루타밀시스테인의 함량이 높다는 것을 밝혔고 따라서 본 발명을 성취하였다.
본 발명은 근본적으로 하기의 목적을 제공한다.
(1) 하기의 (A) 또는 (B)에서 정의된 단백질을 암호화하는 DNA:
(A) 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및
(B) 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 첨가된 서열 2의 아미노산 서열을 갖고 글루타티온 신테타제 활성을 갖는 단백질.
(2) 상기 (1)에 있어서, 하기의 (a) 또는 (b)에서 정의된 DNA:
(a) 서열 1의 58번 내지 1485번의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 및
(b) 서열 1의 58번 내지 1485번의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는 당해 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄중 조건(stringent condition)하에서 하이브리드화할 수 있고 글루타티온 신테타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(3) 상기 (1) 또는 (2)에서 정의된 바와 같은 DNA를 수단으로 글루타티온 신테타제 활성이 시간당 0.003μmol GSH/mg 단백질 이하이도록 변형된 캔디다 유틸리스.
(4) 상기 (1) 또는 (2)에서 정의된 바와 같은 DNA에 의해 글루타티온 신테타제 활성이 증가되도록 변형된 캔디다 유틸리스.
(5) 하기의 (c) 또는 (d)에서 정의된 바와 같은 DNA에 의해 글루타티온 신테타제 활성이 시간당 0.003μmol GSH/mg 단백질 이하이도록 변형된 캔디다 유틸리스:
(c) 서열 1의 58번 내지 981번의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 및
(d) 서열 1의 58번 내지 981번의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는 당해 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄중 조건하에 하이브리드화할 수 있는 DNA.
(6) 상기 (3) 내지 (5) 중 어느 한 항목에 있어서, 서열 3의 DNA에 의해 γ-글루타밀시스테인 신테타제 활성이 증진되도록 변형된 캔디다 유틸리스.
(7) 상기 (3) 내지 (6) 중 어느 한 항목에 따른 캔디다 유틸리스를 적합한 조건하에서 배양하여 수득 가능한 배양물, 글루타티온 및/또는 γ-글루타밀시스테인을 함유하는 당해 배양물의 분획물 또는 글루타티온 및/또는 γ-글루타밀시스테인의 감마 위치에서의 글루탐산이 열 처리 또는 효소 처리에 의해 방출되는 배양물 또는 분획물을 포함하는 식품 또는 음료.
(8) 상기 (3) 내지 (6) 중 어느 한 항목에 따른 캔디다 유틸리스를 적합한 조건하에서 배양함에 의해 수득 가능한 배양물을 사용하여 제조되는 효모 추출물.
(9) 상기 (3) 내지 (6)중 어느 한 항목에 따른 캔디다 유틸리스를 적합한 조건하에서 배양하고 수득된 배양물 또는 이의 분획물, 또는 열처리시킨 이의 배양물 또는 분획물을 식품 또는 음료 원료와 함께 혼합시켜 식품 또는 음료로 가공함을 포함하는, γ-글루타밀시스테인 또는 시스테인을 함유하는 식품의 제조 방법.
이후부터, 본 발명은 상세하게 설명될 것이다.
<1> 캔디다 유틸리스의 글루타티온 신테타제 유전자
본 발명의 DNA는 하기의 (A) 또는 (B)에 정의된 단백질을 암호화하는 DNA이다:
(A) 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및
(B) 하나 이상의 아미노산이 치환되거나 결실되거나 삽입되거나 첨가된 서열 2의 아미노산 서열을 갖고 글루타티온 신테타제 활성을 갖는 단백질.
용어 "글루타티온 신테타제 활성"이란 γ-글루타밀시스테인 및 글라이신으로부터 글루타티온의 생산 반응을 촉매하는 활성을 언급한다.
본 발명의 DNA에 의해 암호화된 글루타티온 신테타제는, 상기 언급된 효소 활성이 손상되지 않는 이상, 서열 2의 아미노산 서열의 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산이 치환되거나 결실되거나 삽입되거나 첨가되거나 역전될 수 있다. 본원에서 언급된 "여러개"의 아미노산의 수는 단백질의 3차원 구조에서 아미노산 잔기의 위치 또는 유형에 따라 상이하지만 특정적으로 2 내지 25개, 바람직하게는 2 내지 12개, 보다 바람직하게는 2 내지 7개일 수 있다.
예를 들어, (A)에 나타낸 단백질 암호화 DNA는 서열 목록의 서열 1의 서열에서 58번 내지 1485번의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA(CGSH2 DNA)로서 언급될 수 있다. 추가로, 상기 언급된 글루타티온 신테타제와 실질적으로 동일한 단백질 암호화 DNA는 예를 들어, 부위 지시된 돌연변이 유발에 의해 CGSH2 DNA가 특정 부위에서 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역전을 포함하도록 변형시켜 수득될 수 있다. 추가로, 상기된 바와 같은 당해 변형된 DNA는 또한 공지된 돌연변이 유발 처리에 의해 수득할 수 있다. 돌연변이 유발 처리의 예는 CGSH2 DNA를 시험관내에서 하이드록실아민으로 처리하는 방법 등 및 CGSH2 DNA를 함유하는 미생물, 예를 들어, 에스케리치아 속에 속하는 세균을 자외선 조사 또는 통상적인 돌연변이 유발에 사용되는 돌연변이 유발제, 예를 들어, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NG) 또는 에틸 메탄 설포네이트(EMS)로 처리하는 방법을 포함한다.
추가로, 상기 언급된 아노노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 참가 또는 역전등을 유발하는 돌연변이는 천연 발생 돌연변이 또는 변형, 예를 들어, 글루타티온 신테타제를 함유하는 캔디다 유틸리스 균주들중의 차이로 인해 기인할 수 있는 돌연변이 또는 변형을 포함한다.
글루타티온 신테타제와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 상기된 바와 같은 당해 돌연변이를 갖는 DNA를 사카로마이세스 세레비지애 등의 적합한 세포중에서 발현하고 세포내 글루타티온 신테타제 활성을 조사함에 의해 수득될 수 있다.
추가로, 엄중 조건하에서 CGSH2 DNA의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부를 갖는 프로브와 하이브리드화 할 수 있고 글루타티온 신테타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 또는 CGSH2 DNA의 뉴클레오타이드 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖고 글루타티온 신테타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA는 본 발명의 DNA에 포함된다. 본원에서 언급된 "엄중 조건"은 소위 특정 하이브리드가 형성되고 비특정 하이브리드가 형성되지 않는 조건이다. 임의의 수치를 사용하여 이들 조건을 명백하게 표현하기란 어렵다. 그러나, 예를 들어, 엄중 조건은 고도의 유사성을 갖는 DNA, 예를 들어, 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA가 서로 하이브리드화하지만 당해 수치보다 낮은 상동성을 갖는 DNA는 서로 하이브리드화하지 못하는 조건을 포함한다. 보다 특이적으로, 엄중 조건은 써던 하이브리드화에서 통상적인 세척 조건에 상응하는 염 농도, 즉, 60℃에서 1 x SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1 x SSC, 0.1% SDS에서 서로가 하이브리드화하는 조건을 포함한다.
CGSH2 DNA의 뉴클레오타이드 서열의 일부는 또한 프로브로서 사용될 수 있다. 당해 프로브는 프라이머로서 CGSH2 DNA의 뉴클레오타이드 서열 및 주형으로서 CGSH2 DNA의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA 단편을 기초로 제조된 올리고뉴클레오타이드를 사용한 PCR에 의해 제조될 수 있다. 길이가 약 300 bp인 DNA 단편이 프로브로서 사용되는 경우, 하이브리드화에서 세척 조건은 예를 들어, 50℃에서 2 x SSC, 0.1% SDS일 수 있다.
상기 언급된 조건하에서 하이브리드화하는 DNA는 종료 코돈이 생성되거나 돌연변이로 인해 활성이 결핍된 DNA를 포함한다. 그러나, 당해 DNA는 발현된 생성물의 효소 활성을 조사하여 제거될 수 있다.
후반에 기술되는 실시예에서 보여지는 바와 같이, 글루타티온 신테타제가 약화된 사카로마이세스 세레비지애로 CGHS2 DNA가 도입되는 경우 글루타티온 합성이 가속화되기 때문에 CGSH2 DNA가 글루타티온 신테타제를 암호화하는 것으로 확인되었다.
데이타베이스에서 서열 2의 아미노산 서열의 상동성 연구 결과로서, 사카로마이세스 세레비지애의 아미노산 서열과 48%의 상동성을 나타내었다.
<2> 본 발명의 캔디다 유틸리스
본 발명의 캔디다 유틸리스는, 글루타티온 신테타제 활성이 증가되거나 감소되도록 본 발명의 전장 DNA 또는 부분 단편의 DNA에 의해 변형된 균주이고 바람직하게는, γ-글루타밀 신테타제 활성이 증가되도록 서열 3의 DNA에 의해 추가로 변형된 균주이다. 야생형 균주와 비교하여 글루타티온 신테타제 활성이 감소되도록 캔디다 유틸리스를 변형시키는데 사용되는 DNA는 서열 1의 서열에서 58번 내지 981번의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 서열 1의 서열에서 58번 내지 981번의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 뉴클레오타이드 서열로부터 제조된 프로브와 엄중 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 DNA일 수 있다.
글루타티온 신테타제 활성이 감소되도록 변형된 본 발명의 캔디다 유틸리스는 바람직하게, 글루타티온 신테타제 활성이 모균주와 비교하여 감소된, 예를 들어, 바람직하게, 글루타티온 신테타제 활성이 시간당 0.003 μmol GSH/mg 단백질 이하, 보다 바람직하게는 시간당 0.001μmol GSH/mg 단백질 이하인 캔디다 유틸리스이다(여기서, "GSH"는 글루타티온을 나타낸다). 추가로, 글루타티온 신테타제 활성은 검출 가능한 한계 이하인 것이 바람직하다.
글루타티온 신테타제 활성이 증가되도록 변형된 본 발명의 캔디다 유틸리스는 바람직하게, 모균주와 비교하여 글루타티온 신테타제 활성이 증가되고 예를 들어, 바람직하게, 글루타티온 신테타제 활성이 시간당 0.450μmol GSH/mg 단백질 이하, 보다 바람직하게는 시간당 0.600μmol GSH/mg 단백질 이하인 캔디다 유틸리스이다. 글루타티온 신테타제 활성은 구시마(Gushima) 등[문헌참조: T. Gushima et al., J. Appl. Biochem., 5, 210(1983)]의 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 캔디다 유틸리스는 적합한 균주, 예를 들어, 캔디다 유틸리스의 야생형 균주를 유전자 재조합 기술[예를 들어, 하기의 문헌에 기재된 기술을 사용할 수 있다: FEMS Microbiology Letters, 165, 335-340(1998); J. Bacteriology, Dec. 1995, pp. 7171-7177; Curr. Genet. 10(8): 573-578(1986); WO98/14600]로 변형시켜 세포내 글루타티온 신테타제 활성이 증가되거나 감소되도록 함에 의해 수득할 수 있다. 글루타티온 신테타제 활성의 감소는 글루타티온 신테타제 활성의 상실을 포함한다.
추가로, 유전자 재조합 기술을 사용함에 의해 글루타티온 신테타제 활성을 감소시키는 방법으로서, 글루타티온 신테타제를 암호화하는 유전자를 변형시켜 글루타티온 신테타제 활성을 감소시키는 방법을 언급할 수 있다. 캔디다 유틸리스 ATCC15239의 글루타티온 신테타제를 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열 2로서 나타낸다. 캔디다 속의 효모 기원의 임의의 글루타티온 신테타제 유전자는 이전에 공지되지 않았다. 본 발명의 발명자는 고도로 보존된 영역에 대해 다양한 유기체의 글루타티온 신테타제의 아미노산 서열을 조사하였고 서열 5 내지 서열 11의 영역을 밝혔다. 이어서, 본 발명자들은 상기 언급된 영역중에서 서열 6, 서열 10 및 서열 11의 아미노산 서열에 상응하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 캔디다 유틸리스의 염색체 DNA로부터 글루타티온 신테타제를 암호화할 것으로 예상되는 유전자 단편을 성공적으로 증폭시켰다. 이들은 당해 단편을 사용하여 5'-RACE 및 3'-RACE를 수행하여 캔디다 유틸리스의 글루타티온 신테타제를 암호화하는 전장 유전자를 분리하는데 성공하였다. 전장 유전자을 수득하기 위한 프라이머로서 서열 12 내지 19의 프라이머를 언급할 수 있다. 추가로, 캔디다 유틸리스의 균주는 특별히 제한되지는 않지만, 예를 들어, ATCC 15239 균주를 언급할 수 있다. 당해 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(주소: 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, United States of America)으로부터 구입할 수 있다.
글루타티온 신테타제를 암호화하는 유전자를 변형시켜 글루타티온 신테타제 활성을 감소시키는 방법으로서, 예를 들어, 유량자의 발현 조절 서열을 변형시켜 글루타티온 신테타제의 발현량을 감소시키는 방법 또는 암호화 영역을 변형시켜 글루타티온 신테타제 활성을 갖는 단백질이 발현되지 않도록 하는 방법을 언급할 수 있다. 특히, 예를 들어, 염색체상의 유전자는 5'- 및 3'- 말단이 결실된 돌연변이 글루타티온 신테타제 유전자를 함유하여 염색체상에서 돌연변이 유전자와 야생형 유전자 사이에 재조합을 유발하는 재조합 DNA로 캔디다 유틸리스를 형질전환시켜 붕괴될 수 있다. 당해 방법에서, 영양요구성 균주와 같은 숙주의 특징에 따라 선택될 수 있는 마커 유전자를 재조합 DNA에 포함시켜 작동을 용이하게 할 수 있다. 추가로, 재조합 DNA를 제한 효소등으로 분해시켜 미리 선형화하는 경우, 재조합 DNA가 염색체로 도입된 균주가 효율적으로 수득된다.
추가로, 염색체상의 유전자는 또한 정상적인 기능을 갖는 글루타티온 신테타제를 생산하지 못하도록 글루타티온 신테타제 유전자의 일부를 결실시켜 변형시킨 돌연변이 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 캔디다 유틸리스에 도입하고 돌연변이 유전자와 염색체상의 정상 유전자 사이에 재조합을 유도함에 의해 붕괴될 수 있다.
재조합 DNA가 상기된 바와 같은 염색체로 도입된 균주에서는 도입된 DNA와 본래에 염색체상에 존재하는 글루타티온 신테타제 유전자 사이에 재조합을 유발시킴으로써 야생형 글루타티온 신테타제 유전자와 돌연변이 글루타티온 신테타제 유전자의 융합 유전자 2개가 염색체에 삽입되어 재조합 DNA의 다른 부분(벡터 부분 및 마커 유전자)을 샌드위치시킨다. 따라서, 야생형 글루타티온 신테타제 유전자는 당해 상태에서 여전히 작용한다.
이어서, 염색체 DNA 상에 돌연변이 글루타티온 신테타제 유전자 만이 잔류하도록 하기 위해, 한 복제물의 글루타티온 신테타제 유전자를, 2개의 글루타티온 신테타제 유전자를 재조합시켜 벡터 부분(마커 유전자 함유)과 함께 염색체 DNA로부터 제거한다. 당해 단계에서, 야생형 글루타티온 신테타제 유전자는 염색체 DNA상에 잔류하고 돌연변이 글루타티온 신테타제 유전자는 절단되거나 돌연변이 글루타티온 신테타제 유전자가 염색체 DNA에 잔류하고 야생형 글루타티온 신테타제 유전자는 절단된다. 마커 유전자는 둘중 하나의 경우에 제거되기 때문에, 제2 재조합의 발생은 마커 유전자에 상응하는 표현형을 기반으로 확인될 수 있다. 추가로, 표적 유전자 치환된 균주는 PCR에 의해 글루타티온 신테타제 유전자를 증폭시키고 이의 구조를 조사하여 선택될 수 있다.
유전자 붕괴에 사용되는 글루타티온 신테타제 유전자 또는 이의 단편으로서, 서열 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 뿐만 아니라, 엄중 조건하에 DNA와 하이브리드화할 수 있는 DNA 또는 서열 1의 뉴클레오타이드 서열과 90% 이상의 상동성, 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 DNA를 언급할 수 있다. 엄중 조건은 써던 하이브리드화에서 통상적인 세척 조건에 상응하는 염 농도, 즉, 60℃에서 1 x SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1 x SSC, 0.1% SDS에서 DNA가 서로 하이브리드화하는 조건이다.
사카로마이세스 세레비지애의 글루타티온 신테타제 유전자의 붕괴는 문헌[참조: WO00/30474]에 기재되어 있다. 재조합 DNA를 캔디다 유틸리스에 도입하기 위한 방법의 예는 전기천공 방법[문헌참조: Luis et al., FEMS Microbiology Letters, 165, 335-340 (1998)]을 포함한다.
글루타티온 신테타제 활성이 감소된 균주는 표현형으로서 메틸글리옥살에 대한 민감성을 사용하여 선택될 수 있다[문헌참조: Y. Ohtake et al., Agri. Biol. Chem., 54(12): 3145-3150(1990)]. 특정 양의 글루타티온을 합성하는 균주(글루타티온 신테타제 활성 및 γ-글루타밀시스테인 신테타제 활성을 갖는 균주)는 메틸글리옥살에 내성을 나타낸다. 추가로, 글루타티온 신테타제 활성의 감소는 또한 글루타티온을 함유하지 않는 배지에서의 성장을 조사하여 확인할 수 있다. 추가로, 글루타티온 신테타제 활성이 감소된 균주는 MNNG(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘) 농도 구배 플레이트를 사용함에 의해 수득할 수 있다[문헌참조: WO03/046154].
한편, 유전자 재조합 기술을 사용하여 글루타티온 신테타제 활성을 증진시키는 방법으로서, 글루타티온 신테타제 유전자를 변형시켜 당해 유전자에 의해 암호화된 단백질의 글루타티온 신테타제 활성을 증진시키는 방법 또는 글루타티온 신테타제 유전자를 변형시켜 유전자의 발현양을 증진시키는 방법을 언급할 수 있다. 예를 들어, 글루타티온 신테타제 활성은 서열 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 글루타티온 신테타제를 발현 형태로 캔디다 유틸리스에 도입하여 증진시킬 수 있다.
글루타티온 신테타제 유전자를 캔디다 유틸리스에 도입시키는 방법은 글루타티온 신테타제 유전자를 함유하는 재조합 DNA 및 캔디다 유틸리스 염색체상에 존재하는 DNA 서열로 캔디다 유틸리스를 형질전환시켜 재조합 DNA를 캔디다 유틸리스의 염색체에 도입하는 방법을 포함한다[문헌참조: Kondo, K. et al., J. Bacteriol., 1995, 177, p7171-7177]. 특히, DNA는 상기 언급된 유전자 치환과 유사한 방법으로 도입할 수 있다.
본 발명의 캔디다 유틸리스는 변형된 글루타티온 신테타제 활성 뿐만 아니라 증진된 γ-글루타밀시스테인 신테타제 활성을 가질 수 있다. γ-글루타밀시스테인 신테타제 활성은 γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자를 발현형태로 캔디다 유틸리스에 도입시켜 증진시킬 수 있다. γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자의 예는 서열 3에 나타낸 바와 같은 캔디다 유틸리스 기원의 유전자를 포함한다.
γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자를 캔디다 유틸리스에 도입하기 위한 방법의 예는, 예를 들어, 당해 유전자 및 캔디다 유틸리스 염색체상에 존재하는 DNA 서열로 캔디다 유틸리스를 형질전환시켜 재조합 DNA를 염색체로 도입시키는 방법을 포함한다[문헌참조: K. Kondo et al., J. Bacteriol., 177, 7171-7177(1995)]. 특히, 상기 언급된 유전자 치환과 유사한 방법으로 도입할 수 있다.
추가로, 표적 유전자는 또한 염색체 DNA상에 존재하는 자율적으로 복제가능한 서열(ARS)을 함유하는 플라스미드를 사용함에 의해 캔디다 유틸리스에 도입할 수 있다. 캔디다 유틸리스의 ARS 및 이를 사용한 형질전환은 문헌[참조: WO95/32289]에 기재되어 있다.
<3> 본 발명의 효모 추출물, 식품 및 음료 및 이를 제조하기 위한 방법
적합한 조건하에서 글루타티온 신테타제 활성이 상기된 바와 같이 변형된 효모를 배양함에 의해 수득한 배양물 또는 이의 분획물은 글루타티온 또는 γ-글루타밀시스테인을 함유한다. 배양물은 효모 세포를 함유하는 배양액, 배양물로부터 수득된 효모 세포, 붕괴된 세포 또는 세포 추출물(효모 추출물)일 수 있다. 글루타티온 및 γ-글루타밀시스테인을 함유하는 분획물은 붕괴된 세포 또는 효모 추출물로부터 수득할 수 있다.
γ-글루타밀시스테인은, γ-글루타밀시스테인 또는 이의 분획물을 함유하는 상기 언급된 배양물 또는 이의 분획물이 가열되는 경우 시스테인 및 피롤리돈카복실산으로 분해되어 시스테인이 방출될 수 있다. 특히, 시스테인은 배양물 또는 이의 분획물을 산성 내지 중성 조건(특히, 물의 존재하에 3 내지 300시간동안 50 내지 120℃에서 pH 1 내지 7)에 유지시킴으로써 제조될 수 있다.
추가로, 시스테인은 또한 γ-글루타밀시스테인 또는 이의 분획물을 함유하는 배양물을 pH 3 내지 9로 조정하고 γ-글루타밀 펩타이드- 분해 효소(γ-글루타밀트랜스퍼라제, γ-글루타밀사이클로트랜스퍼라제, 글루타미나제 등)를 첨가하고 이를 1 내지 300분동안 15 내지 70℃에서 γ-글루타밀시스테인에 작용하도록 함에 의해 제조될 수 있다.
글루타티온은, 상기 언급된 배양물 또는 이의 분획물이 가열되는 경우 시스테닐글라이신 및 피롤리돈카복실산으로 분해됨으로써 시스테닐글라이신이 방출될 수 있다. 특히, 시스테닐글라이신은 배양물 또는 이의 분획물을 산성 내지 중성 조건, 특히, 물의 존재하에 3 내지 300시간동안 50 내지 120℃에서 pH 1 내지 7에서 유지시킴으로써 제조될 수 있다.
추가로, 시스테닐글라이신은 또한 글루타티온을 함유하는 배양물 또는 이의 분획물을 pH 3 내지 9로 조정하고 γ-글루타밀 펩타이드 분해 효소(γ-글루타밀트랜스퍼라제, γ-글루타밀사이클로트랜스퍼라제, 글루타미나제등)를 첨가하고 1 내지 300분동안 15 내지 70℃에서 글루타티온에 작용하도록 함으로써 제조될 수 있다.
배양을 위해 사용되는 배지는 본 발명의 효모가 잘 성장하고 글루타티온 또는 γ-글루타밀시스테인이 효율적으로 제조되는 한 특별히 제한되지 않는다. 요구되는 경우, 필요한 영양물을 효모의 특성에 따라 배지에 첨가한다.
배양 조건, 효모 추출물 등의 제조는 통상적인 효모의 배양 또는 통상적인 효모 추출물의 제조와 동일한 방법으로 수행될 수 있다. 효모 추출물은 효모 세포를 고온수로 추출하거나 효모 세포를 분해시켜 제조할 수 있다. 추가로, 본 발명의 효모 추출물은, 시스테인 또는 시스테닐글라이신이 열처리 또는 효소적 처리에 의해 생성된 추출물일 수 있거나 식품 또는 음료의 원료와 함께 식품 또는 음료로 가공되는 경우 또는 가공되기 전에 열처리된 추출물일 수 있다.
특히, 효모 추출물의 열 처리는 다음과 같이 수행할 수 있다. 물은 효모 추출물 분말에 첨가하고 혼합물은 염산으로 pH 5로 조정하여 농도가 10%인 수용액을 제조한다. 이어서, 당해 용액을 180분 동안 98℃에서 가열한다.
γ-글루타밀시스테인, 시스테인, 글루타티온 또는 시스테닐글라이신을 함유하는 배양물 또는 이의 분획물을 식품 또는 음료 제조를 위해 사용할 수 있다. 식품 또는 음료의 예로서, 알콜 음료, 빵 및 발효 식품 조미료를 언급할 수 있다. 열처리에 의한 γ-글루타밀시스테인으로부터의 시스테인의 생산 및 열처리에 의한 글루타티온으로부터의 시스테닐글라이신의 생산은 식품 또는 음료의 제조동안에 또는 이후에 수행할 수 있다. 또한, 식품 또는 음료를 제조하기 전에, 효모 배양물 또는 이의 분획물을 열 처리할 수 있다.
상기 언급된 식품 또는 음료는 γ-글루타밀시스테인, 시스테인, 글루타티온 또는 시스테닐글라이신을 함유하는 배양물 또는 이의 분획물을 식품 또는 음료 원료 물질과 혼합하고 혼합물을 식품 또는 음료로 가공함에 의해 제조된다. 본 발명의 식품 또는 음료는, 상기 언급된 배양물 또는 분획물을 사용하는 것을 제외하고는 유사한 방법에 따라 통상적인 식품 또는 음료의 원료 물질과 동일한 원료 물질을 사용하여 제조될 수 있다. 당해 원료 물질의 예는 알콜 음료를 위한 쌀, 보리, 옥수수 전분등을 포함하고 발효 및 제빵을 위한 밀가루, 당, 염, 버터, 효모 및 발효 식품 조미료를 위한 콩, 밀등을 포함한다. 추가로, 효모 추출물 또는 이의 농축물, 또는 이의 무수 생성물은 발효 식품 조미료로서 사용될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기의 실시예를 참조로 보다 구체적으로 설명될 것이다.
<1> 캔디다 유틸리스의 글루타티온 신테타제를 암호화하는 것으로 추정되는 유전자의 획득
캔디다 유틸리스 ATCC15239 균주는 YPD 시험 튜브 배지에서 진탕시키면서 30℃에서 배양하고 염색체를, 효모용 Dr. GenTLE(Takara Shuzo Co., Code 9084)를 사용하여 세포로부터 제조하였다.
[YPD 배지의 조성]
글루코스 2%
펩톤 1%
효모 추출물 1%
(pH 5.0)
사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 래트의 글루타티온 신테타제의 아미노산 서열간의 상동성이 높은 하기의 서열은 선별하였다[문헌참조: Chris et al., Molecular Biology of the Cell., 8, 1699-1707(1997)].
(i) QEVAVVYYR(서열 5)
(ii) GSKKIQQ(서열 6)
(iii) VLKPOREGGGNNVLKPQREGGGNN(서열 7)
(iv) ISELGIYG(서열 8)
(v) GGVAAGF(서열 9)
축퇴성 프라이머를 이들 아미노산 서열을 기초로 디자인하고 축퇴성 PCR를 (i)와 (ii), (i)와 (iii), (i)와 (iv), (i)와 (v), (ii)와 (iii), (ii)와 (iv), (ii)와 (v), (iii)와 (iv), (iii)와 (v) 및 (iv)와 (v)의 각 쌍에 상응하는 축퇴성 프라이머를 사용하여 수행하였다. 각각의 PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 적용하고 예상된 크기에 대한 영역을 절단하여 DNA를 제조하였다. 추가로, 주형으로서 당해 제조된 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였지만 표적 단편을 수득할 수 없었다.
이어서, 하기의 아미노산 서열에 상응하는 프라이머를 캔디다 유틸리스에 사용되는 코돈의 빈도수를 참조로 디자인하였다.
(vi) GSKKIQQ(서열 6)
(vii) EGGGNN(서열 10)
(viii) PQREGGG(서열 11)
(vi)(GGG TCY AAG AAG ATY CAR CA, 서열 12)의 아미노산 서열에 상응하는 프라이머 및 (vii)(CCA CCA CCY TCT, CTY, TGT GG, 서열 13)의 아미노산 서열에 상응하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 94℃에서 2분동안의 반응에 이어서 94℃에서 1분동안, 55℃(각 사이클에서 0.5℃ 낮은 온도)에서 1분동안 및 74℃에서 40초의 22회 반응 사이클 및 94℃에서 1분동안, 50℃에서 1분동안 및 74℃에서 40초 동안 15회 반응 사이클의 조건하에 제조업자의 지침에 따라 KOD Dash(TOYOBO Co., Code LDP-101)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동(누시에브 3:1 아가로스 3%, 1 x TAE 용액)(Takara Shuzo Co., Code F5180A)에 적용하였다. 겔을 에티디움 브로마이드 용액을 사용하여 염색함에 이어서 100 내지 300bp에 상응하는 영역을 절단하고 Mag 추출기(TOYOBO Co., Code NPK-601)을 사용하여 겔로 부터 DNA를 절단하였다.
주형으로서 당해 DNA, (vi)(서열 12)의 영역에 상응하는 프라이머 및 (viii)(GTT GTT ACC ACC ACC YTC, 서열 14)의 영역에 상응하도록 디자인된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 경우, 3개 밴드가 100 내지 300bp에 상응하는 영역에서 검출되었다. 상기된 바와 동일한 조건하에서 PCR을 수행하였다. 이들 3개의 밴드를 각각 절단하고 각각의 DNA를 겔로 부터 추출하였다. 각각의 밴드의 DNA를 DNA 연결 키트 버젼 2(Takara Shuzo Co.)를 사용함에 의해 pGEM-T Easy 벡터(Promega Co.)에 연결하고 에스케리치아 콜리 JM109 컴피턴트 세포(Takara Shuzo Co., Code 9052)를 형질전환시키는데 사용하였다. 수득한 형질전환체중에서, 수득된 형질전환체중 하나가 캔디다 유틸리스의 글루타티온 신테타제를 암호화할 것으로 예상되는 유전자 단편을 함유할 것으로 예상되었다. 형질전환체중에 함유된 삽입체의 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 방식으로 결정하였다.
cDNA 말단(RACE)의 3' 신속 증폭은 cDNA 말단의 신속 증폭용 3'-RACE 시스템(Gibco BRL, Cat. No. 18373-027)을 사용하여 상기된 바와 같이 결정된 뉴클레오타이드 서열을 기초로 수행하였다. cDNA 주쇄는 Rneasy Mini 키트(QIAGEN Co., Cat. No. 74104)를 사용하여 캔디다 유틸리스 기원의 mRNA로부터 제조하고 PCR을 3회 수행하였다. 사용되는 프라이머는 하기에 나타내었다.
제1 PCR: AAG ATA TAC CCA TTG GAT GG(서열 15) 및 3' RACE 키트에 부착된 AUAP 프라이머,
제2 PCR: TCA GAT CTT GGT AAA GAG GC(서열 16) 및 3'RACE 키트에 부착된 AUAP 프라이머 및
제3 PCR: AGA CTG GCA TTT GAG TCT CC(서열 17) 및 3' RACE 키트에 부착된 AUAP 프라이머.
94℃에서 2분동안의 반응에 이어서 94℃에서 1분동안, 50℃에서 30초동안 및 74℃에서 40초동안의 30회 사이클의 조건하에 KOD Dash(TOYOBO Co., Code LDP-101)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
PCR 생성물을 pGEM-T Easy 벡터에 연결하고 에스케리치아 콜리를 형질전환시키는데 사용하였다. 수득된 형질전환체중에 함유된 삽입체의 뉴클레오타이드 서열을 분석하여 캔디다 유틸리스의 글루타티온 신테타제를 암호화할 것으로 예상되는 유전자 단편에 관한 정보를 수득하였다.
상기 결정된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 기초로, GeneRacer 키트(Invitrogen Co., Cat. No. L1502-01)를 사용하여 5' RACE를 수행하였지만 키트의 슈퍼슈크립트 II 대신에 역전사에서 슈퍼슈크립트 III RT(Invitrogen Co., Cat. No. 18080-044)를 사용하였다. cDNA 주쇄를 Rneasy 소형 키트(QIAGEN Co., Cat. No. 74104)에 의해 캔디다 유틸리스로부터 분리된 mRNA로서 합성함에 이어서 PCR을 수행하였다.
사용되는 프라이머는 하기에 나타내었다.
cDNA를 제조하기위한 프라이머: TTG ACA CCA ACT CGG AGA CAT CAG A (서열 18),
네스티드(Nested) PCR: GAG AGT ACC TTC TCA TCC GTC AAG A(서열 19) 및
키트에 부착된 GeneRacer 5' 네스티드 프라이머.
PCR 생성물을 TOPO TA 클로닝 방법에 따라 키트내 pCR4-TOPO 벡터에 연결하고 에스케리치아 콜리를 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환체중에 함유된 삽입체의 뉴클레오타이드 서열을 분석하였고 캔디다 유틸리스의 글루타티온 신테타제 유전자를 함유할 것으로 추정되는 유전자 단편을 수득하였다.
상기된 바와 같이 수득된 정보를 기초로 프라이머를 디자인하고 PCR을 수행하였고 증폭 생성물의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 98℃에서 2분동안의 반응에 이어서 98℃에서 20초동안, 55℃에서 30초동안 및 72℃에서 2분동안의 40회 반응 사이클의 조건하에 제조업자의 지침에 따른 Probest(Takara Shuzo Co.)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
사용되는 프라이머는 하기에 나타낸다.
프라이머 F1: TAG CCA ATA CAA CCA GCA ACA C(서열 20) 및
프라이머 R1: GAA GGA ATT CTA ATT CGT GAG G(서열 21)
상기된 바와 같이 증폭된 PCR 생성물의 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 방식으로 결정하였고 서열 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 일치하는 것으로 밝혀졌다. 당해 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 것으로 추정되는 아미노산 서열은 서열 2에 나타내었다. 이로써, 캔디다 유틸리스의 글루타티온 신테타제 유전자의 동족체가 수득되었다.
<2> 캔디다 유틸리스의 γ-글루타밀시스테인 신테타제를 암호화할 것으로 추정되는 유전자의 획득
사카로마이세스 세레비지애 및 스키조사카로마이세스 폼베의 γ-글루타밀시스테인 신테타제의 아미노산 서열간의 상동성이 높은 하기의 서열을 선별하였다[문헌참조: Ohtake et al., Yeast, 7(9): 953-961(Dec., 1991); Mutoh et al., J. Biochem. (Tokyo), 117(2): 283-288(Feb., 1995)].
(ix) MGFGMG(서열 22)
(x) GWRVEFR(서열 23)
축퇴성 프라이머를 각각의 아미노산 서열을 기초로 디자인하고 축퇴성 PCR을 수행하였다. 프라이머 F1(ATG GGN TTY GGN ATG GG, 서열 24)을 (ix)의 영역에 상응하는 프라이머로서 디자인하였고 프라이머 R1(RAA YTC NAC NCK CCA, 서열 25)을 (X)의 영역에 상응하는 프라이머로서 디자인하였다. 94℃에서 3분동안의 반응에 이어서 94℃에서 1분동안, 52℃에서 1분동안 및 74℃에서 1분동안의 30회 반응 사이클의 조건하에 제조업자의 지침에 따라 DNA 폴리머라제로서 KOD Dash(TOYOBO Co.)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 적용하였고 약 700bp의 예상된 크기에 상응하는 영역을 절단하고 Mag 추출기(TOYOBO Co., Code NPK-601)를 사용함에 의해 겔로 부터 DNA를 추출하였다.
추가로, 당해 추출된 DNA를 주형으로서 사용하여 네스티드 PCR을 수행하였다. 상기된 바와 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다. 증폭 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 적용함에 이어서 에티디움 브로마이드를 사용하여 염색시키고 약 700bp에 상응하는 영역을 절단하고 Mag 추출기를 사용하여 겔로부터 DNA를 추출하였다. DNA를, DNA 연결 키트 버젼 2(Takara Shuzo Co.)를 사용함에 의해 pGEM-T Easy 벡터에 연결하고 에스케리치아 콜리 JM109 컴피턴트 세포를 형질전환시키는데 사용하였다. 수득된 형질전환체중에서, 캔디다 유틸리스의 γ-글루타밀시스테인 신테타제를 암호화할 것으로 예상되는 유전자 단편을 함유하는 것으로 사료되는 형질전환체를 수득하였다. 형질전환체중에 함유된 삽입체의 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 방식으로 결정하였다.
cDNA 말단의 신속 증폭용 3' RACE 시스템(Gibco BRL)을 사용하여 상기된 바와 같이 결정된 뉴클레오타이드 서열을 기초로 3' RACE를 수행하였다. cDNA의 주쇄는 Rneasy Mini 키트를 사용하여 캔디다 유틸리스 기원의 mRNA로부터 합성하고 PCR을 3회 수행하였다.
사용된 프라이머는 하기에 나타낸다.
제1 PCR: TGA ACA GAG CTC GTT ACC TC (서열 26) 및 3' RACE 키트에 부착된 AUAP 프라이머,
제2 PCR: TCA TGG GCT AAT TTT GCA CC(서열 27) 및 3' RACE 키트에 부착된 AUAP 프라이머,
제3 PCR: TTC CTA GCA TTG ACG GCA GC(서열 28) 및 3' RACE 키트에 부착된 AUAP 프라이머.
94℃에서 2분동안의 반응에 이어서 94℃에서 1분동안, 50℃에서 30초 동안 및 74℃에서 40초 동안의 30회 반응 사이클의 조건하에 제조업자의 지침에 따라 KOD Dash를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 생성물을 pGEM-T Easy 벡터에 연결하고 에스케리치아 콜리를 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환체중에 함유된 삽입체의 뉴클레오타이드 서열을 분석하여 캔디다 유틸리스의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자를 함유할 것으로 에상되는 유전자 단편에 관한 정보를 수득하였다.
이어서, 5' RACE를 이전에 설명한 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 기초로 수행하였다. 사용되는 키트는 cDNA 말단 시약 어셈블리 버젼 2.0(Gibco BRL)의 신속 증폭용 5'RACE 시스템이다.
cDNA 주쇄를 제조하기 위한 역전사용으로 사용되는 프라이머는 하기에 나타낸다.
AGC ACC AGA AAT GAC GTT C(서열 29)
제조업자의 지침에 따라 작제된 cDNA 라이브러리 및 하기의 프라이머를 사용하여 PCR을 3회 수행하였다. 94℃에서 2분동안의 반응에 이어서 94℃에서 1분동안, 50℃에서 30초동안 및 74℃에서 40초동안의 30회 반응 사이클의 조건하에 제조업자의 지침에 따라 KOD Dash를 사용하여 PCR을 수행하였다.
사용된 프라이머는 하기에 나타낸다.
제1 PCR: CCA TCT GAC GAC ATC CTG CTG(서열 30) 및 키트에 부착된 AUAP 프라이머,
제2 PCR: GTC AGC TAA GTG GCC TTT G(서열 31) 및 키트에 부착된 AUAP 프라이머 및
제3 PCR: CAC TGG CGC TGC TGC CGT C(서열 32) 및 키트에 부착된 AUAP 프라이머.
PCR 생성물을 pGEM-T Easy 벡터에 연결하고 에스케리치아 콜리를 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환체중에 함유된 삽입체의 뉴클레오타이드 서열을 분석하여 캔디다 유틸리스의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자를 함유할 것으로 예상되는 유전자 단편에 관한 정보를 수득하였다. 기타 유기체와의 상동성을 기초로, 전장이 클로닝되지 않은 것으로 사료되었고 5' RACE를 추가로 수행하였다.
cDNA 주쇄를 제조하기 위해 RT용으로 사용되는 프라이머는 하기에 나타낸다.
TGA TCT TCT GCT GTT CAT GTT(서열 3)
제조업자의 지침에 따라 작제된 cDNA 라이브러리를 사용하여 PCR을 3회 수행하였다.
사용되는 프라이머는 하기에 나타낸다.
제1 PCR: CTC CAC GTA CAA GTA GTT CTC(서열 34) 및 키트에 부착된 AUAP 프라이머,
제2 PCR: CAG CGA ATC ACC GTT GTA CGG(서열 35) 및 키트에 부착된 AUAP 프라이머,
제3 PCR: AGC CAG CGG TGT CGC CTC(서열 36) 및 키트에 부착된 AUAP 프라이머.
PCR 생성물을 pGEM-T Easy 벡터에 연결하고 에스케리치아 콜리를 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환체중에 함유된 삽입체의 뉴클레오타이드 서열을 분석하여 캔디다 유틸리스의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자를 함유할 것으로 예상되는 유전자 단편에 관한 정보를 수득하였다.
상기된 바와 같이 수득한 정보를 기초로 프라이머를 디자인하고 PCR을 수행하고 증폭 생성물의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 98℃에서 2분동안의 반응에 이어서 98℃에서 20초동안, 55℃에서 30초동안 및 72℃에서 2분동안의 40회 반응 사이클의 조건하에 제조업자의 지침에 따라 Pyrobest(Takara Shuzo Co.)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
사용되는 프라이머는 하기에 나타낸다.
프라이머 F2: GGG TTT GTT GTC TAT CGG CTT AAG(서열 37),
프라이머 R2: AGC TGT CTT GGT CGT CAT ATC CAT(서열 38).
상기된 바와 같이 증폭된 PCR 생성물의 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 방식으로 결정하였다. 당해 결과는 서열 3에 나타낸다. 추가로, 당해 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 것으로 예상되는 γ-글루타밀시스테인 신테타제의 아미노산 서열은 서열 4에 나타낸다. 따라서, 캔디다 유틸리스의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자의 동족체를 수득하였다.
상기 동정된 γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자 및 캔디다 유틸리스 기원의 글루타티온 신테타제 동족 유전자의 기능은 이들을 사카로마이세스 세레비지애에서 발현시켜 결정하였다. 사카로마이세스 세레비지애에서 각각의 유전자를 발현하는 벡터를 사카로마이세스 세레비지애에 도입함에 의해 동족체의 기능을 분석하였다.
글루타티온 신테타제 활성이 감소된 사카로마이세스 세레비지애로서, 문헌[참조: WO01/90310]에 기재된 사카로마이세스 세레비지애 Nα3 균주를 사용하였다.
Nα3 균주는 글루타티온 신테타제 유전자를, 사카로마이세스 세레비지애의 반수체 우라실-영양요구성 균주인 Nα1 균주(참조: WO01/90310)의 모균주 기원의 약화된 글루타티온 신테타제를 암호화하는 유전자로 대체함에 의해 작제된 균주이다.
<3> γ-글루타밀시스테인 신테타제 활성이 감소된 사카로마이세스 세레비지애의 획득
(1) GSH1 유전자 치환 카세트의 제조
우선, 중간 영역에서 γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자(서열 39)의 3' 말단에 이르는 단편을, 상기 언급된 Nα1 균주의 염색체 DNA를 주형으로서 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 94℃에서 1분동안의 반응에 이어서 94℃에서 30초동안, 60℃에서 40초동안 및 74℃에서 1분동안의 30회 반응 사이클의 조건하에서 KOD Dash(TOYOBO Co.) 및 제조업자의 지침에 따른 하기의 조성을 갖는 반응 혼합물을 사용하여 PCR을 수행하였다. 프라이머로서, GF1(GTG GAC GAC CGT ACT CCG AAG, 서열 41) 및 GR1(ACC CAA ATC GAT AAT GTC AAC, 서열 42)을 사용하였다.
상기된 바와 같이 증폭된 GSH1 유전자 단편을 제조업자의 지침에 따라 플라스미드 pGEM-1 Easy(Promega Co.)에 연결하여 GSH1dash/pGEM을 수득하였다.
이어서, 부위 지시된 돌연변이 유발에 의해, γ-글루타밀시스테인 신테타제(서열 40)의 372번 및 373번 위치의 아미노산, 세린 및 라이신에 상응하는 코돈을 GSH1dash/pGEM에 함유된 γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자(서열 39)내의 종료 코돈으로 대체하였다. 당해 작업은 제조업자의 프로토콜에 따라 퀵 챈지 부위 지시된 돌연변이 유발 키트(STRATAGENE Co.)를 사용하여 수행하였다. 프라이머로서, QCF1(CTT TTC TTG GGT GGG TAG TAA TTT TTC AAT AGG ACT, 서열 43) 및 QCR1(AGT CCT ATT GAA AAA TTA CTA CCC ACC CAA GAA AAG, 서열 44)를 사용하였다. 이로써, 플라스미드 GSH1Mdash/pGEM을 제조하였다.
상기된 바와 같은 돌연변이가 도입된 γ-글루타밀시스테인 신테타제는 효소 활성이 약하다(약화된 글루타티온 신테타제, WO01/90310).
이어서, 문헌[참조: WO01/90310]에 기재된 pYES2dash(플라스미드 pYES2(Invitrogen Co.)로부터 2μori를 제거함에 의해 수득된 플라스미드) 및 상기 언급된 GSH1Mdash/pGEM 둘다를 제한 효소 SacI 및 SphI로 분해한다. URA3 유전자를 함유하는 단편을 pYES2dash로부터 절단하고 γ-글루타밀시스테인 신테타제의 부분적인 유전자 서열을 함유하는 영역을 GSH1Mdash/pGEM으로부터 절단하고 이들을 서로 연결하여 플라스미드 GSH1Mdash/pYES2dash를 작제하였다. GSH1Mdash/pYES2dash를 제한 효소 BbeI로 분해하여 유전자 치환 카세트를 수득하였다(도 1).
(2) GSH1 유전자 치환 카세트의 사카로마이세스 세레비지애로의 도입
Nα1 균주내 γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자의 유전자 치환은 상기된 바와 같이 제조된 유전자 치환 카세트를 사용하여 수행하였다. Nα1 균주를 전배양하고 배양물을 YPD 배지 50ml에 접종하고 세포가 대수 증식기에 도달하도록 하였다. 배양 세포를 1M 소르비톨에 현탁시키고 유전자 치환 카세트와 혼합하고 전기 천공으로 형질전환시켰다. 형질전환체 균주를 1mM 글루타티온을 함유하는 SD 플레이트상에 도말하고 성장 균주를 선별하였다. 유전자 치환 카세트가 표적 위치의 염색체로 도입되었는지의 여부를 PCR로 확인하고 수득된 균주를 Nα4 중간체로서 명명하였다. 이어서, 염색체상에 돌연변이 γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자만이 잔류하도록 하기의 작업을 수행하였다. Nα4 중간체를 1mM 글루타티온을 함유하는 YPD 배지에 배양하였고 배양액을 1mM 글루타티온을 함유하는 SDFOA 플레이트상에 접종하였다. 당해 플레이트상에서 성장한 균주의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자를 서열 분석하여 표적 부위에서의 서열이 올바르게 치환되었는지 확인하였고 이어서 Nα4 균주를 수득하였다(도 2).
이어서, 상기된 바와 같이 수득된 Nα4 균주의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 활성이 약화되었는지의 여부를 조사하였다. 오타케(Ohtake) 등은 돌연변이 처리에 의해 사카로마이세스 세레비지애 YNN27 균주로부터 수득한 YH1 균주의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 활성을 측정하였다[문헌참조: Agric. Biol. Chem., 54(12): 3145-3150(1990)]. 당해 방법에 따라 활성을 측정하였다. 결과로서, Nα4 균주의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 활성을 검출가능한 한계 이하였다. 이어서, Nα4 균주를 SD 배지에서 배양하였고 대수 증식기 단계에서 세포내 γ-글루타밀시스테인 및 글루타티온의 함량을 측정하였다. 그러나, γ-글루타밀시스테인은 검출되지 않았고 글루타티온의 농도는 0.01%였다. 추가로, Nα4 균주는 2mM의 메틸글리옥살에 대해 민감성을 나타내기 때문에, YH1 균주의 경우에서 처럼 γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자가 치환되는 것으로 확인되었다.
<4> 캔디다 유틸리스 기원의 글루타티온 신테타제 동족체의 발현 벡터의 작제
주형으로서 캔디다 유틸리스의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행함으로써 캔디다 유틸리스의 글루타티온 신테타제 유전자 동족체(CGSH2)의 ORF 영역을 증폭시켰다. 98℃에서 2분동안의 반응에 이어서 98℃에서 20초동안, 55℃에서 30초동안 및 72℃에서 2분동안의 40회 반응 사이클의 조건하에 제조업자의 지침에 따라 Pyrobest(Takara Shuzo Co.)를 사용하여 PCR을 수행하였다. KpnI 분해 부위가 부착된 N-말단-프라이머 CGSH2F1(AGA TTG GGT ACC ATG AGT ATT CCT CAG TTA TCT G, 서열 45) 및 XbaI 분해 부위가 부착된 C 말단 프라이머 CGSH2R1(ATC CGG TCT AGA CTA TTG GAG AGC AAC ACC ATC, 서열 46)를 상기 조건하에서 사용하여 PCR을 수행하였고 증폭 생성물을, QIA퀵 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한다. 정제된 PCR 생성물 및 pAUR123 벡터(Takara Shuzo Co.)를 제한 효소 KpnI 및 XbaI로 분해함에 이어서 서로 연결하여 에스케리치아 콜리 JM109 컴피턴트 세포를 형질전환시키는데 사용하였다. 따라서, CGSH2/pAUR123 벡터를 제조하였다. 따라서, CGSH2/pAUR123 벡터를 제조하였다. 이어서, CGSH2/pAUR123 벡터 및 pYES2 벡터를 제한 효소 BamHI로 분해하였다. CGSH2의 ORF 및 pAUR123 벡터로부터 기원하는 프로모터를 함유하는 영역을 CGSH2/pAUR123 벡터로부터 제조하고 분해된 말단이 탈인산화된 pYES2 벡터에 연결하고 에스케리치아 콜리 JM109 컴피턴트 세포를 형질전환시키는데 사용하였다. 따라서, 캔디다 유틸리스의 글루타티온 신테타제 동족체의 발현 벡터인 CGSH2/pYES2 벡터를 제조하였다(도 3).
<5> 캔디다 유틸리스 기원의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 동족체의 발현 벡터의 작제
주형으로서 캔디다 유틸리스의 염색체 DNA를 사용하는 PCR을 수행하여 캔디다 유틸리스의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자 동족체(CGSH1)의 ORF 영역을 증폭시켰다. 98℃에서 2분동안 반응에 이어서 98℃에서 20초동안, 55℃에서 30초동안 및 72℃에서 2분동안 40회 반응 사이클의 존건하에 제조업자의 지침에 따라 Pyrobest(Takara Shuzo Co.)를 사용하여 PCR을 수행하였다. KpnI 분해 부위가 부착된 N-말단 프라이머 CGSH1F1(GAG TAC GGT ACC ATG GGG CTG CTA TCA TTA GGG AC, 서열 47) 및 XbaI 분해 부위가 부착된 C 말단 프라이머 CGSH1R1(CCC TTA TCT AGA TTA AGC CTT TGG GTT GTT TAT C, 서열 48)를 상기 조건하에 사용하여 PCR을 수행하고 증폭 생성물을 QIA퀵 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 생성물 및 pAUR123 벡터(Takara Shuzo Co.)를 제한 효소 KpnI 및 XbaI로 분해함에 이어서 서로 연결하여 에스케리치아 콜리 JM109 컴피턴트 세포를 형질전환시키는데 사용하였다. 따라서, CGSH1/pAUR123 벡터를 제조하였다. 이어서, CGSH1/pAUR123 벡터 및 pYES2 벡터를 제한 효소 BamHI로 분해하였다. CGSH1의 ORF 및 pAUR123 벡터 기원의 프로모터를 함유하는 영역을 CGSH1/pAUR123 벡터로부터 제조하고 분해된 말단이 탈인산화된 pYES2 벡터에 연결하여 에스케리치아 콜리 JM109 컴피턴트 세포를 형질전환시키는데 사용하였다. 따라서, 캔디다 유틸리스의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 동족체의 발현 벡터인 CGSH1/pYES2 벡터를 작제하였다(도 4).
<6> 보충 시험
이어서, CGSH1/pYES2 벡터 또는 CGSH2/pYES2 벡터를 Nα3 균주 및 Nα4 균주에 도입하여 형질전환체를 수득하였다. Nα3 균주 또는 Nα4 균주를 전배양하고 액체 배지(1mM 글루타티온을 함유하는 YPD 배지) 50ml에 접종하여 세포가 대수 세포 증식기에 도달하도록 한다. 배양 세포를 1M 소르비톨중에 현탁시키고 CGSH1/pYES2 벡터 또는 CGSH2/pYES2 벡터와 혼합하고 전기천공에 의해 형질전환시켰다. 형질전환된 균주를 1mM 글루타티온을 함유하는 SD 플레이트상에서 배양하고 성장한 균주를 선별하였다. Nα3 균주 및 Nα4 균주는 우라실 영양 요구성이고 CGSH1/pYES2 벡터 또는 CGSH2/pYES2 벡터가 함유되는 경우만이 SD 배지에서 성장할 수 있었다. 통상적인 방법을 사용하여, 수득된 형질전환체가 CGSH1/pYES2 벡터 또는 CGSH2/pYES2 벡터를 함유하는지를 확인하였다.
따라서, 형질전환체 Nα3/CGSH1 균주, Nα4/CGSH1 균주, Nα3/CGSH2 균주 및 Nα4/CGSH2 균주를 수득하였다. Nα3/CGSH1은 2mM 메틸글리옥살에 대해 민감성을 나타낸 반면 Nα4/CGSH1 균주는 2mM 메틸글리옥살에 대해 민감성을 나타내지 않았다. 한편, Nα3/CGSH2 균주는 2mM 메틸글리옥살에 대해 민감성을 나타내지 않은 반면 Nα4/CGSH2 균주는 2mM 메틸글리옥살에 대해 민감성을 나타내었다. 추가로, SD 배지에서 배양하는 경우, Nα3/CGSH1 균주 및 Nα4/CGSH2 균주는 대수 증식기에서 어떠한 글루타티온을 함유하지 않은 반면 Nα4/CGSH1 균주 및 Nα3/CGSH2 균주는 0.4%의 글루타티온을 함유하였다. Nα3 균주는 사카로마이세스 세레비지애의 글루타티온 신테타제에서 발생된 돌연변이로 인해 글루타티온 합성 능력이 감소된 반면 Nα4 균주는 사카로마이세스 세레비지애의 γ-글루타밀시스테인 신테타제에서 발생된 돌연변이로 인해 글루타티온 합성 능력이 감소되었다. 따라서, CGSH1은 사카로마이세스 세레비지애의 γ-글루타밀시스테인 신테타제를 보충하였고 CGSH2는 사카로마이세스 세레비지애의 글루타티온 신테타제를 보충하였음이 입증되었다.
글루타티온 신테타제를 암호화하는 일부 DNA를 수단으로 글루타티온 신테타제 활성이 감소된 캔디다 유틸리스의 제조 예는 참조 실시예로서 하기에 예시된다. 글루타티온 신테타제 활성이 감소된 캔디다 유틸리스는 또한 서열 1의 58번 내지 981번의 뉴클레오타이로 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는 엄중 조건하에서 서열 1의 58번 내지 981번의 뉴클레오타이드로 이루어진 서열을 포함하는 DNA 또는 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 하이브리드화할 수 있는 DNA를 사용하여 유사한 방법으로 제조될 수 있다.
<참조 실시예 1>
캔디다 유틸리스의 글루타티온 신테타제에 대한 유전자 붕괴 카세트의 제조
주형으로서 캔디다 유틸리스 ATCC15239로부터 제조된 염색체 DNA 및 서열 49 및 50의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98℃에서 2분동안의 반응에 이어서 98℃에서 20초동안, 55℃에서 30초 동안 및 72℃에서 2분동안 40회 반응 사이클의 조건하에 제조업자의 지침에 따라 Pyrobest(Takara Shuzo Co.)를 사용하여 PCR을 증폭시켰다.
증폭된 생성물을 QIA 퀵 PCT 정제 키트(QIAGEN Co., Cat. No. 28106)를 사용하여 정제하고 정제된 생성물의 말단에 아데닌을 첨가하고 pGEM-T Easy 벡터에 연결하였다. AmpliTaq(ABI, Code N808-0161) 및 dNTP 대신에 2.5mM dATP를 사용하여 72℃에서 10분동안 반응시켜 아데닌을 첨가하였다. 이어서, 클론된 단편에서 2개 부위에서의 뉴클레오타이드 서열은 퀵챈지 부위 지시된 돌연변이 유발 키트(STRATAGENE Co., Catalog #200518)를 사용하여 부위 지시된 재조합에 의해 대체하여 HindIII 및 KpnI 분해 부위를 도입함으로써 CGSH2Ctermi/pGEMT-Easy 벡터를 수득하였다. 부위 지시된 재조합용으로 사용되는 프라이머는 하기에 나타낸다.
[돌연변이의 첫번째 도입(HindIII 분해 부위의 도입)]
GAA GCC TCA GCA TGA AGC TTG TGG TAA TAA CAT TTA C(서열 51)
G TAA ATG TTA TTA CCA CAA GCT TCA TGC TGA GGC TTC(서열 52)
[돌연변이의 두번째 도입(KpnI 분해 부위의 도입)]
CGA CCA ATC GAC TGG TAC CGT TAT CAA AAA CTC TG(서열 53)
CA GAG TTT TTG ATA ACG GTA CCA GTC GAT TGG TCG(서열 54)
추가로, 주형으로서 캔디다 유틸리스 ATCC15239로부터 제조된 염색체 DNA 및 하기의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 URA3 유전자를 함유하는 단편을 증폭시켰다. 94℃에서 2분동안의 반응에 이어서 94℃에서 1분동안, 54℃에서 30초동안 및 74℃에서 40초동안의 30회 반응 사이클의 조건하에 제조업자의 지침에 따라 KOD Dash(TOYOBO Co., Code LDP-101)을 사용하여 PCR을 수행하였다.
CCC AAG CTT CTC TAC TTG CTT CTG CTC AAC(서열 55)
GCA GGT ACC AAC TTC CGA AAA CAG TAA TGA AC (서열 56)
증폭 생성물을 pGEMT Easy 벡터에 연결하여 CURA3/pGEMT-Easy 벡터를 수득하였다.
CGSH2termi/pGEMT-Easy 벡터 및 CURA3/pGEMT-Easy 벡터를 각각 HindIII 및 KpnI로 분해시켰다. CGSH2를 함유하는 단편 및 pGEMT-Easy의 주요 부분을 CGSH2termi/pGEMT-Easy 벡터로부터 제조하였고 CURA3을 함유하는 단편을 CURA3/pGEMT-Easy 벡터로부터 제조하였다. 이들 제조된 단편을 서로 연결하여 에스케리치아 콜리 JM109를 형질전환시키는데 사용하였다. 따라서, CURA3△CGSH2/pGEMT-Easy 벡터를 제조하였다.
주형으로서 제한 효소 NotI로 분해된 CURA3△CGSH2/pGEMT-Easy 벡터를 사용하고 서열 49 및 50의 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 따라서, 캔디다 유틸리스의 글루타티온 신테타제용 유전자 붕괴 카세트를 제조하였다(도 5 및 도 6).
<참조 실시예 2>
우라실 영양요구성 캔디다 유틸리스 ATCC15239ura- 균주의 획득
ATCC15239 기원의 우라실 영양요구성 균주인 ATCC15239ura- 균주를 통상적인 방식으로 수득하였다[문헌참조: the technique of Luis et al., FEMS Microbiology Letters 165, 335-340(1998)]. ATCC15239ura- 균주는 이후에 기술되는 바와 같은 URA3 유전자에 의해 보충되었고 당해 균주는 ura3 돌연변이인 것으로 예상된다.
<참조 실시예 3>
캔디다 유틸리스 기원의 γ-글루타밀시스테인 생산 효모(ATCC15239△gsh2 균주)의 획득
우선, ATCC15239ura- 균주를 YPD 시험 튜브 배지에서 30℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 YPD 플라스크 배지(500ml 사카구치 플라스크, 50ml 충전)에 접종하고 진탕과 함께 30℃에서 배양하였다. 세포를 대수 증식기에서 수거하고 4℃로 냉각된 1M 소르비톨 용액으로 3회 세척하였다. 세척된 세포를 냉각된 1M 소르비톨 용액에 현탁시켰다. 현탁액에 글루타티온 신테타제 유전자 붕괴 카세트 50㎕(2㎍)를 첨가하고 0.2cm 큐벳에서 잘 혼합하고 200Ω저항, 125 μF의 용량 및 전압 1.5kV인 유전자 펄서 시스템(BiorRad Co.)을 사용하여 전기천공한다. 냉각된 1M 소르비톨 1ml을 큐벳에 붓고 큐벳을 10분동안 빙상에서 냉각시킨다. 세포 현탁액을 SD 플레이트상에 도말하고 30℃에서 배양하였다.
플레이트상에서 성장한 균주를 10mM 메틸글리옥살을 함유하는 SD 플레이트상으로 복제하고 30℃에서 배양하였다. 메틸글리옥살에 민감성을 나타내는 7개의 균주를 선별하였다. 이들 7개의 균주를 각각 진탕시키면서 YPD 시험 튜브 배지에서 30℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 2%의 양으로 SD 배지(500ml 사카구치 플라스크, 50ml 충전)에 접종하고 진탕시키면서 30℃에서 배양하였다. 대수 증식기에서 세포를 수거하고 멸균수로 2회 세척하였다. 세척된 세포를 고온수로 10분동안 70℃에서 추출하였고 효모 세포로부터 추출된 γ-글루타밀시스테인을 분리하였고 HPLC로 정량하였다. 추가로, 여과지상에 특정 양의 배지에 함유된 세척된 효모 세포를 위치시키고 105℃에서 4시간동안 가열한 후, 잔류 세포 중량을 효모의 무수 세포 중량으로서 측정하였다. 따라서, ATCC15239△gsh2 균주는 무수 효모 세포를 기준으로 1% 이상의 γ-글루타밀시스테인을 함유하는 캔디다 유틸리스 균주로서 수득되었다.
ATCC15239△gsh2 균주는 SD 배지에 접종하고 진탕시키면서 2일동안 30℃에서 배양하였다. 배양물을 SD 배지에서 2%의 농도로 접종하고 진탕시키면서 30℃에서 배양하였다. 측정된 γ-글루타밀시스테인 함량은 7시간 및 9시간 후 각각 1.08% 및 1.12%였다. 글루타티온 함량은 검출 가능한 한계 이하였다.
<참조 실시예 4>
ATCC15239△gsh2 균주의 글루타티온 신테타제 활성의 측정
ATCC 15239△gsh2 균주를 YPD 배지에 접종하고 진탕시키면서 30℃에서 배양하였다. 배양물을 SD 배지(2L 핀 원뿔 플라스크, 400ml 충전)에 2%의 농도로 접종하고 진탕시키면서 30℃에서 배양하였다. 대수 증식기내 세포를 수거하고 4℃로 냉각된 1M 소르비톨로 2회 세척하였다. 세척된 세포를 0.1M 페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)를 함유하는 10mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 0.5ml 중에 현탁시켰다. 현탁액에 유리 비드(유리 비드 425-600 마이크론 산-세척된(Sigma Co., Code G-8772))를 첨가하고 세포를 비드 비터(BEAD-BEATER)(WAKENYAKU Co.)를 사용하여 파괴하였다. 세포의 파괴는 현미경으로 확인하였다. 이어서, 1ml의 상기 언급된 완충액을 첨가하고 유리 비드 및 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하였다. 따라서 조 세포 추출물을 수득하였다. 조 세포 추출물을 ULTRAFREE-15 Biomax 10(MILLIPORE Co., Cat. No. UFV2BGC40)을 사용하여 정제하여 효소 용액을 수득하였다. 수득한 효소 용액중의 단백질 함량은 브래드포드 방법으로 정량하였다. 색 전개는 단백질 분석 CBB 용액(Nakarai Co., Code 29449-15)을 사용하여 달성되었고 595nm에서의 흡광도를 측정하였다. 표준 곡선은 알부민 표준물질(PIERCE Co., No. 23210)을 사용하여 작성하였다.
상기된 바와 같이 수득된 효소 용액중의 글루타티온 신테타제 활성은 하기와 같은 문헌[참조: T. Gushima et al., J. Appl. Biochem., 5, 210(1983)]의 방법에 따라 측정하였다.
[반응 혼합물]
100mM γ-글루타밀시스테인 100㎕
100mM MgCl2 100㎕
50mM ATP 100㎕
100mM Gly 100㎕
1M 트리스-HCl(pH 8.0) 85.5㎕
160mM PEP 12.5㎕
1mg/ml PK 2㎕
효소 용액(1 내지 10mg 단백질)
정제수
총계 2ml
PEP: 포스포에놀피루브산(SIGMA Co., Code P-7127)
PK: 피루베이트 키나제(SIGMA Co., Code P-1903)
상기 조성을 갖는 반응 혼합물을 1 내지 10mg의 단백질 양의 효소의 존재하에 0 내지 2시간동안 30℃에서 반응시켰다. 반응 혼합물에 1/5 당량의 메타크릴산을 첨가하여 반응을 종료함에 이어서 pH 8.0으로 조정하고 생산된 GSH의 양을 측정하였다. 당해 시점에서의 효소 활성은 검출 가능한 한계 이하여서 검출되지 않았다.
이어서, ATCC15239△gsh2 균주의 모균주인 ATCC15239 균주의 글루타티온 신테타제 활성을 유사하게 측정하였다. 결과로서, ATCC15239 균주의 글루타티온 신테타제 활성은 시간당 0.383μmol-GSH/mg 단백질이었다. 이로써, 글루타티온 신테타제 활성이 시간당 0.003 μmol GSH/mg 단백질 이하이도록 변형된 캔디다 유틸리스는 본 발명의 DNA를 수단으로 수득하였다.
본 발명은 캔디다 유틸리스의 글루타티온 신테타제 유전자 및 γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자를 제공한다. 식품의 향 및 맛 등을 개선하기 위해 사용될 수 있는 효모 추출물은 본 발명의 유전자를 사용하여 성장된 캔디다 유틸리스를 사용하여 저렴한 비용으로 제조할 수 있다.
본 발명은 이의 바람직한 양태를 참조로 상세하게 기술하였지만 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 다양한 변화가 만들어질 수 있고 등가물이 사용될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 외국 선행 문헌, JP 2003-310084를 포함하는 상기 언급된 문헌 각각은 전반적으로 본원에 참조문헌으로서 인용된다.
도 1은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 γ-글루타밀시스테인 신테타제 유전자를 치환하기 위한 카세트의 작제를 도시한다.
도 2는 사카로마이세스 세레비지애 Nα4 균주의 작제를 도시한다.
도 3은 캔디다 유틸리스(Candida utilis)의 글루타티온 신테타제 유전자에 대한 발현 벡터의 작제를 도시한다.
도 4는 캔디다 유틸리스의 γ-글루타밀시스테인 신테타제에 대한 발현 벡터의 작제를 도시한다.
도 5는 캔디다 유틸리스의 글루타티온 신테타제 유전자를 붕괴시키기 위한 카세트의 작제(전반부)를 도시한다.
도 6은 캔디다 유틸리스의 글루타티온 신테타제 유전자를 붕괴시키기 위한 카세트의 작제(후반부)를 도시한다.
<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Gene encoding glutathione synthetase from Candida utilis <130> 5-1998-096241-9 <150> JP 2003-00310084 <151> 2003/09/02 <160> 56 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1571 <212> DNA <213> Candida utilis <220> <221> CDS <222> (58)..(1485) <223> <400> 1 aagtagccaa tacaaccagc aacacatccg cttgcttgag cgttgagatt gtgaaag 57 atg agt att cct cag tta tct gag ggc cag gag gat gat ctg gtc cat 105 Met Ser Ile Pro Gln Leu Ser Glu Gly Gln Glu Asp Asp Leu Val His 1 5 10 15 gca ttg cac cac tat gcc cta tcc aat ggg ttg gtg atg tat cca gtt 153 Ala Leu His His Tyr Ala Leu Ser Asn Gly Leu Val Met Tyr Pro Val 20 25 30 gga ttt aag cca cac tcc cca gtc gct gct cca gta acg ttg tac cca 201 Gly Phe Lys Pro His Ser Pro Val Ala Ala Pro Val Thr Leu Tyr Pro 35 40 45 aca cca ttc cct caa cag gcg ttt gag aag gcc cag atg gta cag gag 249 Thr Pro Phe Pro Gln Gln Ala Phe Glu Lys Ala Gln Met Val Gln Glu 50 55 60 aag ttc aat gaa ctc tac gct aag gtc tcg agt gat gtt gag tgg ctg 297 Lys Phe Asn Glu Leu 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1366 Leu Ala Arg His Phe Ala His Leu Tyr Val Arg Asp Pro Ile Val Ile 405 410 415 ttc gaa gaa cgt ata cac caa gac aat gac gat gaa acg gat cac ttt 1414 Phe Glu Glu Arg Ile His Gln Asp Asn Asp Asp Glu Thr Asp His Phe 420 425 430 435 gag aac att caa tcc act aat tgg cag acg ttg agg ttc aag cca cca 1462 Glu Asn Ile Gln Ser Thr Asn Trp Gln Thr Leu Arg Phe Lys Pro Pro 440 445 450 act caa cag gca aca ccg gat aac aaa tcc gtt cca gga tgg aga gtg 1510 Thr Gln Gln Ala Thr Pro Asp Asn Lys Ser Val Pro Gly Trp Arg Val 455 460 465 gaa ttc aga aca atg gag atc cag ctc aca gat ttt gag aat gct gct 1558 Glu Phe Arg Thr Met Glu Ile Gln Leu Thr Asp Phe Glu Asn Ala Ala 470 475 480 ttc tca atc ttc att gtt ctc ctg gga cag gca ata ctt gcg aca gat 1606 Phe Ser Ile Phe Ile Val Leu Leu Gly Gln Ala Ile Leu Ala Thr Asp 485 490 495 tcc aac tgg tac att cca atc tcc aag att gaa gat aac atg aaa cgt 1654 Ser Asn Trp Tyr Ile Pro Ile Ser Lys Ile Glu Asp Asn Met Lys Arg 500 505 510 515 gca cat cac agg gac gca gta ttg aag gac aag ttc cat ttc aaa gct 1702 Ala His His Arg Asp Ala Val Leu Lys Asp Lys Phe His Phe Lys Ala 520 525 530 gat atc agc tcg cca gca ttc gac acg gtg gag ctg tca ctg gac gag 1750 Asp Ile Ser Ser Pro Ala Phe Asp Thr Val Glu Leu Ser Leu Asp Glu 535 540 545 att gtc aat ggc tgc gat agc ttt atc gga ttg atg gca ctt gtg aag 1798 Ile Val Asn Gly Cys Asp Ser Phe Ile Gly Leu Met Ala Leu Val Lys 550 555 560 aag cac ttg gaa tct cgc ttt gga att act ggt gac gac tta tcg cca 1846 Lys His Leu Glu Ser Arg Phe Gly Ile Thr Gly Asp Asp Leu Ser Pro 565 570 575 aag ggt aca cac gct agg atc tac tac tac ttg gaa ttg atc tcc aag 1894 Lys Gly Thr His Ala Arg Ile Tyr Tyr Tyr Leu Glu Leu Ile Ser Lys 580 585 590 595 aga gcc agt ggc gag cta cca act gct gct aaa ttc ata aga agg ttc 1942 Arg Ala Ser Gly Glu Leu Pro Thr Ala Ala Lys Phe Ile Arg Arg Phe 600 605 610 ttg ctc gac cat aag gac tat caa cac gac tcc aaa ata act gct aga 1990 Leu Leu Asp His Lys Asp Tyr Gln His Asp Ser Lys Ile Thr Ala Arg 615 620 625 atg aat tac gat ttg ttg aac acg ttg aat agc att tca gaa ctt ggc 2038 Met Asn Tyr Asp Leu Leu Asn Thr Leu Asn Ser Ile Ser Glu Leu Gly 630 635 640 gaa gat gtt aga cag ttg ttg ggt gat gac att ggc aac tac ttg ata 2086 Glu Asp Val Arg Gln Leu Leu Gly Asp Asp Ile Gly Asn Tyr Leu Ile 645 650 655 aac aac cca aag gct taatgacact aagggggagg aaactcgcca ttttgcatat 2141 Asn Asn Pro Lys Ala 660 aaacatagac aacgtcctat acagtattta attataaaag agttcagctc gtgatatcga 2201 tggatatgac gaccaagaca gct 2224 <210> 4 <211> 664 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 4 Met Gly Leu Leu Ser Leu Gly Thr Pro Leu Pro Trp Glu Gln Thr Arg 1 5 10 15 Glu Tyr Ala Glu His Val Arg Thr Glu Gly Ile Glu Gln Leu Ile Lys 20 25 30 Met Phe Lys Ala Ala Tyr Ala Arg Thr Gly Asp Gly Tyr Leu Trp Gly 35 40 45 Asp Glu Val Glu Tyr Thr Leu Val Lys Phe Asp His Gly Arg Gly Leu 50 55 60 Ala Leu Leu Ser Ile Asp Lys Asp Ser Val Leu Ala Asp Leu Asn Glu 65 70 75 80 Gly Gly Ser Leu Ala Gln Leu Ser Val Asp Asn Asp Leu Asn Phe His 85 90 95 Pro Glu Tyr Gly Arg Phe Met Leu Glu Ala Thr Pro Leu Ala Pro Tyr 100 105 110 Asn Gly Asp Ser Leu Glu Asn Tyr Leu Tyr Val Glu Arg Asn Met Asn 115 120 125 Ser Arg Arg Ser Val Ala Gln Thr Ala Ile Ala Asp Gly Thr Ile Lys 130 135 140 Pro Leu Thr Ile Thr Val Tyr Pro Leu Met Gly Ile Asn Thr Phe Thr 145 150 155 160 Phe Pro Ser Ala Val Ala Asn Gly Glu Ala Ser Gln Ser Leu Phe Leu 165 170 175 Pro Asp Glu Ile Ile Asn Arg His Ala Arg Phe Pro Thr Leu Thr Ala 180 185 190 Asn Ile Arg Lys Arg Arg Gly Glu Lys Val Ala Ile Asn Val Pro Leu 195 200 205 Tyr Lys Asp Thr Asn Thr Leu Ser Ile Asp Glu Ser Ile Pro Lys Gly 210 215 220 Arg Ser Leu Phe Lys His Asp Glu Glu Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu 225 230 235 240 Pro Gly His Ile Tyr Met Asp Ser Met Gly Phe Gly Met Gly Cys Ser 245 250 255 Cys Leu Gln Val Thr Val Gln Ala Pro Asn Leu Asn Arg Ala Arg Tyr 260 265 270 Leu Tyr Asp Ser Trp Ala Asn Phe Ala Pro Leu Phe Leu Ala Leu Thr 275 280 285 Ala Ala Ala Pro Val Phe Lys Gly His Leu Ala Asp Gln Asp Val Arg 290 295 300 Trp Asn Val Ile Ser Gly Ala Val Asp Asp Arg Thr Ala Tyr Glu Arg 305 310 315 320 Asp Val Lys Pro Leu His Ser Asp Gly Ala Phe Gly Gly Met Thr Asp 325 330 335 Glu Ala Lys Ala Arg Ala Gln Lys Ile Pro Lys Ser Arg Tyr Asp Gly 340 345 350 Ile Asp Ser Phe Leu Gly Asp Ile Gln Asn Asp Phe Ala Lys Asp Gly 355 360 365 Glu Ala Val Phe Lys Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Asn Asp Ile Ser Pro 370 375 380 Pro Ile Asn Glu Arg Thr Leu Gln Arg Leu Ala Gln Glu Pro Gln Phe 385 390 395 400 Asp Pro Val Leu Ala Arg His Phe Ala His Leu Tyr Val Arg Asp Pro 405 410 415 Ile Val Ile Phe Glu Glu Arg Ile His Gln Asp Asn Asp Asp Glu Thr 420 425 430 Asp His Phe Glu Asn Ile Gln Ser Thr Asn Trp Gln Thr Leu Arg Phe 435 440 445 Lys Pro Pro Thr Gln Gln Ala Thr Pro Asp Asn Lys Ser Val Pro Gly 450 455 460 Trp Arg Val Glu Phe Arg Thr Met Glu Ile Gln Leu Thr Asp Phe Glu 465 470 475 480 Asn Ala Ala Phe Ser Ile Phe Ile Val Leu Leu Gly Gln Ala Ile Leu 485 490 495 Ala Thr Asp Ser Asn Trp Tyr Ile Pro Ile Ser Lys Ile Glu Asp Asn 500 505 510 Met Lys Arg Ala His His Arg Asp Ala Val Leu Lys Asp Lys Phe His 515 520 525 Phe Lys Ala Asp Ile Ser Ser Pro Ala Phe Asp Thr Val Glu Leu Ser 530 535 540 Leu Asp Glu Ile Val Asn Gly Cys Asp Ser Phe Ile Gly Leu Met Ala 545 550 555 560 Leu Val Lys Lys His Leu Glu Ser Arg Phe Gly Ile Thr Gly Asp Asp 565 570 575 Leu Ser Pro Lys Gly Thr His Ala Arg Ile Tyr Tyr Tyr Leu Glu Leu 580 585 590 Ile Ser Lys Arg Ala Ser Gly Glu Leu Pro Thr Ala Ala Lys Phe Ile 595 600 605 Arg Arg Phe Leu Leu Asp His Lys Asp Tyr Gln His Asp Ser Lys Ile 610 615 620 Thr Ala Arg Met Asn Tyr Asp Leu Leu Asn Thr Leu Asn Ser Ile Ser 625 630 635 640 Glu Leu Gly Glu Asp Val Arg Gln Leu Leu Gly Asp Asp Ile Gly Asn 645 650 655 Tyr Leu Ile Asn Asn Pro Lys Ala 660 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 5 Gln Glu Val Ala Val Val Tyr Tyr Arg 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 6 Gly Ser Lys Lys Ile Gln Gln 1 5 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 7 Val Leu Lys Pro Gln Arg Glu Gly Gly Gly Asn Asn 1 5 10 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 8 Ile Ser Glu Leu Gly Ile Tyr Gly 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 9 Gly Gly Val Ala Ala Gly Phe 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 10 Glu Gly Gly Gly Asn Asn 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 11 Pro Gln Arg Glu Gly Gly Gly 1 5 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 12 ggttcyaaga agatycarca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 13 ccaccaccyt ctctytgtgg 20 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 14 gttgttacca ccaccytc 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 15 aagatatacc cattggatgg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 16 tcagatcttg gtaaagaggc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 17 agactggcat ttgagtctcc 20 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 18 ttgacaccaa ctcggagaca tcaga 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 19 gagagtacct tctcatccgt caaga 25 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 20 tagccaatac aaccagcaac ac 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 21 gaaggaattc taattcgtga gg 22 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 22 Met Gly Phe Gly Met Gly 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Candida utilis <400> 23 Gly Trp Arg Val Glu Phe Arg 1 5 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n = a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n = a, t, g or c <400> 24 atgggnttyg gnatggg 17 <210> 25 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n = a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> n = a, t, g or c <400> 25 raaytcnacn ckcca 15 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 26 tgaacagagc tcgttacctc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 27 tcatgggcta attttgcacc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 28 ttcctagcat tgacggcagc 20 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 29 agcaccagaa atgacgttc 19 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 30 ccatctgacg acatcctgct g 21 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 31 gtcagctaag tggcctttg 19 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 32 cactggcgct gctgccgtc 19 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 33 tgatcttctg ctgttcatgt t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 34 ctccacgtac aagtagttct c 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 35 cagcgaatca ccgttgtacg g 21 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 36 agccagcggt gtcgcctc 18 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 37 gggtttgttg tctatcggct taag 24 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 38 agctgtcttg gtcgtcatat ccat 24 <210> 39 <211> 2160 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (1)..(2034) <223> <400> 39 atg gga ctc tta gct ttg ggc acg cct ttg cag tgg ttt gag tct agg 48 Met Gly Leu Leu Ala Leu Gly Thr Pro Leu Gln Trp Phe Glu Ser Arg 1 5 10 15 acg tac aat gaa cac ata agg gat gaa ggt atc gag cag ttg ttg tat 96 Thr Tyr Asn Glu His Ile Arg Asp Glu Gly Ile Glu Gln Leu Leu Tyr 20 25 30 att ttc caa gct gct ggt aaa aga gac aat gac cct ctt ttt tgg gga 144 Ile Phe Gln Ala Ala Gly Lys Arg Asp Asn Asp Pro Leu Phe Trp Gly 35 40 45 gac gag ctt gag tac atg gtt gta gat ttt gat gat aag gag aga aat 192 Asp Glu Leu Glu Tyr Met Val Val Asp Phe Asp Asp Lys Glu Arg Asn 50 55 60 tct atg ctc gac gtt tgc cat gac aag ata ctc act gag ctt aat atg 240 Ser Met Leu Asp Val Cys His Asp Lys Ile Leu Thr Glu Leu Asn Met 65 70 75 80 gag gat tcg tcc ctt tgt gag gct aac gat gtg agt ttt cac cct gag 288 Glu Asp Ser Ser Leu Cys Glu Ala Asn Asp Val Ser Phe His Pro Glu 85 90 95 tat ggc cgg tat atg tta gag gca aca cca gct tct cca tat ttg aat 336 Tyr Gly Arg Tyr Met Leu Glu Ala Thr Pro Ala Ser Pro Tyr Leu Asn 100 105 110 tac gtg ggt agt tac gtt gag gtt aac atg caa aaa aga cgt gcc att 384 Tyr Val Gly Ser Tyr Val Glu Val Asn Met Gln Lys Arg Arg Ala Ile 115 120 125 gca gaa tat aag cta tct gaa tat gcg aga caa gat agt aaa aat aac 432 Ala Glu Tyr Lys Leu Ser Glu Tyr Ala Arg Gln Asp Ser Lys Asn Asn 130 135 140 ttg cat gtg ggc tcc agg tct gtc cct ttg acg ctg act gtc ttc ccg 480 Leu His Val Gly Ser Arg Ser Val Pro Leu Thr Leu Thr Val Phe Pro 145 150 155 160 agg atg gga tgc ccc gac ttt att aac att aag gat ccg tgg aat cat 528 Arg Met Gly Cys Pro Asp Phe Ile Asn Ile Lys Asp Pro Trp Asn His 165 170 175 aaa aat gcc gct tcc agg tct ctg ttt tta ccc gat gaa gtc att aac 576 Lys Asn Ala Ala Ser Arg Ser Leu Phe Leu Pro Asp Glu Val Ile Asn 180 185 190 aga cat gtc agg ttt cct aac ttg aca gca tcc atc agg acc agg cgt 624 Arg His Val Arg Phe Pro Asn Leu Thr Ala Ser Ile Arg Thr Arg Arg 195 200 205 ggt gaa aaa gtt tgc atg aat gtt ccc atg tat aaa gat ata gct act 672 Gly Glu Lys Val Cys Met Asn Val Pro Met Tyr Lys Asp Ile Ala Thr 210 215 220 cca gaa acg gat gac tcc atc tac gat cga gat tgg ttt tta cca gaa 720 Pro Glu Thr Asp Asp Ser Ile Tyr Asp Arg Asp Trp Phe Leu Pro Glu 225 230 235 240 gac aaa gag gcg aaa ctg gct tcc aaa ccg ggt ttc att tat atg gat 768 Asp Lys Glu Ala Lys Leu Ala Ser Lys Pro Gly Phe Ile Tyr Met Asp 245 250 255 tcc atg ggt ttt ggc atg ggc tgt tcg tgc tta caa gtg acc ttt cag 816 Ser Met Gly Phe Gly Met Gly Cys Ser Cys Leu Gln Val Thr Phe Gln 260 265 270 gca ccc aat atc aac aag gca cgt tac ctg tac gat gca tta gtg aat 864 Ala Pro Asn Ile Asn Lys Ala Arg Tyr Leu Tyr Asp Ala Leu Val Asn 275 280 285 ttt gca cct ata atg cta gcc ttc tct gcc gct gcg cct gct ttt aaa 912 Phe Ala Pro Ile Met Leu Ala Phe Ser Ala Ala Ala Pro Ala Phe Lys 290 295 300 ggt tgg cta gcc gac caa gat gtt cgt tgg aat gtg ata tct ggt gcg 960 Gly Trp Leu Ala Asp Gln Asp Val Arg Trp Asn Val Ile Ser Gly Ala 305 310 315 320 gtg gac gac cgt act ccg aag gaa aga ggt gtt gcg cca tta cta ccc 1008 Val Asp Asp Arg Thr Pro Lys Glu Arg Gly Val Ala Pro Leu Leu Pro 325 330 335 aaa tac aac aag aac gga ttt gga ggc att gcc aaa gac gta caa gat 1056 Lys Tyr Asn Lys Asn Gly Phe Gly Gly Ile Ala Lys Asp Val Gln Asp 340 345 350 aaa gtc ctt gaa ata cca aag tca aga tat agt tcg gtt gat ctt ttc 1104 Lys Val Leu Glu Ile Pro Lys Ser Arg Tyr Ser Ser Val Asp Leu Phe 355 360 365 ttg ggt ggg tcg aaa ttt ttc aat agg act tat aac gac aca aat gta 1152 Leu Gly Gly Ser Lys Phe Phe Asn Arg Thr Tyr Asn Asp Thr Asn Val 370 375 380 cct att aat gaa aaa gta tta gga cga cta cta gag aat gat aag gcg 1200 Pro Ile Asn Glu Lys Val Leu Gly Arg Leu Leu Glu Asn Asp Lys Ala 385 390 395 400 cca ctg gac tat gat ctt gct aaa cat ttt gcg cat ctc tac ata aga 1248 Pro Leu Asp Tyr Asp Leu Ala Lys His Phe Ala His Leu Tyr Ile Arg 405 410 415 gat cca gta tct aca ttc gaa gaa ctg ttg aat cag gac aac aaa acg 1296 Asp Pro Val Ser Thr Phe Glu Glu Leu Leu Asn Gln Asp Asn Lys Thr 420 425 430 tct tca aat cac ttt gaa aac atc caa agt aca aat tgg cag aca tta 1344 Ser Ser Asn His Phe Glu Asn Ile Gln Ser Thr Asn Trp Gln Thr Leu 435 440 445 cgt ttt aaa ccc ccc aca caa caa gca acc ccg gac aaa aag gat tct 1392 Arg Phe Lys Pro Pro Thr Gln Gln Ala Thr Pro Asp Lys Lys Asp Ser 450 455 460 cct ggt tgg aga gtg gaa ttc aga cca ttt gaa gtg caa cta tta gat 1440 Pro Gly Trp Arg Val Glu Phe Arg Pro Phe Glu Val Gln Leu Leu Asp 465 470 475 480 ttt gag aac gct gcg tat tcc gtg ctc ata tac ttg att gtc gat agc 1488 Phe Glu Asn Ala Ala Tyr Ser Val Leu Ile Tyr Leu Ile Val Asp Ser 485 490 495 att ttg acc ttt tcc gat aat att aac gca tat att cat atg tcc aaa 1536 Ile Leu Thr Phe Ser Asp Asn Ile Asn Ala Tyr Ile His Met Ser Lys 500 505 510 gta tgg gaa aat atg aag ata gcc cat cac aga gat gct atc cta ttt 1584 Val Trp Glu Asn Met Lys Ile Ala His His Arg Asp Ala Ile Leu Phe 515 520 525 gaa aaa ttt cat tgg aaa aaa tca ttt cgc aac gac acc gat gtg gaa 1632 Glu Lys Phe His Trp Lys Lys Ser Phe Arg Asn Asp Thr Asp Val Glu 530 535 540 act gaa gat tat tct ata agc gag att ttc cat aat cca gag aat ggt 1680 Thr Glu Asp Tyr Ser Ile Ser Glu Ile Phe His Asn Pro Glu Asn Gly 545 550 555 560 ata ttt cct caa ttt gtt acg cca atc cta tgc caa aaa ggg ttt gta 1728 Ile Phe Pro Gln Phe Val Thr Pro Ile Leu Cys Gln Lys Gly Phe Val 565 570 575 acc aaa gat tgg aaa gaa tta aag cat tct tcc aaa cac gag aga cta 1776 Thr Lys Asp Trp Lys Glu Leu Lys His Ser Ser Lys His Glu Arg Leu 580 585 590 tac tat tat tta aag cta att tct gat aga gca agc ggt gaa ttg cca 1824 Tyr Tyr Tyr Leu Lys Leu Ile Ser Asp Arg Ala Ser Gly Glu Leu Pro 595 600 605 aca aca gca aaa ttc ttt aga aat ttt gta cta caa cat cca gat tac 1872 Thr Thr Ala Lys Phe Phe Arg Asn Phe Val Leu Gln His Pro Asp Tyr 610 615 620 aaa cat gat tca aaa att tca aag tcg atc aat tat gat ttg ctt tct 1920 Lys His Asp Ser Lys Ile Ser Lys Ser Ile Asn Tyr Asp Leu Leu Ser 625 630 635 640 acg tgt gat aga ctt acc cat tta gac gat tca aaa ggt gaa ttg aca 1968 Thr Cys Asp Arg Leu Thr His Leu Asp Asp Ser Lys Gly Glu Leu Thr 645 650 655 tcc ttt tta gga gct gaa att gca gaa tat gta aaa aaa aat aag cct 2016 Ser Phe Leu Gly Ala Glu Ile Ala Glu Tyr Val Lys Lys Asn Lys Pro 660 665 670 tca ata gaa agc aaa tgt taaactcctt ttacttcggt tgtgaaagaa 2064 Ser Ile Glu Ser Lys Cys 675 agttgacatt atcgatttgg gtgacacggt gattgaaaaa gcaacgacca gtattatacc 2124 tctttttttt attattcagt ttatattttt gcaagt 2160 <210> 40 <211> 678 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 40 Met Gly Leu Leu Ala Leu Gly Thr Pro Leu Gln Trp Phe Glu Ser Arg 1 5 10 15 Thr Tyr Asn Glu His Ile Arg Asp Glu Gly Ile Glu Gln Leu Leu Tyr 20 25 30 Ile Phe Gln Ala Ala Gly Lys Arg Asp Asn Asp Pro Leu Phe Trp Gly 35 40 45 Asp Glu Leu Glu Tyr Met Val Val Asp Phe Asp Asp Lys Glu Arg Asn 50 55 60 Ser Met Leu Asp Val Cys His Asp Lys Ile Leu Thr Glu Leu Asn Met 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ser Leu Cys Glu Ala Asn Asp Val Ser Phe His Pro Glu 85 90 95 Tyr Gly Arg Tyr Met Leu Glu Ala Thr Pro Ala Ser Pro Tyr Leu Asn 100 105 110 Tyr Val Gly Ser Tyr Val Glu Val Asn Met Gln Lys Arg Arg Ala Ile 115 120 125 Ala Glu Tyr Lys Leu Ser Glu Tyr Ala Arg Gln Asp Ser Lys Asn Asn 130 135 140 Leu His Val Gly Ser Arg Ser Val Pro Leu Thr Leu Thr Val Phe Pro 145 150 155 160 Arg Met Gly Cys Pro Asp Phe Ile Asn Ile Lys Asp Pro Trp Asn His 165 170 175 Lys Asn Ala Ala Ser Arg Ser Leu Phe Leu Pro Asp Glu Val Ile Asn 180 185 190 Arg His Val Arg Phe Pro Asn Leu Thr Ala Ser Ile Arg Thr Arg Arg 195 200 205 Gly Glu Lys Val Cys Met Asn Val Pro Met Tyr Lys Asp Ile Ala Thr 210 215 220 Pro Glu Thr Asp Asp Ser Ile Tyr Asp Arg Asp Trp Phe Leu Pro Glu 225 230 235 240 Asp Lys Glu Ala Lys Leu Ala Ser Lys Pro Gly Phe Ile Tyr Met Asp 245 250 255 Ser Met Gly Phe Gly Met Gly Cys Ser Cys Leu Gln Val Thr Phe Gln 260 265 270 Ala Pro Asn Ile Asn Lys Ala Arg Tyr Leu Tyr Asp Ala Leu Val Asn 275 280 285 Phe Ala Pro Ile Met Leu Ala Phe Ser Ala Ala Ala Pro Ala Phe Lys 290 295 300 Gly Trp Leu Ala Asp Gln Asp Val Arg Trp Asn Val Ile Ser Gly Ala 305 310 315 320 Val Asp Asp Arg Thr Pro Lys Glu Arg Gly Val Ala Pro Leu Leu Pro 325 330 335 Lys Tyr Asn Lys Asn Gly Phe Gly Gly Ile Ala Lys Asp Val Gln Asp 340 345 350 Lys Val Leu Glu Ile Pro Lys Ser Arg Tyr Ser Ser Val Asp Leu Phe 355 360 365 Leu Gly Gly Ser Lys Phe Phe Asn Arg Thr Tyr Asn Asp Thr Asn Val 370 375 380 Pro Ile Asn Glu Lys Val Leu Gly Arg Leu Leu Glu Asn Asp Lys Ala 385 390 395 400 Pro Leu Asp Tyr Asp Leu Ala Lys His Phe Ala His Leu Tyr Ile Arg 405 410 415 Asp Pro Val Ser Thr Phe Glu Glu Leu Leu Asn Gln Asp Asn Lys Thr 420 425 430 Ser Ser Asn His Phe Glu Asn Ile Gln Ser Thr Asn Trp Gln Thr Leu 435 440 445 Arg Phe Lys Pro Pro Thr Gln Gln Ala Thr Pro Asp Lys Lys Asp Ser 450 455 460 Pro Gly Trp Arg Val Glu Phe Arg Pro Phe Glu Val Gln Leu Leu Asp 465 470 475 480 Phe Glu Asn Ala Ala Tyr Ser Val Leu Ile Tyr Leu Ile Val Asp Ser 485 490 495 Ile Leu Thr Phe Ser Asp Asn Ile Asn Ala Tyr Ile His Met Ser Lys 500 505 510 Val Trp Glu Asn Met Lys Ile Ala His His Arg Asp Ala Ile Leu Phe 515 520 525 Glu Lys Phe His Trp Lys Lys Ser Phe Arg Asn Asp Thr Asp Val Glu 530 535 540 Thr Glu Asp Tyr Ser Ile Ser Glu Ile Phe His Asn Pro Glu Asn Gly 545 550 555 560 Ile Phe Pro Gln Phe Val Thr Pro Ile Leu Cys Gln Lys Gly Phe Val 565 570 575 Thr Lys Asp Trp Lys Glu Leu Lys His Ser Ser Lys His Glu Arg Leu 580 585 590 Tyr Tyr Tyr Leu Lys Leu Ile Ser Asp Arg Ala Ser Gly Glu Leu Pro 595 600 605 Thr Thr Ala Lys Phe Phe Arg Asn Phe Val Leu Gln His Pro Asp Tyr 610 615 620 Lys His Asp Ser Lys Ile Ser Lys Ser Ile Asn Tyr Asp Leu Leu Ser 625 630 635 640 Thr Cys Asp Arg Leu Thr His Leu Asp Asp Ser Lys Gly Glu Leu Thr 645 650 655 Ser Phe Leu Gly Ala Glu Ile Ala Glu Tyr Val Lys Lys Asn Lys Pro 660 665 670 Ser Ile Glu Ser Lys Cys 675 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 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primer <400> 50 ccctcggaaa aggagacgaa gg 22 <210> 51 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gaagcctcag catgaagctt gtggtaataa catttac 37 <210> 52 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 gtaaatgtta ttaccacaag cttcatgctg aggcttc 37 <210> 53 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 cgaccaatcg actggtaccg ttatcaaaaa ctctg 35 <210> 54 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 cagagttttt gataacggta ccagtcgatt ggtcg 35 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 cccaagcttc tctacttgct tctgctcaac 30 <210> 56 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 gcaggtacca acttccgaaa acagtaatga ac 32

Claims (9)

  1. (A) 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는
    (B) 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 첨가된 서열 2의 아미노산 서열을 갖고 글루타티온 신테타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 서열 1의 58번 내지 1485번의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는
    (b) 서열 1의 58번 내지 1485번의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는 당해 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄중 조건(stringent condition)하에서 하이브리드화할 수 있고 글루타티온 신테타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 DNA에 의해 글루타티온 신테타제 활성이 시간당 0.003μmol GSH/mg 단백질 이하이도록 변형된 캔디다 유틸리스(Candida utilis).
  4. 제1항 또는 제2항에 따른 DNA에 의해 글루타티온 신테타제 활성이 증가되도록 변형된 캔디다 유틸리스.
  5. (c) 서열 1의 58번 내지 981번의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는
    (d) 서열 1의 58번 내지 981번의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는 당해 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄중 조건하에 하이브리드화할 수 있는 DNA에 의해 글루타티온 신테타제 활성이 시간당 0.003μmol GSH/mg 단백질 이하이도록 변형된 캔디다 유틸리스.
  6. 제3항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열 3의 DNA에 의해 γ-글루타밀시스테인 신테타제 활성이 증진되도록 변형된 캔디다 유틸리스.
  7. 제3항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 캔디다 유틸리스를 배양하여 수득 가능한 배양물, 글루타티온 및/또는 γ-글루타밀시스테인을 함유하는 당해 배양물의 분획물 또는 글루타티온 및/또는 γ-글루타밀시스테인의 감마 위치에서의 글루탐산이 열 처리 또는 효소 처리에 의해 방출되는 배양물 또는 분획물을 포함하는 식품 또는 음료.
  8. 제3항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 캔디다 유틸리스를 배양함에 의해 수득 가능한 배양물을 사용하여 제조되는 효모 추출물.
  9. 제3항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 캔디다 유틸리스를 배양하고 수득된 배양물 또는 이의 분획물, 또는 열처리시킨 이의 배양물 또는 분획물을 식품 또는 음료 원료와 혼합시켜 식품 또는 음료로 가공함을 포함하는, γ-글루타밀시스테인 또는 시스테인을 함유하는 식품의 제조 방법.
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