TWI343948B - Gene encoding glutathione synthetase from candida utilis - Google Patents

Description

1343948 (1) 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於編碼產朊假絲酵母穀胱甘肽合成酶之基 因以及經該基因使細胞內穀胱甘肽含量是增加或減低之產 朊假絲酵母，以及利用該產朊假絲酵母製作之食品。使用 其製作之γ-麩胺醯基半胱胺酸和半胱胺酸，或其製作之 穀胱甘肽以及半胱胺醯基甘胺酸生產食品。 【先前技術】 半胱胺酸可用來改進食品的風味、味覺等。已知蛋白 質水解方法、半合成方法等等可產生半胱氨酸，而目前使 用的主要方法是蛋白質水解方法以及半合成方法》爲了使 用半胱胺酸以增進食品之風味以及味覺，往往須要用到高 半胱胺酸含量之自然食品材料。然而迄今爲止只有少數的 自然食品材料具有該類性質。同時，亦有硏究報導指出內 含γ_麩胺醯基半胱胺酸之酵母萃取物經加熱或酵素處理 (W0 〇〇/3〇474 )後可得到具有高半胱胺酸含量之食品材 料。 半胱胺醯基甘胺酸是一種二肽，其中半胱胺酸和甘胺 酸是經由肽鍵相互的結合。有硏究報導指出爲了提高肉類 材料之風味，可將半胱胺醯基甘胺酸與糖共同加熱。雖然 已知經肽合成方法可製作半胱胺醯基甘胺酸，但幾乎無已 知的方法可自天然的材料製作它。另一方面，亦有報導指 出內含穀胱甘肽之酵母萃取物經熱處理或酵素處理（ -4- (2) (2)1343948 JP 2001 -321117A)後可得到具有高半胱胺醯基甘胺酸含 量之食品材料。 在釀酒酵母中，r -麩胺醯基半胱胺酸是使用半胱胺 酸和麩胺酸作爲底物經r -麩胺醯基半胱胺酸合成酶反應 加以合成。進一步的，穀胱甘肽是使用τ -麩胺醯基半胱 胺酸和甘胺酸作爲底物經穀胱甘肽合成酶反應合成。具有 高r _麩胺醯基半胱胺酸含量之酵母菌已報導於 WO 00/30474 ； Otake et al., Agri. Biol. Chem., 54 ( 12) • 3145-3150 ( 1990) : Chris et al., Molecular Biology of the Cell., 8， 1 699- 1 707 ( 1 997 ) ； Inoue et al.,

Biochimica et Biophysica Acta, 1 395，3 1 5-320 ( 1 998 )等 文獻。然而，所有使用到釀酒酵母的相關報告，並未報導 使用產朊假絲酵母進行硏究。 產朊假絲酵母是工業上重要的微生物，可用於生產重 要的生物物質，包括穀晄甘肽、一些型式之胺基酸以及酵 素（J 〇 u rn a 1 〇 f B a c t e r i ο 1 〇 gy， 1 9 9 5, vol..l77, No.24, p71 7 1-7 1 77 )。相較於釀酒酵母，產朊假絲酵母係使用大 部份的能量從戊糖磷酸鹽循環產生吡啶鹼基，而且它顯示 較弱的異化代謝物抑制作用（Biotechnology, 3, 3 0 ( 1 983 ))。進一步的，由於通常是使用釀酒酵母進行硏究，所 以對產朊假絲酵母的所知有限。在該情況下，並無報導指 出產朊假絲酵母如何合成穀胱甘肽，僅有報導指出在溫度 低於5°C或大於栽培酵母菌之溫度下專一性之產朊假絲酵 母株（抗鋅株）可製作大量的穀胱甘肽（JP 03 - 1 8 8 72B) (3) (3)1343948 因此，在產朊假絲酵母中編碼穀胱甘肽合成酶之基因 並未被報導，以及並無控制細胞內穀胱甘肽之含量以生產 工業用物質的已知方法。 【發明內容】 本發明槪要 本發明之目的是提供具有高穀胱甘肽及/或r -麩胺 醯基半胱胺酸內含物之產朊假絲酵母的胱甘肽合成酶之基 因，以及產朊假絲酵母的萃取物。本發明之另一目的是提 供含有穀胱甘肽、r _麩胺醯基半胱氨酸、半胱胺酸或者 半胱胺醯基甘胺酸之食品以及生產該食品之方法。 有硏究報導指出在單位糖類下，產朊假絲酵母之生長 優於藤酒酵母（Biotechnology，νο·3，p30 ( 1 983 ) )» 進 —步的，由於在嚴格地充氧情況下（1<：〇11£1〇“31.(：1· Bacteriology, Dec·，1995，ρρ·7171-7177))它不會產生副 產品乙醇，所以在培養期間較不需要注意乙醇之產生。因 此，本案發明人考慮到使用具有高r -麩胺醯基半胱胺酸 含量之產朊假絲酵母製作酵母萃取物，將比使用釀酒酵母 製作酵母萃取物便宜，因此可令人滿意的進行工業生產。 基於該槪念，本案發明人勤勉的硏究以解決上述之目 標。結果基於其它生物體酵素之同源性，從產朊假絲酵母 成功的選殖編碼穀晄甘肽合成酶之基因以及編碼7 -麩胺 醯基半胱胺酸合成酶之基因。本案發明人發現經基因修飾 -6- (4) (4)1343948 之產阮假絲酵母具有高r 一麩胺醯基半胱氨酸含量之內含 物，從而完成本發明。 本發明主要是提供下列事項。 (1)編碼下列（A)或（B)定義之蛋白質的DNA : (A) ~種蛋白質，其爲具有序列確認號碼：2之 胺基酸序列的蛋白質 (B) —種蛋白質，其爲具有包括取代、置換、刪 除、插入或添加一個或數個胺基酸，以及具有穀胱甘肽合 成酶活性之序列確認號碼：2之胺基酸序列的蛋白質。 (2 )依據（1 )之DNA，其係定義於下列之（a )或 (b)： (A )—種DNA，其爲內含序列確認號碼：1中核 苷酸序列編號58至1485之DMA; (B )—種DNA ’其爲與包含序列確認號碼：丨序 列編號58至1 485之核苷酸或與從該核苷酸序列製備之探 針可在嚴格的條件下雜交的DNA，以及編碼具有榖胱甘 肽合成酶活性蛋白質之DNA。 (3) —種產朊假絲酵母，其爲經（I)或（2)定義 之DNA修飾’使其帶有之穀胱甘肽合成酶活性爲〇.003 微莫耳GSH/毫克蛋白質/小時或更低之產朊假絲酵母。 (4) —種產朊假絲酵母，其爲經（1)或（2)定義 之DNA修飾’使其穀胱甘肽合成酶活性增強之產朊假絲 酵母。 (5) —種產朊假絲酵母’其爲經（c)或（d)定義 1343948 (5) 之DN A修飾，使其帶有之榖胱甘肽合成酶活性爲0.003 微莫耳GSH/毫克蛋白質/小時或更低之產朊假絲酵母。 (c )—種DN A，其爲內含序列確認號碼：1中核 苷酸序列編號58至981之DN A ; (d)—種DNA，其爲與包含序列確認號碼：1序 列編號58至98 1之核苷酸或與從該核苷酸序列製備之探 針在嚴格的條件下雜交的DN A。 (6) 如（3)至（5)項中任何一項之產朊假絲酵母 ，其中產朊假絲酵母經序列確認號碼3之DNA進一步的 修飾，而使r -麩胺醯基半胱胺酸合成酶活性增強。 (7 ) —種食品或飮料，其係包含在適當的條件下培 養如（3)至（6)項中任何一項之產朊假絲酵母，該培養 液之一部分內含穀胱甘肽及/或7 -麩胺醯基半胱氨酸， 或者經熱處理或酵素處理後釋出穀胱甘肽及/或r -麩胺 醯基半胱胺酸r位置的麩胺酸之該培養液或其部分。 (8) —種酵母萃取物，其爲在適當的條件下培養如 (3)至（6)項中任何一項之產朊假絲酵母，使用取得之 培養液所製作的酵母萃取物。 (9) 一種產生內含7 —麩胺醯基半胱胺酸或者半胱 氨酸之食品的方法，其中包含在適當的條件下培養如（3 )至（6 )項中任何一項之產朊假絲酵母以及攪拌得到之 培養液或其部分，或培養液或者其部分與食品或飮料原g 熱處理以加工成食品或飮料。 (6) (6)1343948 發明之詳細描述 以下，將詳細地說明本發明。 <1>產朊假絲酵母之榖胱甘肽合成酶基因 本發明之DN A是編碼下列（A)或（B)定義之蛋白 質的DNA : (A ) —種蛋白質，其係爲具有序列確認號碼：2之 胺基酸序列的蛋白質； (B) —種蛋白質，其係爲具有包括取代、置換、刪 除、插入或添加一個或數個胺基酸，以及有穀胱甘肽合成 酶活性之序列確認號碼：2之胺基酸序列的蛋白質。 本文術語之"穀胱甘肽合成酶活性#意指可從7 -麩 胺醯基半胱胺酸和甘胺酸之催化反應產生穀胱甘肽之活性 〇 只要不損害上述的活性，本發明編碼穀胱甘肽合成酶 之DNA可爲在序列確認號碼：2之胺基酸序列中之一個 或多個位點包含一個或數個取代、刪除、插入、加入或倒 位的胺基酸之DN A »雖然在本文中 '數個〃胺基酸之數 目取決於胺基酸殘基在蛋白質三維構造中之位置或類型而 有不同，其可特別地爲2至25，較佳者2至12，更佳者 2至7。 例如，編碼展示在（A)之蛋白質的DNA可稱爲 DNA ( CGSH2 DNA ) ’其爲序列表之序列確認號碼1之 序列中具有核苷酸編號58至1485之核苷酸序列。進一步 的，可經修飾CGSH2 DNA得到編碼與上述的穀胱甘肽合 (7) (7)1343948 成酶實質相同之蛋白質的DNA，例如：經定點突變而使 胺基酸殘基在專一性位點包含取代、刪除、插入、加入或 倒位。進一步的，經習知的誘變處理亦可得到說明如上經 修飾之DNA。誘變處理之實施例包含將CGSH2 DNA在體 外用羥胺或類似物處理之方法以及包含將內含 CGSH2 DNA之微生物，例如：埃希氏菌屬之細菌，用紫外線照 射進行誘變處理或使用誘變試劑，例如：N -甲基- Ν'-硝基—Ν-亞硝基胍（NG)或乙基甲磺酸（EMS )進行一 般之誘變處理。 進一步的，上述胺基酸殘基取代 '刪除、插入、加入 、倒位等等的突變，亦包含天然發生的突變或變異，例如 歸因於內含不同穀胱甘肽合成酶之產朊假絲酵母品系之突 變或變異株。 在適當的釀酒酵母或類似者之內經表現具有上述突變 之DNA以及檢查細胞內穀胱甘肽合成酶之活性，可得到 編碼實質上與穀胱甘肽合成酶相同的蛋白質之DN Α。 進一步的，本發明之DNA包括在嚴格的條件下與具 有CGSH2 DNA之核苷酸序列或其部份之探針雜交的DNA 以及編碼具有穀胱甘肽合成酶活性蛋白質的DNA、或與 CGSH2 DNA核苷酸序列之同源性不少於90%、.較佳者不 少於95%、更佳者不少於99%的DNA以及編碼其具有穀 胱甘肽合成酶活性蛋白質的DNA。本文中嚴格的條件 "是所謂的形成專一性雜交，以及不形成非專一性雜交之 條件。雖然使用任何數値均難以淸楚的表達此條件。然而 -10- (8) (8)1343948 例如此嚴格的條件是在具有高度DNA同源性下，例如75 %以上同源性DNA，較佳者 85%或以上，更佳者 95% 或以上，可相互雜交，但同源性低於上述數値之DN A則 彼此不可相互雜交之條件。更明確的說，嚴格的條件是對 應至淸洗南方雜交之正常條件的鹽類濃度（也就是lx SSC ' 0.1% SDS，較佳者 0.1 X SSC ' 0.1% SDS，6 0°C )下，DNA可彼此雜交之條件。 —部份的CGSH2 DNA之核苷酸序列亦可作爲探針》 該探針可用基於CGSH 2 DN A之核苷酸序列設計之寡核苷 酸引子以及內含CGSH2 DNA之核苷酸序列的DNA片段 作爲模版以PCR製備。當探針之DNA片段長度約300 bp 時，雜交之淸洗條件爲例如50 °C、2 X SSC以及0.1 % SDS。 在上述的條件下雜交之 DNA，包含產生終止密碼子 或由於突變而缺少活性的DNA。然而，經檢查表現產物 之活性亦可決定該DNA是否應移除。 由於把CGSH2 DNA引入減弱穀胱甘肽合成酶之釀酒 酵母株可加速穀胱甘肽之合成，所以証實CGSH2 DNA是 編碼穀胱甘肽合成酶，如展示於以下描述之實施例。 序列確認號碼：2之胺基酸序列在資料庫內經同源性 捜尋的結果，顯示和釀酒酵母之穀胱甘肽合成酶胺基酸序 列有48%之同源相似性。 < 2 >本發明之產朊假絲酵母 -11 - (9) (9)1343948 本發明之產朊假絲酵母是使用全長或部分的本發明 DNA之片段修飾，而使榖胱甘肽合成酶活性增加或減低 的細胞株，以及較佳者係使用序列確認號碼3之DNA進 一步的修飾而使7 -麩胺醯基半胱胺酸合成酶活性增加。 相較於野生株，用以修釋產朊假絲酵母而使穀胱甘肽合成 酶活性減低之DN A可爲具有序列確認號碼I核苷酸編號 58至981之核苷酸序列的DNA，或是與序列確認號碼1 核苷酸編號58至98 1之核苷酸序列雜交的DNA或在嚴格 的條件下從核苷酸序列製備的探針。 本發明經修飾之而使穀胱甘肽合成酶活性減低之產朊 假絲酵母，宜爲相較於母株其穀胱甘肽合成酶活性減低之 產朊假絲酵母，例如較佳者顯示穀胱甘肽合成酶之活性爲 0.003微莫耳GSH/毫克蛋白質/小時或更低，更佳者爲 0.001微莫耳GSH/毫克蛋白質/小時或更低（"GSH" 代表穀胱甘肽）。更佳者，穀胱甘肽合成酶活性是低於可 偵測的限度。 本發明經修飾而使穀胱甘肽合成酶活性增加之產朊假 絲酵母，宜爲相較於母株其穀胱甘肽合成酶活性增加之產 朊假絲酵母，例如較佳者顯示穀胱甘肽合成酶之活性不少 於0.450微莫耳GSH/毫克蛋白質/小時，更佳者不少於 0.600微莫耳GSH/毫克蛋白質/小時。穀胱甘肽合成酶 活性可使用 Gushima et al. ( T. Gushima et al·，J. Appl. Biochem·，5, 2 1 0 ( 1 9 8 3 ))之方法測量。 本發明之產朊假絲酵母是得自經基因重組技藝（例如 -12- (10) (10)1343948 揭示於下列出版刊物之技藝：FEMS Microbiology Letters, 1 6 5, 335-340 ( 1998 ) ; J. Bacteriology, Dec. 1 995, pp.7171-7177 ; Curr. Genet. 10 ( 8) ： 573- 5 78 ( 1 986 ) ;WO 98/1 4600 )修飾適當的品系（例如野生型產朊假絲 酵母株）而使細胞內穀胱甘肽合成酶活性增加或降低之品 系。降低穀胱甘肽合成酶活性包括喪失穀胱甘肽合成酶之 活性。 此外，利用基因重組技術降低榖胱甘肽合成酶活性之 方法，可因爲修飾了編碼穀胱甘肽合成酶之基因而使穀胱 甘肽合成酶活性降低。產朊假絲酵母CC15239株，編碼 穀胱甘肽合成酶基因之核苷酸序列展示於序列確認號碼： 2。之前不知道任何念珠菌屬酵母菌之榖胱甘肽合成酶基 因》本案發明人捜尋各種生物體穀胱甘肽合成酶胺基酸序 列之高度保守的區域後，發現序列確認號碼：5至1 1之 區域。然後成功地從產朊假絲酵母染色體DNA，使用對 應至上述的區域中序列確認號碼：6、1 0以及1 1之胺基 酸序列的引子，經PCR放大預期編碼穀胱甘肽合成酶的 基因片段。彼用此片段經5 — - RACE以及3 RACE成 功的分離出產朊假絲酵母全長之編碼穀胱甘肽合成酶之基 因。爲了得到全長基因，所使用之引子爲序列確認號碼： 12至19。此外，雖然對產朊假絲酵母之株系無特別之限 制，但其可爲例如 CC 1 5239株。此細胞株可得自 American Type Culture Collection ( Address: 1 080 1 University Boulevard, Manassas, VA 20 1 1 0-2209, United (11) (11)1343948

States of America ) o 經修飾編碼穀胱甘肽合成酶之基因，降低穀胱甘肽合 成酶活性之方法，例如可修飾基因表現調控的序列而使榖 胱甘肽合成酶的表現量降低，或修飾編碼區而使具有穀胱 甘肽合成酶活性的蛋白質不表現。特定言之，例如以內含 刪除5<-以及3'-端之突變穀胱甘肽合成酶基因之重 組DNA轉形產朊假絲酵母並在染色體上造成突變基因與 野生型基因間之重組，可破壞染色體上之基因。在此方法 中，重組DNA內若含標識基因則操作更容易，其可依據 宿主的特徵例如營養缺陷進行選擇。進一步的，若重組 DNA預先經限制酶水解線性化，其可有效地得到在染色 體內倂入重組DNA之細胞株。 進一步的，引入內含經修飾（刪除一部份的穀胱甘肽 合成酶基因）而不產生正常功能的穀胱甘肽合成酶突變基 因之重組DNA，到產朊假絲酵母並造成突變基因與染色 體上正常基因間之重組，亦可破壞染色體上之基因。 在說明如上的染色體倂入重組DNA之細胞株中，引 入的DNA會與染色體上原本存在的穀胱甘肽合成酶基因 發生重組，因此二個野生型穀胱甘肽合成酶基因之融合基 因與突變之穀胱甘肽合成酶基因會插入到染色體，如三明 治般的包夾重組DNA之其他部份（載體部分以及標識基 因）。在此狀態下，野生型穀胱甘肽合成酶基因仍有功能 其後，爲了在染色體DNA上僅留下突變之穀胱甘肽 (12) (12)1343948 合成酶基因，所以將一套穀胱甘肽合成酶基因從染色體 DNA中與載體部分（內含標識基因）經二個穀胱甘肽合 成酶基因間之重組共同去除。在此步驟中，野生型穀晄甘 肽合成酶基因是在染色體DNA上的左面而突變之穀胱甘 肽合成酶基因則被切除，或者是突變之穀胱甘肽合成酶基 因是在染色體DNA上的左面而野生型穀胱甘肽合成酶基 因則被切除。由於此兩案例之標識基因均已被切除，因此 可基於對應至標識基因之表型來証實第二重組是否發生。 進一步的，可經PCR放大穀胱甘肽合成酶基因以及檢査 它的構造，選擇目標基因被取代的細胞株。 用於破壞基因之穀胱甘肽合成酶基因或者其片段，除 了具有序列確認號碼：1核苷酸序列之DNA以外，可包 括在嚴格的條件下與該DNA雜交的DNA以及或者和序列 確認號碼：1之核苷酸序列具有同源性90%或更多、較佳 者9 5%或更多、更佳者99%或更多之DNA。嚴格的條件 是在鹽類濃度對應至淸洗南方雜交之正常條件（也就是1 X SSC、0.1 % SDS，較佳者 0.1 X SSC、0.1 % SDS，60 °C )下，DNA可彼此雜交之條件。 破壞釀酒酵母之穀胱甘肽合成酶基因是揭示於WOOO / 30474。引入重組DNA到產朊假絲酵母之方法的實施例 包含電穿孔法（Luis et al·, FEMS Microbiology Letters, 165, 335-340 (1998))。 可使用甲基乙二醛敏感性作爲表型選擇穀胱甘肽合成 酶活性已降低的細胞株（Y. Ohtake et al., Agri. Biol. -15- (13) (13)1343948

Chem.，54 ( 1 2 ) : 3 1 45-3 1 50 ( 1 990 ))。合成某些含 量穀胱甘肽的細胞株（具有榖胱甘肽合成酶活性以及r-麩胺醯基半胱氨酸合成酶活性之細胞株）可展現甲基乙二 醛抗性。進一步的，經檢查細胞株在不含穀胱甘肽培養液 中之生長，亦可証實穀胱甘肽合成酶活性之降低。進一步 的，利用MNNG (N —甲基一 N -—硝基一N_亞硝基胍） 濃度梯度培養板（WO 03 / 046 1 54 )可有效地取得具有降 低的穀胱甘肽合成酶活性之細胞株。 另一方面，使用基因重組技術提高穀胱甘肽合成酶活 性之方法，可修飾穀胱甘肽合成酶基因而使基因編碼蛋白 質之穀胱甘肽合成酶活性增強或修飾穀胱甘肽合成酶基因 而使基因表現量增強。例如，經引入可表現形式具有序列 確認號碼：1之核苷酸序列的穀胱甘肽合成酶到產朊假絲 酵母可增強穀胱甘肽合成酶活性。 引入穀胱甘肽合成酶基因到產朊假絲酵母之方法包括 用內含穀晄甘肽合成酶基因之重組DNA以及產朊假絲酵 母染色體DNA序列轉形產朊假絲酵母將使重組DNA倂入 產阮假絲酵母之染色體（Kondo，K. et al·，J. Bacterial·， 1 995，177，p71 71-7177)。特別地，可進行如上述的基因 取代的相似方法引入DNA。. 本發明之產朊假絲酵母除了經修飾之穀胱甘肽合成酶 活性之外，可帶有增強之7 -麩胺醯基半胱胺酸合成酶活 性。經引入可表現形式的7 -麩胺醯基半胱胺酸合成酶基 因到產朊假絲酵母，可增強r -麩胺醯基半胱胺酸合成酶 •16- (14) (14)1343948 活性。r 一麩胺醯基半胱胺酸合成酶基因之實施例包含源 自產朊假絲酵母之基因，如展示於序列確認號碼3。 引入r -麩胺醯基半胱胺酸合成酶基因到產朊假絲酵 母之方法的實施例包括例如用內含基因以及產朊假絲酵母 染色體DNA序列之重組DNA轉形產朊假絲酵母將重組 DNA 倂入染色體（K. Kondo et al·，J. Bacteriol·，177, 7171-7177 ( 1995))之方法。特別地，可進行如上述的 基因取代相似的方式引入DNA。 進一步的，目標基因亦可使用內含存在於染色體 DNA上獨立自主複製序列（ARS )的質體引入產朊假絲酵 母。產朊假絲酵母之ARS以及轉型作用如描述於 W0 95/3 22 89。 <3>酵母菌萃取物、本發明之食品以及飮以及生產彼之 方法 在適當的條件下培養穀胱甘肽合成酶活性已經說明如 上之方法修飾，或含有穀胱甘肽或γ-麩胺醯基半胱氨酸 部分之酵母菌得到培養物。培養物可爲內含酵母菌細胞、 酵母菌細胞、破壞的細胞或細胞萃取物（酵母菌萃取物） 之菌種培養液。從破壞的細胞或酵母菌萃取物可.取得內含 穀胱甘肽以及7 -麩胺醯基半胱胺酸的部分。當上述的內 含7 -麩胺醯基半胱胺酸或者其部分之培養液經加熱後r -麩胺醯基半胱胺酸可分解成半胱胺酸和吡咯烷酮羧酸， 釋出半胱胺酸。特別言之，將培養液或者其部分製於酸性 -17- (15) 1343948 至中性的的條件，酸鹼度1至7、50至120°C、 小時水存在下可製作半胱胺酸。 進一步的，經調整內含r -麩胺醢基半胱胺 部分之培養液至酸鹼度3至9、添加r -麩胺醯 解酵素；（？· -麩胺醯轉移酶、r 一麩胺醯基環 麩胺醯胺酶等）以及允許內它在I 5至70°c下作 麩胺醯基半胱胺酸1至300分鐘亦可製作半胱胺 當上述的內含穀胱甘肽或者其部分之培養液 穀胱甘肽可分解成半胱胺醯基甘胺酸以及吡咯烷 釋出半胱胺醯基甘胺酸。特別言之，將培養液或 置於酸性至中性的的條件，酸鹼度1至7、50至 3至3 00小時 '水存在下可製作半胱胺醯基甘胺丨 進一步的，經調整內含穀胱甘肽或者其部分 至酸鹼度3至9、添加7 -麩胺醯基肽降解酵素 麩胺醯轉移酶、r -麩胺醯基環轉移酶、麩胺醯 以及允許內它在15至70°C下作用於穀胱甘肽1 鐘亦可製作半胱胺酸。 培養之培養液無特別限制，只要本發明之酵 良好以及可有效地製作穀胱甘肽或7 -麩胺醯基 即可。若須要，取決於酵母菌之特性培養液中可 的營養物。 製備酵母萃取物及其類似物之培養條件，可 行培養酵母菌或者一般製備酵母菌萃取物的相同 熱水萃取酵母菌細胞或水解酵母菌細胞可製作酵 3 至 300 酸或者其 基肽-降 轉移酶、 用於T -酸。 經加熱後 酮羧酸， 者其部分 i 1 2 0 °C、 较。 之培養液 ;(7 -胺酶等） 至300分 母菌生長 半胱氨酸 添加必要 爲通常進 方式。用 母萃取物 -18- (16) 1343948 。進一步的’本發明之酵母萃取物可爲經 理產生半胱胺酸或者半胱胺醯基甘肢酸之 與其它食品或飮料之原料經熱處理加工成 取物。 特別言之，進行酵母萃取物熱處理之 酵母萃取物粉劑中添加水，以及將混合物 度5，製備濃度爲10%之水溶液。然後}} 下加熱180分鐘。 內含r -麩胺醯基半胱氨酸、半胱氨 半胱胺醯基甘胺酸或其部分之培養液可用 料。實施例包括食品或飮料、酒精飮料、 食品的調味劑。從7 -麩胺醯基半胱胺酸 胱胺酸以及從穀胱甘肽經熱處理產生半胱 在產生食品或飮料期間或者之後進行。此 或飮料之前，可將酵母菌培養液或者其部 經攪拌內含r -麩胺醯基半胱氨酸、 甘肽或半胱胺醯基甘胺酸或其部分之培養 原料，加工混合物製成食品或飮料，可製 飮料。經使用除了使用上述的培養液或者 相似的方法製作的一般食品或飮料之相同 本發明之食品或飮料。該原料之實施例包 稻米、大麥 '玉米澱粉等等、麵包之麵粉 '發酵酵母菌等等、以及發酵食品調味劑 等。進一步的酵母萃取物或者它的濃縮液 熱處理或酵素處 萃取物，或可爲 食品或飮料之萃 方法敘述如下。 用鹽酸調至酸鹼 ?此溶液在98°C 酸、穀胱甘肽或 以產生食品或飮 麵包、以及發酵 經熱處理產生半 胺醯基甘胺酸可 外，在產生食品 分進行熱處理。 半胱氨酸、穀胱 液與食品或飮料 作上述的食品或 其部分之外依據 原料，亦可製作 含：酒精飮料之 、糖、鹽、奶油 之大豆、小麥等 、或乾製品亦可 (17) (17)1343948 作爲發酵的食品調味劑》 【實施方式】 實施例 本發明可參照下列實施例作更明確的說明。 < 1>獲得編碼產朊假絲酵母穀胱甘肽合成酶推演之 基因。 將產朊假絲酵母ATCC 1 523 9株震盪培養在30°C、 YPD試管培養液中，以及使用Dr. GenTLE for Yeast ( Takara Shuzo Co., Code 9084 )製備染色體。 [YPD培養液之組成物] 葡萄糖 2% 蛋白酶 1 % 酵母菌萃取物 1%(酸鹼度5.0)

選擇下列於釀酒酵母、粟酒裂殖酵母以及老鼠（參見 Chris et al., Molecular Biology of the Cell., 8, 1 699- 1 707 (1 997 ))之間穀胱甘肽合成酶胺基酸序列s顯示同源性 之序列。 QEVAVVYYR (序列確認號碼：5 ) GSKKIQQ (序列確認號碼：6) VLKPOREGGGNNVLKPQREGGGNN (序歹IJ 確認號碼： -20- 7 ) (18) (18)1343948 ISELGIYG (序歹IJ確認號碼：8 ) GGVAAGF (序列確認號碼：9 ) 基於此類胺基酸序列設計簡并化的引子，以及使用對 應至（i )和（i )，以及（iii ) 、 （ i )以及（iv ) 、（ i )，以及（v ) 、（ ii )和（ii )，以及（iv ) 、（ ii )和 (v ) 、 ( iii)、以及（i v ) 、 （ i i i )和（v )、以及（i v )和（v)各對之簡并化的引子進行簡并化的PCR。使用 瓊膠電泳分析法分離各PCR產物，以及剪下預期大小之 區域製備DN A。進一步的，雖然使用此製備的DNA作爲 模版進行嵌套式PCR，亦不能得到目標片段。 其後，參照用於產朊假絲酵母密碼子之頻率設計對應 至下列胺基酸序列之引子。 GSKKIQQ (序歹IJ確認號碼：6 ) EGGGNN (序列確認號碼：1 0 ) PQREGGG (序歹IJ確認號碼：1 1 ) 使用對應至胺基酸序列（vi )之引子（GGT TCY AAG AAG ATY CAR CA，序列確認號碼：12)與對應至 胺基酸序列（vii)之引子（CCA CCA CCY TCT CTY TGT GG，序列確認號碼：13 )進行PCR。進行PCR是使用 KOD Dash ( TOYOBO Co., Code LDP - 101)依據製造者 之指示反應條件爲94 °C，2分鐘，接著22個週期之反應 :94°C，1分鐘、55°C (各週期溫度降低〇.5°C ) ，1分鐘 、74°C，40秒以及15個週期之反應：94°C，1分鐘、50 °C，1 分鐘、7 4 °C，4 0 秒。 -21 - (19) (19)1343948 PCR產物是使用瓊膠電泳法分析（Nusieve 3:1，瓊脂 糖 3 %，1 X TAE 溶液，（Takara Shuzo Co.，Code F5 18 0A))。使用溴化乙錠溶液染色凝膠，然後剪下對 應至100至300驗基對之區域，以及使用MagExtractor (TOYOBO Co., Code NPK- 601 )從凝膠萃取 DNA» 使用此DNA作爲模版、設計對應區域（vi )之引子 (序列確認號碼：12 )以及對應至（viii )區域之引子（ GTT GTT ACC ACC ACC YTC，序列確認號碼：14 )進行 嵌套式PCR，在偵測到此區域之內對應至1〇〇至300鹼基 對之三個條帶。在說明如上之相同條件下進行PCR。各剪 下此三條帶以及從凝膠萃取各 DNA。各帶之DNA使用 DNA連接反應組套 Ver. 2 ( Takata Shuzo Co.)連結至 pGEM-T Easy vector (Promega Co.)以及轉形至大腸桿 菌 JM109 勝任細胞（Takara .Shuzo Co., Code 9052)。在 得到之轉形株中，得到一個含有預期編碼產朊假絲酵母穀 胱甘肽合成酶基因片段之轉形株。轉形株內插入之核苷酸 序列是用習見的方式測定。 基於上述測定之核苷酸序列，使用快速放大互補 DNA 端之 3 1 — RACE System ( Gibco BRL，Cat.No. 1 83 73 -027) ’快速的放大互補DNA之V端。使用Rnpasy Mini

Kit (QIAGEN Co.，Cat. No. 74104 )從產朊假絲酵母製 備傳訊RNA，以此傳訊RNA進行三次PCR製備互補DNA 股。使用之引子展示於下。 第一次 PCR: AAG ATA TAC CCA TTG GAT GG ( -22- (20) (20)1343948 序列確認號碼：15 )以及3' RACE組套內含之AUAP引子 〇 第二次 PCR: TCA GAT CTT GGT AAA GAG GC ( 序列確認號碼：16 )以及Y RACE組套內含之AUAP引子 第三次 PCR: AGA CTG GCA TTT GAG TCT CC (序 列確認號碼：17 )以及3' RACE組套內含之AUAP引子。 使用 KOD Dash ( TOYOBO Co., Code LDP-101 )依 據製造者之指示進行PCR，反應條件是94°C，2分鐘，接 著30週期之反應：94°C，1分鐘、50°C，30秒以及74 ，40 秒。 將PCR產物連結至pGEM-T Easy載體並轉形入大 腸桿菌。分析內含插入核苷酸序列之轉形株，硏判是否取 得產朊假絲酵母預期編碼穀胱甘肽合成酶之基因片段之資 料。 基於以上測定之核苷酸序列，使用GeneRacer Kit ( Invitrogen Co.，Cat.，No.L 1 502 - 01 )進行 5，RACE，而使 用 SuperSucript III RT ( Invitrogen Co., C at. N o . 1 8 0 8 0 — 044 )代替 SuperSucript Π組套進行反轉錄作用。以 Rneasy 迷你組套（QIAGEN.Co.，Cat.No_741〇4).從產朊假 絲酵母分離的傳訊RNA，合成第一股cDNA，以及然後進 行嵌套式PCR。 使用之引子展示於下。

製備互補 DNA之引子：TTG ACA CCA ACT CGG -23- (21) (21)1343948 AGA CAT CAG A (序列確認號碼：1 8 )

嵌套式 PCR : GAG AGT ACC TTC TCA TCC GTC AAG A (序列確認號碼：1 9 )，以及

GeneRacer5^套疊式的引子包含於組套內。 將PCR產物依據TOPO TA選殖方法連結至組套內之 PCR4-T0P0載體，以及用以轉形大腸桿菌。分析轉形株 內含之插入核苷酸序列，以及得到產朊假絲酵母推演之至 含有穀胱甘肽合成酶基因之基因片段。 基於上述得到的資料設計引子，進行PCR，以及測定 放大產物之核苷酸序列。使用 Pyrobest ( Takara Shuzo Co.)依據製造者之指示進行PCR，反應條件是98 °C * 2 分鐘，接著40週期之反應：98°C，20秒、55°C，30秒以 及7 2 °C，2分鐘。 使用之引子展示於下。 弓| 子 FI : TAG CCA ATA CAR.CCA GCA ACA C (序 列確認號碼：20) 弓| 子 R1 : GAA GGA ATT CTA ATT CGT GAG G (序 列確認號碼：2 1 ) 用習見的方法測定上述PCR放大產物的核苷酸序列 ，以及發現它和展示在序列確認號碼：1之核苷酸序列具 有一致性。此核苷酸序列推演之編碼的胺基酸序列展示於 序列確認號：2。從而，得到產朊假絲酵母穀胱甘肽合成 酶基因之同系物。 -24- (22) (22)1343948 <2>獲得編碼產朊假絲酵母γ-麩胺醯基半胱胺酸合成 酶推演之基因。 下列選擇的序列顯示釀酒酵母以及粟酒裂殖酵母Τ 一 麩胺醯基半胱胺酸合成酶胺基酸序列間高同源性之序列（ Ohtake et al., Yeast, 7 ( 9 ) :953-96 1 ( Dec., 1991); Mutoh et al., J. Biochem. ( Tokyo) , 1 1 7 ( 2 ) : 2 8 3-288 ( Feb., 1 995 ) ) ° MGFGMG (序列確認號碼：22 ) GWRVEFR (序歹IJ確認號碼：23 ) 基於各胺基酸序列設計簡并化的引子，以及進行簡并 化的 PCR。引子 FI ( ATG GGN TTY GGN ATG GG，序列 確認號碼：24 )是設計作爲對應至（iX )區域之引子，以 及引子 R1 (RAA YTC NAC NCK CCA，序列確認號碼： 25 )是設計作爲對應至對應至（X )區域之引子。使用 KOD Dash (TOYOBO Co., Code LDP-101)作爲 DNA 聚 合酶依據製造者之指示進行PCR，反應條件是94 °C，3分 鐘，接著30週期之反應：94°C，1分鐘、52°C，1秒以及 74°C，1 分鐘。 PCR產物是使用在瓊膠電泳法分析，剪下對應至預期 大小約700鹼基對之區域.，以及使用 MagEx tractor ( TOYOBO Co.，Code NPK-601)從凝膠萃取 DNA。 進一步的，使用萃取的DNA作爲模版進行嵌套式 PCR。在說明如上之相同方法下進行PCR。放大產物是使 用在瓊膠電泳法分析以及然後使用溴化乙錠溶液染色，剪 -25- (23) (23)1343948 下對應至約700驗基對之區域，以及使用MagExtractor 從凝膠萃取DNA。DNA是使用DNA連接反應組套Ver.2 (Takara Shuzo Co.)連結至 pGEM-T Easy 載體以及用 以轉形入大腸桿菌JM109勝任細胞。在得到之轉形株中 ，得到一個含有預期編碼產朊假絲酵母穀r -麩胺醯基半 胱胺酸合成酶基因片段之轉形株。轉形株內插入之核苷酸 序列是用習見的方式測定。 基於上述測定之核苷酸序列，使用快速放大互補 DNA 端之 3f — RACE System ( Gibco BRL )，進行 3，RACE 。使用Rneasy迷你組套從產朊假絲酵母製備的傳訊RNA 合成互補DNA第一股，以及進行PCR三次。 使用之引子展示於下。 第一次 PCR: TGA ACA GAG CTC GTT ACC TC (序 列確認號碼：26 )以及3’ RACE組套內含之AUAP引子 第二次 PCR: TCA TGG GCT AAT TTT GCA CC (序 列確認號碼：27 )以及3’ RACE組套內含之AUAP引子 第三次 PCR: TTC CTA GCA TTG ACG GCA GC (序 列確認號碼：28)以及Y RACE組套內含之AUAP引子 使用KOD Dash依據製造者之指示進行PCR，反應條 件是94°C，2分鐘，接著3.0週期之反應：94°C，1分鐘 、50°C，30秒以及74°C，40秒"將PCR產物連結至 pGEM- T Easy載體並轉形入大腸桿菌。分析內含插入核 苷酸序列之轉形株，硏判是否取得產朊假絲酵母預期的T -麩胺醯基半胱胺酸合成酶基因片段之資料。 -26- (24) (24)1343948 其後，基於之前說明的核苷酸序列進行5fRACE。用 於 5’RACE 系統之組套爲 Rapid Amplification of cDNA Ends Reagent Assembly Version 2.0 ( Gibco BRL )。 用於RT (反轉錄作用）製備互補DNA第一股之引子 展示於下。AGC ACC AGA AAT GAC GTT C (序列確 認號碼：2 9 ) 依據製造者指示以及下列引子使用構築之互補DNA 庫進行PCR三次。使用KOD Dash依據製造者之指示進行 PCR，反應條件是94°C，2分鐘，接著30週期之反應： 94°C，1 分鐘、50°C，30 秒以及 74°C，40 秒。 使用之引子展示於下》 第一次 PCR : CCA TCT G AC GAC ATC CTG CTG ( 序列確認號碼：30 )以及組套內含之AUAP引子 第二次 PCR : GTC AGC TAA GTG GCC TTT G (序 列確認號碼：3 1 )以及組套內含之AUAP引子 第三次 PCR: CAC TGG CGC TGC TGC CGT C (序 列確認號碼：32 )以及組套內含之AUAP引子 將PCR產物連結至pGEM~T Easy載體並轉形入大 腸桿菌。分析內含插入核苷酸序列之轉形株，硏判是否取 得產朊假絲酵母預期的γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酶基因 片段之資料。基於與其它生物體之同源性，考慮不選殖全 長，以及進一步的進行5'RACE。 用於RT製備互補DNA第一股之引子展示於下。 TGA TCT TCT GCT GTT CAT GTT (序列確認號碼 -27- :33) (25) 1343948 依據製造者指示使用構築之互補DNA庫進行PC R三 次。使用之引子展示於下。 第一次 PCR : CTC CAC GTA CAA GTA GTT CTC ( SEQ ID NO: 34)以及組套內含之AUAP引子 第二次 PCR: CAG CGA ATC ACC GTT GTA CGG ( SEQIDNO: 35)以及組套內含之AUAP引子

第三次 PCR : AGC CAG CGG TGT CGC CTC ( SEQ ID NO: 36)以及組套內含之AUAP引子 將PCR產物連結至pGEM-T Easy載體並轉形入大 腸桿菌。分析內含插入核苷酸序列之轉形株，硏判是否取 得產朊假絲酵母預期的γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酶基因 片段之資料。 基於上述得到的資料設計引子，進行PCR，以及測定 放大產物之核苷酸序列。使用 Pyrobest ( Takara Shuzo Co.)依據製造者之指示進行PCR，反應條件是98°C，2 分鐘，接著4 0週期之反應·· 9 8 °C，2 0秒、5 5 °C，3 0秒以 及72°C，2分鐘。 使用之引子展示於下。 弓| 子 F2 : GGG TTT GTT GTC TAT CGG CTT AAG ( 序列確認號碼：3 7 ) 引子 R2 : AGC TGT CTT GGT CGT CAT ATC CAT ( 序列確認號碼：3 8 ) 用習見的方法測定說明如上之PCR放大產物的核苷 -28- (26) (26)1343948 酸序列。結果展示於序列確認號碼：3。進一步的，此核 苷酸序列預期編碼之r -麩胺醯基半胱胺酸合成酶推演之 胺基酸序列展示於序列確認號碼：4。從而，得到產朊假 絲酵母T -麩胺醯基半胱胺酸合成酶基因之同系物。 在釀酒酵母之內表現上述確認之源自產朊假絲酵母7 -麩胺醯基半胱胺酸合成酶基因以及穀胱甘肽合成酶同系 物基因，以測定其功能。構築在釀酒酵母內載體表現各基 因之載體，將載體引入釀酒酵母，從而分析此同系物之功 能。 在具有降低的穀胱甘肽合成酶活性之釀酒酵母中，可 使用描述於W0 01/9 0310之釀酒酵母Να3品系。 Να 3株是從母株Να丨株（WO 01/90310)(其爲單倍 體的尿嘧啶-營養缺陷的釀酒酵母株）以編碼減弱之穀胱 甘肽合成酶基因取代穀晄甘肽合成酶基因索構築之細胞株 <3>獲得具有降低的r -麩胺醯基半胱胺酸合成酶活性 之釀酒酵母。 (1)產生取代GSH1基因之卡式盒 首先，將介於r -麩胺醯基半胱胺酸合成酶基因（序 列確認號碼：3 9 )中間區域至3 - 一終點之片段，使用上 述的Ναΐ株之染色體DNA作爲模版經PCR放大。使用 KODDash ( TOYOBO Co.)進行PCR以及將具有下列組 成之反應混合物依據製造者之指示在以下之條件下反應： (27) 1343948 94°C，1分鐘、接著30週期之反應：94°C，30秒、60°C ’ 40秒以及 74 °C，1分鐘。使用引子，GF1 (GTG GAC GAC CGT ACT CCG AAG，序列確認號碼：41)以及GR1 (ACC CAA ATC GAT AAT GTC AAC，序列確認號碼： 42 )。

將說明如上放大的GSH1基因片段依據製造者之指示 連結至質體 pGEM-T Easy ( Promega Co.)取得. GSH 1 dash/ pGEM。

其後，經定點突變，將對應至γ-麩胺醯基半胱胺酸 合成酶（序列確認號碼：40 )第3 7 2以及第3 7 3位置這胺 基酸之密碼子（絲胺酸以及離氨酸），用 GSHldash/ pG EM內r -麩胺醯基半胱胺酸合成酶基因（序列確認號 碼：39)之終止密碼子取代。此操作係使用Quick Change Site-Directed Mutagenesis ( Stratagene Co.)，依據製造 業者提供之實驗準則進行》使用之引子爲：QCF1 ( CTT TTC TTG GGT GGG TAG TAA TTT TTC AAT AGG ACT > 序列確認號碼：43 )以及 QCR1 ( AGT CCT ATT GAA AAA TTA CTA CCC ACC CAA GAA AAG，序列確認號碼 :44)。從而製作質體 GSHlMdash/pGEM。 上述引入突變γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酶後具有減 弱的酵素活性（減弱的穀胱甘肽合成酶，WO 01 /9 0310) 其後，將質體pYES2dash (從描述於WO 01/90310之 質體PYES2 ( Invitrogen Co.)去除2//複製起點得到之 -30- (28) (28)1343948 質體）以及上述的GSHlMdash/pGEM用限制酶Sadi以 及SphI水解。從pYES2dash剪下內含URA3基因之片段 ’從GSHlMdash/pGEM剪下內含局部的γ-麩胺醯基半 胱胺酸合成酶基因序列的區域，以及相互連結製備質體 GSHlMdash/ pYES2dash ° 將 G S Η1 M d a s h / p Y E S 2 da sh 用 限制酶Bbel水解取得基因取代之卡式盒（圖丨）。 (2)將GSH1基因取代卡式盒引入釀酒酵母 使用說明如上製作之基因取代卡式盒對Ναΐ株進行 7 _麩胺醯基半胱胺酸合成酶基因之基因取代。預先培養 ΝαΙ品系，以及將培養之品系接種於50毫升之YPD培養 液直到培養品系達成對數的生長相。將培養細胞懸浮於1 莫耳濃度山梨糖醇，混合基因取代卡式盒以及經電穿孔法 轉形。將轉形細胞株塗在內含1毫莫耳濃度谷胱甘肽之 SD平板以及選擇生長在其上之細胞株。經PCR証實，基 因取代卡式盒已在目標位置倂入染色體，以及得到之細胞 株是稱爲Ν 〇: 4中間株。其後，進行下列操作，在染色體 上僅留下突變之r -麩胺醯基半胱胺酸合成酶基因。將 Να4中間株培養在內含1毫莫耳濃度穀胱甘肽之YPD培 養液內，以及將培養物接種在內含1毫莫耳濃度穀胱甘肽 之SDFOA平板上。將生長在平板上之細胞株的7 —麩胺 醯基半胱胺酸合成酶基因定序以證實在目標位點之序列已 正確地被取代’以及得到Να4株（圖2)。 其後，檢查上述得到之Να4株其7 -麩胺醯基半胱 -31 - (29) (29)1343948 胺酸合成酶活性是否減弱。Ohtake et al.測量得自釀酒酵 母YNN27株經誘變處理之YH1株的r —麩胺醯基半胱胺 酸合成酶活性（Agric. Biol. Chem.，54 ( 1 2 ) : 3 1 45-3 1 5 0 (1 990 ))。依據此方法測量活性。結果，Να4株 麩胺醯基半胱胺酸合成酶活性是低於可偵測的限度。然後 ，將Να4株培養在SD培養液內，以及測定對數生長相的 細胞r -麩胺醢基半胱胺酸和穀胱甘肽之含量。然而，未 偵測到r -麩胺醯基半胱胺酸，以及穀胱甘肽之濃度是 0.01%。進一步的，由於Να4株對2毫莫耳濃度甲基乙 二醛具有敏感性，証實ΥΗ1品系之r -麩胺醯基半胱胺 酸合成酶基因已被取代。 <4>構築源自產朊假絲酵母穀胱甘肽合成酶同系物之表 現載體 使用產朊假絲酵母之染色體DNA作爲模版進行PCR ，放大產朊假絲酵母穀胱甘肽合成酶基因同系物（CGSH2 )之 ORF 區域。使用 Pyrobest ( Takara Shuzo Co.)依 據製造者之指示進行PCR，反應條件是98 °C，2分鐘，接 著40週期之反應：98°C，20秒、55°C，30秒以及72t： ，2 分鐘。使用 N —端引子 CGSH2F1 (AGA TTG GGT ACC ATG AGT ATT CCT CAG TTA TCT G，序列確認號碼 :45，其中添加ΚρηΙ水解位點），以及C —端引子 CGSH2R1 ( ATC CGG TCT AGA CTA TTG GAG AGC AAC A C C A T C ’序列確認號碼：4 6，其中添加X b a I水解位點 (30) (30)1343948 )，在上述條件下進行 PCR，以及放大產物是經使用 QIAquick PCR純化組套純化。將純化的PCR產物以及 pAUR123 載體（Takara Shuzo Co.)用限制酶 s ΚρηΙ 以及 Xbal水解，然後相互連結以及轉形入大腸桿菌jM109勝 任細胞。因此產生 CGSH2/pAUR123載體。其後，將 CGSH2/pAUR123載體與pYES2載體用限制酶BamHI水 解。從CGSH2/pAUR123製備內含GSH2 ORF之區域以 及源自pAUR 123載體之啓動子，連結至水解端去磷酸化 的PYES2載體，以及用以轉形大腸桿菌JM109勝任細胞 。因此，產生產朊假絲酵母穀胱甘肽合成酶同系物之表現 載體 CGSH2/pYES2 (圖 3)。 <5>構築源自產朊假絲酵母r -麩胺醯基半胱胺酸合成 酶同系物之表現載體 使用產朊假絲酵母之染色體DNA作爲模版進行PCR ，放大產朊假絲酵母r -麩胺醯基半胱胺酸合成酶基因同 系物（C G S Η ])之 Ο R F 區域。使用 P y r 〇 b e s t ( Takara Shuzo Co.)依據製造者之指示進行PCR，反應條件是98 °C，2分鐘，接著40週期之反應：98°C，20秒' 55°C， 30秒以及72t，2分鐘。使用N—端引子CGSHIFI ( GAG TAC GGT ACC ATG GGG CTG CTA TCA TTA GGG AC，序列確認號碼：47，其中添加Kpnl水解位點），以 及 C-端弓| 子 CGSHIR1 ( CCC TTA TCT AGA TTA AGC CTT TGG GTT GTT TAT C，序列確認號碼：4 8，其中添 -33- (31) (31)1343948 加Xbal水解位點），在上述條件下進行PCR，以及放大 產物是經使用 QIAquick PCR純化組套純化。將純化的 PCR產物以及pAUR123載體（Takara Shuzo Co.)用限制 酶s ΚρηΙ以及Xbal水解，然後相互連結以及轉形入大腸 桿菌JM109勝任細胞《因此產生CGSH丨/pAUR123載體 。其後，將CGSHl/pAUR丨23載體與pYES2載體用限制 酶 BamHI水解。從 C G S Η 1 / p AUR 1 23製備內含 GSH1 ORF之區域以及源自pAURi23載體之啓動子，連結至水 解端去磷酸化的pYES2載體，以及用以轉形大腸桿菌 JM 109勝任細胞。因此，產生產朊假絲酵母7 -麩胺醯基 半胱胺酸合成酶同系物之表現載體CGSHl/pYES2(圖4 < 6〉互補測驗 其後，弓I入CGSH1/ pYES2載體或者CGSH2/ pYES2 載體到Ν α 3株和Ν α 4株得到轉形株。預培養N(i3株或 者Να4株，接種至50毫升之液體培養液（內含1毫莫 耳濃度穀胱甘肽之YPD培養液）直到細胞達成對數的生 長相。將培養細胞懸浮於1莫耳濃度山梨糖醇，混合混合 CGSH1/PYES2載體或者CGSH2/pYES2載體以及經電 穿孔法轉形。將轉形細胞株培養在內含1毫莫耳濃度谷胱 甘肽之SD平板以及選擇生長在其上之細胞株。Να3株和 Na4株顯示尿嘧啶營養缺陷以及僅當內含 CGSH1 / pYES2載體或者CGSH2/pYES2載體時可生長在SD培養 -34- (32) (32)1343948 液內。使用習見的方式，得到之轉形株經証實含有 CGSHl/pYES2 載體或者 CGSH2/pYES2 載體。 因此，得到轉形株Na3/CGSH1株、Na4/CGSH1 株、Να 3/CGSH2 株和 Να 4/CGSH2 株。Να 3/CGSH1 顯示對2毫莫耳濃度甲基乙二醛具有敏感性’而Να 4/ CGSH1株對2毫莫耳濃度甲基乙二醛不具有敏感性。另 一方面，Ncr3/CGSH2株對2毫莫耳濃度甲基乙二醛不 具有敏感性，而Na4/CGSH2株對2毫莫耳濃度甲基乙 二醛具有敏感性。進一步的，當在SD培養液之內進行培 養，Na3/CGSH1株和Na4/CGSH2株在對數生長相時 幾乎不含穀胱甘肽，而Na4/CGSH1株和Na3/CGSH2 株內含0.4%穀胱甘肽。Να 3株由於在釀酒酵母之榖胱甘 肽合成酶發生突變，所以合成穀胱甘肽的能力降低’而 Να4株在釀酒酵母之r-麩胺醯基半胱胺酸合成酶發生 突變，所以合成穀胱甘肽的能力降低。因此，CGSH1互 補了釀酒酵母之γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酶，而CGSH2 互補了釀酒酵母之穀胱甘肽合成酶》 使用編碼穀胱甘肽合成酶部份的DNA，產生降低穀 胱甘肽合成酶活性之產朊假絲酵母的實施例展示於以下之 參考實施例。亦可用相似的方法使用包含序列確認號碼： 1編號58至981之核苷酸序列的DNA，或與序列確認號 碼：1編號58至981之核苷酸序列雜交的DNA或製備自 核苷酸序列在嚴格的條件下雜交的探針，製作降低穀胱甘 肽合成酶活性之產朊假絲酵母。 -35- (33) (33)1343948 <參考實施例1> 產生破壞產朊假絲酵母穀胱甘肽合成酶基因之卡式盒 〇

使用從產朊假絲酵母ATCC 1 5239製備的染色體DNA 作爲模版以及序列確認號碼S : 49以及50之引子進行 PCR。 使用Pyrobest ( Takara Shuzo Co.)依據製造者之指 示進行PCR，反應條件是98 °C，2分鐘，接著40週期之 反應：98°C，20秒、55°C，30秒以及72°C，2分鐘。 放大的產物使用 QIAQuick PCR純化組套（QIAGEN Co.，Cat· No. 28 1 06 )純化，以及在純化產物的端點添加 腺嗓玲以及連結至pGEM — T Easy載體。使用AmpliTaq (ABI，Code N808- 0161)以及 2.5 毫莫耳濃度 dATP 取 代dNTP進行反應在72°C，反應1 0分鐘添加腺嘌呤。其 後，使用 QuikChange定點突變組套核（STRATAGENE Co.，Catalog #200518)在選殖片段的二個位點經定向位 點重組取代苷酸序列，引入Hindi 11以及Kpnl水解位點以 及從而得到CGSH2Ctermi/pGEMT~Easy載體。定向位 點重組使用之引子展示於下。 [第一次引入之突變（引入Hindlll水解位點）] GAA GCC TCA GCA TGA AGC TTG TGG TAA TAA CAT TTA C (序歹IJ確認號碼：51 ) -36- (34) (34)1343948

G TAA ATG TTA TTA CCA CAA GCT TCA TGC TGA GGC TTC (序列確認號碼：52 ) [第二次引入之突變（引入Kpnl水解位點）] CGA CCA ATC GAC TGG TAC CGT TAT CAA AAA CTC TG (序列確認號碼：53 ) C A GAG TTT TTG ΑΤΑ ACG GTA CCA GTC GAT TGG TCG (序列確認號碼：54) 進一步的，使用從產朊假絲酵母ATCC15239製備的 染色體DNA作爲模版以及下列引子進行PCR，放大內含 URA3 基因之片段。使用 KOD Dash ( TOYOBO Co., Code LDP—101)依據製造者之指示進行PCR，反應條件是94 °C，2分鐘，接著30週期之反應：94°C，1分鐘' 54°C， 30秒以及74°C，40秒。 CCC AAG CTT CTC TAC TTG CTT CTG CTC AAC ( 序列確認號碼：5 5 ) GCA GGT ACC AAC TTC CGA AAA CAG TAA TGA AC (序列確認號碼：56 ) 將放大產物連結至pGEMT-Easy載體取得CURA3/ pGEMT — Easy 載體。 . 將 CGSH2Ctermi / pGEMT - Easy 載體和 CURA3/ pGEMT - Easy載體是各自用Hindlll以及ΚρηΙ水解。從 CGSH2Ctermi / pGEMT - Easy 載體，以及從 CURA3/ pGEMT— Easy載體製備內含CURA3之片段，製備內含 -37- (35) (35)1343948 CGSH2以及pGEMT_ Easy之主要部份片段。將製備的片 段相互連結以及用以轉形大腸桿菌 JM 109。因此，製作 CURA3ACGSH2/pGEMT- Easy 載體》 使用限制酶Notl水解之 CURA3ACGSH2/pGEMT — Easy載體作爲模版以及序列確認號碼S : 49以及50之引 子進行PCR放大。因此，製作破壞產朊假絲酵母穀胱甘 肽合成酶基因之卡式盒（圖5以及6)。 <參考實施例2 >獲得尿嘧啶營養缺陷的產朊假絲酵母 ATCC 1 523 9ura 細胞株 以習見的方法得到源自 ATCC15239之尿嘧啶—營養 缺陷的細胞株，稱爲ATCC15239ura細胞株（Luis et al.， refer to FEMS Microbiology Letters 1 65, 3 3 5 -3 40 ( 1 9 9 8 )之技術）。由於 ATCC 1 52 3 9ura細胞株可被以下之 URA3基因互補，該細胞株預期是ura3突變株。 <參考實施例3>獲得源自產朊假絲酵母之產生r -麩胺 醯基半胱胺酸的酵母菌（ATCC 1 5239Agsh2細胞株） 首先將ATCC 1 5239ura細胞株在30°C、含YPD培養 液之試管培養過夜。將培養物接種入含培養液之YPD燒 瓶（500毫升之Sakaguch丨燒瓶，培養液爲50毫升）以及 3 0 °C、搖動下培養。收集對數生長相的細胞以及用冷卻至 4°C之1莫耳濃度山梨糖醇溶液淸洗三次。將淸洗的細胞 懸浮於冷卻的1莫耳濃度山梨糖醇溶液。懸浮液中添加 -38- (36) (36)1343948 50微升（2微克）之穀胱甘肽合成酶基因破壞卡式盒，在 〇_2公分比色皿內混合以及使用Gene Pulser System ( BioRad Co.):阻抗200Ω、電容125eF以及設定電壓 1.5 kV，進行電穿孔法。將1毫升冷卻的1莫耳濃度山梨 糖醇倒至比色皿，以及將比色皿在冰上冷卻1〇分鐘。將 懸浮液塗抹於SD板以及在30°C下培養。 將生長在平板的細胞株複製到一個 SD平板，以及 SD平板內含10毫莫耳濃度甲基乙二醛，以及在30°C下 培養》選擇7個對甲基乙二醛敏感的株。在30 °C、含 YPD培養液之試管中搖動培養此7個細胞株過夜。將2% 含量的培養物接種入含培養液之 YPD燒瓶（500毫升之 Sakaguchi燒瓶，培養液爲50毫升）以及30°C、搖動下 培養。收集對數生長相之細胞以及用滅菌水淸洗兩次。淸 洗的細胞用熱水在70°C下萃取1〇分鐘，以及從酵母菌細 胞萃取液分離γ -麩胺醯基半胱胺酸以及經HPLC定量。 進一步的將內含某些含量培養液的淸洗酵母菌細胞置於濾 紙上以及在1 05 °C下加熱4小時，這測量殘留乾酵母菌重 量之細胞重量。 因此，得到之朊假絲酵母ATCC15239Agsh2株，於使 乾燥酵母菌細胞中內含1%或更多之r-麩胺醯基半胱胺 酸基。 將ATCC152390gsh2株接種入SD培養液以及在30°c 下搖動培養2天。將濃度2%之培養液接種入SD培養液 以及在30°C下搖動培養。7小時以及9小時之後，測量之 •39- (37) (37)1343948 r-胺醯基半胱胺酸內量分別是1.08%以及1.12%。穀 胱甘肽含量是低於可偵測的限度。 〈參考實施例4>測量ATCC1 52390gsh2株系穀胱甘肽合 成酶之活性 將ATCC 1 52390gsh2株接種在YPD培養液內以及在 3 〇°C下搖動培養。將濃度2%之培養液接種入SD培養液 (2 -升之錐形瓶，裝入400毫升培養液）以及在30°C下 搖動培養。收集對數生長相的細胞以及用冷卻至4 °C之1 莫耳濃度山梨糖醇淸洗兩次。將淸洗細胞懸浮於0.5毫升 內含0.1毫莫耳濃度苯基甲磺醯基氟（PMSF)之10毫莫 耳濃度Tr i s - H C 1緩衝液（酸鹼度7.5 )。懸浮液中添加 玻璃珠(GLASS BEADS 425-600 Microns Acid-Washed (SIGMA.Co., Code G-8772 ))，以及使用 BEAD-BEATER ( WAKENYAKU C o.)破細胞。用顯微鏡証實細 胞已被破壞。然後，添加1毫升之上述的緩衝液，以及經 離心移除玻璃珠及細胞碎片。因此，得到粗細胞萃取物。 使用 ULTRAFREE-15 Biomax 10 ( MILLIPORE Co.,

Cat.No.UFV2BGC40 )純化粗細胞萃取物得到酵素溶液。 經Bradford方法定量酵素溶液之蛋白質含量。.使用蛋白 質分析 CBB 溶液（Nakarai Co.，Code 29449- 1 5 )獲得展 開之顏色，以及測量5 95毫微米之吸光度。使用標準白蛋 白（PIERCE Co·, No. 23210)產生標準曲線。 上述酵素溶液之穀胱甘肽合成酶活性可使用以下 -40- (38) (38)1343948

Gushima et al. ( T. Gushima et al., J . Appl. Biochem.， 2 1 0 ( 1 983 ))之方法測量。 [反應混合物] 〗〇〇毫莫耳濃度 γ-麩胺醯基半胱氨酸 100毫升 1〇〇毫莫耳濃度 MgCl2 1 〇〇毫升 5 〇毫莫耳濃度. ATP 1 〇〇毫升 100毫莫耳濃度 Gly 1〇〇毫升 1莫耳濃度Tris _ HC1 (酸鹸 8.0 ) 85.5毫升 160毫莫耳濃度 PEP 12.5毫升 1毫克/毫升PK 2毫升 酵素溶液（1至 l 〇毫克蛋白質） 純化水 總共 2毫升 PEP :磷（酸） 烯醇丙酮酸（SIGMA Co., Code Ί 7 1 27 ) PK:丙酮酸激酶（SIGMA Co.，Code P-1903) 將具有上述組成物之反應混合物在酵素存在下（含量 1至10毫克蛋白質）、30°C下反應0至2小時。反應混 合物中添加1/5當量之異丁烯酸以終止反應以及然後將 酸鹼度調至8.0，以及測定GSH之產量。此時酵素活性是 低於可偵測的限度無法偵測。 其後，用同樣方法測量A T C C 1 5 2 3 9株（ ATCCl5239 0gsh2之母株）之穀胱甘肽合成酶活性。結果 -41 - (39) (39)1343948 ATCC 1 5239株之穀胱甘肽合成酶活性是〇·3 83微莫耳_ GSH/毫克蛋白質/小時。從而得到一種產朊假絲酵母， 其係經本發明之DNA修飾之產朊假絲酵母，使其帶有之 穀胱甘肽合成酶活性爲0.003微莫耳GSH /毫克蛋白質/ 小時或更低。 工業用途 本發明提供產朊假絲酵母之穀胱甘肽合成酶基因以及 r -麩胺醯基半胱胺酸合成酶基因。可用於改進食品之風 味以及味覺等等酵母菌之萃取物，可使用產朊假絲麵包酵 母經使用本發明基因在低成本下產生。 本發明已參照其較佳的具體實施例詳細描述，熟悉此 技藝的專業人士可對它作出各種相當之改變，而不脫離本 發明之範圍。上述的各文件，包括外國優先權的文件， JP 2003 -3 1 0084，全文在此并入參考文獻。 【圖式簡單說明】 圖1顯示構築釀酒酵母取代7 -麩胺醯基半胱胺酸合 成酶基因之卡式盒。 圖2顯示構築釀酒酵母之.N a 4品系》 圖3顯示構築產朊假絲酵母穀胱甘肽合成酶基因之表 現載體。 圖4顯示構築產朊假絲酵母r -麩胺醯基半胱胺酸合 成酶基因之表現載體。 圖5顯示構築破壞產朊假絲酵母穀胱甘肽合成酶基因 -42- (40) 1343948 (前半段）之卡式盒。 圖6顯示構築破壞產朊假絲酵母穀胱甘肽合成酶基因 (後半段）之卡式盒。 -43- 1343948 序列表 <110〉味之素股份有限公司 <120〉編碼源自產朊假絲酵母之縠胱甘肽合成酶的基因 <130> <150> JP2003-310084 <151> 2003/09/02 <160> 56 <17〇> Patentln版3.1

<210> 1 <211> 1571 <212> DNA <213〉產朊假絲酵母 <220> <221〉CDS <222> (58)..(1485) <223〉 <400> 1 aagtagccaa tacaaccagc aacacatccg cttgcttgag cgttgagatt gtgaaag atg agt att cct cag tta tct gag ggc cag gag gat gat ctg gtc cat

Met Ser lie Pro Gin Leu Ser Glu Gly Gin Glu Asp Asp Leu Val His 15 10 15 gca ttg cac cac tat gcc eta tcc aat ggg ttg gtg atg tat cca gtt

Ala Laj His His Tyr Ala Leu Ser Asn Gly Leu Val Met Tyr Pro Val 20 25 30 gga ttt aag cca cac tcc cca gtc get get cca gta aeg ttg tac cca

Gly Fhe Lys Pro His Ser Pro Val Ala Ala Pro Val Thr Leu Tyr Pro 35 40 45 aca cca ttc cct caa cag geg ttt gag aag gcc cag atg gta cag gag

Thr Pro Phe Fro Gin Gin Ala Phe Glu Lys Ala Gin Met Val Gin Glu 50 55 60 57 105 153 201 249 2971343948 aag ttc aat gaa etc tac get aag gtc teg agt gat gtt gag tgg ctg Lys Phe Asn Glu Leu Tyr Ala Lys Val Ser Ser Asp Val Glu Trp Leu 65 70 75 80 agt get gtt tta gac teg ttt gee caa ttc gat gca gga ttc acc ggt Ser Ala Val Leu Asp Ser Phe Ala Gin Phe Asp Ala Gly Phe Thr Gly 85 90 95 aag eta tgg gag agt tac aag aag gca aag gaa att ggc att aag caa Lys Leu Trp Glu Ser Tyr Lys Lys Ala LVs Glu lie Gly lie Lys Gin 100 105 110 age gtt tee etc ggt gtc ttt aga teg gac tat atg ett gat cat gac Ser Val Ser Leu Gly Val Phe Arg Ser Asp Tyr Met Leu Asp His Asp 115 120 125 caa ate aag cag gtt gaa ttc aac ace gtc agt gtg age ttt gga gga Gin lie Lys Gin Val Glu Phe Asn Thr Val Ser Val Ser Phe Gly Gly 130 135 140 eta age acc aaa gtt ggt gat ttg cac aag tac ttg aat gac tet ggt Leu Ser Thr Lys Val Gly Asp Leu His Lys Tyr Leu Asn Asp Ser Gly 145 150 155 160 tac tac aca agt agt get tea aag ttc tat aca gac gag aca ate ccg Tyr Tyr Thr Ser Ser Ala Ser Lys Fhe Tyr Thr Asp Glu Thr lie Pro 165 170 175 gtg tet gaa tet tet gta aag ett gca gat ggt tta get gat ggt gtt Val Ser Glu Ser Ser Val Lys Leu Ala Asp Gly Leu Ala Asp Gly Val 180 185 190 aag cac tat aac aag age cag ggc acc aag gat acc gtt gtg ett gtt Lys His Tyr Asn Lys Ser Gin Gly Thr Lys Asp Thr Val Val Leu Val 195 200 205 att gtt caa gaa ggt gag cgt aat gtc ttt gat caa cgt cat ttg gaa lie Val Gin Glu Gly Glu Arg Asn Val Phe Asp Gin Arg His Leu Glu 210 215 220 tac tea ctg tta aaa aac cac gga ate gta tea cgt cgt ate aeg tta Tyr Ser Leu Leu Lys Asn His Gly lie Val Ser Arg Arg lie Thr Leu 225 230 235 240 cat gag ett aca gat aag act cgt gtt gac cat gac cgt cgt ttg ttc His Glu Leu Thr Asp Lys Thr Arg Val Asp His Asp Arg Arg Leu Phe 245 250 255 ctg aac age aeg gat gag gaa gta tea gtt gtg tac ttt aga tee gga Leu Asn Ser Thr Asp Glu Glu Val Ser Val Val Tyr Phe Arg Ser Gly 260 265 270 tat gca cca aca gac ttc aaa act gac cag gat tgg aca aac cgt gta Tyr Ala Pro Thr Asp Phe Lys Thr Asp Gin Asp Trp Thr Asn Arg Val 345 393 441 489 537 585 633 681 729 iU) 777 · 825 873 921 275 280 285 acg ttg gag act aca ttg gcc ate aag get cct tea ttg ctg acc cag 969

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Leu Ser Gly Ala Lys Lys lie Gin Gin lie Leu Thr Asp Glu Lys Val 305 310 315 320 etc tcc aag ttt att aag tet gat gtc ttc gag ttg gtg tea aca ttt 1065

Leu Ser Lys Phe lie Lys Ser Asp Val Ser Glu Leu Val Ser Thr Phe 325 330 335 gtc aag ata tac cca ttg gat ggt tea gat ett ggt aaa gag get aaa 1113

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Arg Ser lie Pro Glu Asp Glu Trp Gin Gly Tyr He Leu Met Gin Leu 385 390 395 400 ate cat cca cct ctg aat aag aat aaa etc gtc cgt gag ggt gag gta 1305

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<210> 2 <211> 475 <212> PRT <213〉產朊假絲酵母 <400> 2

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Leu Ser Thr Lys Val Gly Asp Leu His Lys Tyr Leu Asn Asp Ser Gly 145 150 155 160

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Leu Ser Gly Ala Lys Lys lie Gin Gin lie Leu Thr Asp Glu Lys Val 305 310 315 320

Leu Ser Lys Phe lie Lys Ser Asp Val Ser Glu Leu Val Ser Thr Phe 325 330 335

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Gly Phe Gly Cys Val Asp Gly Val Ala Leu Gin 465 470 475

<210> 3 <211> 2224 <212〉眺 <213>產朊假絲酵母 <220> <221> CDS <222> (110).· (2101) <223> <400> 3 gggtttgttg tctatcggct taaggtttag tcgggaggaa caagaagcga cacacacagc 60 gaaccgacac acttgggaac ccattgctta agctattgag taccatacg atg ggg ctg 118

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55 60 65 agt ate gat aag gac age gta ttg get gat etc aac gag ggc gga tea 358

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Lys Arg Arg Gly Glu Lys Val Ala lie Asn Val Pro Leu Tyr Lys Asp 200 205 210 aca aat aeg tta tee att gac gag tea att cca aag gga ege tee ctg 790 -6- 1343948

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Fhe Lys His Asp Glu Glu Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Pro Gly His 230 235 240 ata tac atg gac tcc atg gga ttc ggt atg gga tgc tea tgt eta caa 886 lie Tyr Met Asp Ser Met Gly Rie Gly Met Gly Cys Ser Cys Leu Gin 245 250 255 gta aca gtg caa gca cca aac ttg aac aga get cgt tac etc tat gat 934

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Ser Trp Ala Asn Phe Ala Pro Leu Phe Leu Ala Leu Thr Ala Ala Ala 280 285 290 cca gtg ttc aaa ggc cac tta get gac cag gat gtc aga tgg aac gtc 1030

Pro Val Phe Lys Gly His Leu Ala Asp Gin Asp Val Arg Trp Asn Val 295 300 305 att tet ggt get gtt gat gat cgt act gcc tac gag cgt gat gtt aag 1078 lie Ser Gly Ala Val Asp Asp Arg Thr Ala Tyr Glu Arg Asp Val Lys 310 315 320 cct ctg cat age gat ggc gca ttt ggt gga atg aca gac gaa gcc aaa 1126

Pro Leu His Ser Asp Gly Ala Fhe Gly Gly Met Thr Asp Glu Ala Lys 325 330 335 get egg get cag aag ate cct aaa tet cgt tac gat ggc ate gat tet 1174

Ala Arg Ala Gin Lys lie Pro Lys Ser Arg Tyr Asp Gly lie Asp Ser 340 345 350 355 ttc ett ggt gat att cag aac gat ttc gca aaa gat ggg gaa gca gtg 1222

Fhe Leu Gly Asp lie Gin Asn Asp Phe Ala Lys Asp Gly Glu Ala Val 360 365 370 ttc aag tac ttc tet cca gag ttg aac gac ate age cct cca ate aac 1270

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Phe Ser lie Phe lie Val Leu Leu Gly Gin Ala lie Leu Ala Thr Asp 485 490 495

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<210> 4 <211> 664 <212> PRT

<213〉產K假絲酵母 <400> 4

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Glu Ala Val Phe Lys Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Asn Asp lie Ser Pro 370 375 380

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Asn Ala Ala Phe Ser lie Phe lie Val Leu Leu Gly Gin Ala lie Leu 485 490 495

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Leu Asp Glu lie Val Asn Gly Cys Asp Ser Phe lie Gly Leu Met Ala 545 550 555 560

Leu Val Lys Lys His Leu Glu Ser Arg Phe Gly lie Thr Gly Asp Asp 565 5.70 575

Leu Ser Pro Lys Gly Thr His Ala Arg lie Tyr Tyr Tyr Leu Glu Leu 580 585 590 lie Ser Lys Arg Ala Ser Gly Glu Leu Pro Thr Ala Ala Lys Phe lie 595 600 605

Arg Arg Phe Leu Leu Asp His Lys Asp Tyr Gin His Asp Ser Lys lie 610 615 620

Thr Ala Arg Met Asn Tyr Asp Leu Leu Asn Thr Leu Asn Ser lie Ser 625 630 635 640

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<210> 5 <211〉 9 <212> PRT <213〉產阮假絲酵母 <400> 5

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<210> 6 <211> 7 <2]2> PRT <213〉產阮假絲酵母 <400> 6

Gly Ser Lys Lys lie Gin Gin 1 5 <210> 7 -11 - 1343948

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Val Leu Lys Pro Gin Arg Glu Gly Gly Gly Asn Asn 1 5 10

<210> 8 <211> 8 <212> PRT <213〉產阮假絲酵母 <400> 8

He Ser Glu Leu Gly lie Tyr Gly 1 5 <210> 9 <211〉 7 <212> PRT <213〉產朊假絲酵母

<400> 9

Gly Gly Val Ala Ala Gly Phe 1 5 <210> 10 <21I> 6 <212> PRT <213〉產朊假絲酵母 <400> 10

Glu Gly Gly Gly Asn Asn 1 5 -12- 1343948

<210〉 11 <211> 7 <212> PRT <213〉產阮假絲酵母 <400> 11

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<210> 12 <211> 20 <212> im 人造的 <220> <223>引子 <400> 12 ggttcyaaga agatycarca 20

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<210〉 20 <211> 22 <212> DNA <213〉人造的 <220> <223〉引子 <400> 20 iagccaatac aaccagcaac ac <210> 21 <211> 22 •15- 22 1343948 <212> DNA <213〉人造的 <220> <223〉引子 <400> 21 gaaggaattc taattcgtga gg <210> 22 <211〉 6 <212〉 m <213〉 產朊假絲酵母 <400> 22

Met Gly Phe Gly Met Gly

Gly Trp Arg Val Glu Phe Arg 1 5 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> 產朊假絲酵母 <400> 23 <210〉 24 <211> 17 <212〉 DNA <213〉 人造的 <220> <223> 引子 <220〉 1343948 <221> misc.feature <222> ⑹ <223> η = a, t, g or <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n = a, t, g or <400> 24 atgggnttyg gnatggg <210> 25 <211> 15 <212> m <213> 人造的 <220> <223> 引子 <220〉 <221〉 misc_feature <222〉 ⑺ <223> η = a, t, g < <220> <221> misc_feature <222> (10) <223〉 n = a, t, g i <400> 25 raaytcnacn ckcca <210> 26 <211〉 20 <212> DNA <213> 人造的 <220> <223〉 <223〉1343948 <400> 26 tgaacagagc tcgttacctc <210〉 27 <211> 20 <212> DNA <213〉人造的 <220〉 <223〉引子 <400> 27 tcatgggcta attttgcacc <210> 28 <211〉 20 <212> DNA <213〉人造的 <220> <223>引子 <400> 28 ttcctagcat tgacggcagc <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213〉人造的 <220> <223〉引子 <400> 29 agcaccagaa atgacgttc 1343948 <210〉 30 <211> 21 <212> DNA <213〉人造的 <220> <223〉引子 <400> 30 ccatctgacg acatcctgct g <210〉 31 <211〉19. <212> m <213〉人造的 <220> <223〉引子 <400> 31 gtcagctaag tggcctttg <210> 32 <211> 19 <212> m <213〉人造的 <220> <223〉引子 <400> 32 cactggcgct gctgccgtc 19

<210> 33 <211> 21 <212> DNA <213〉人造的 -19- 19 1343948 <220> <223〉引子 <400> 33 tgatcttctg ctgttcatgt t <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213〉人造的 <220> <223〉引子 <400> 34 ctccacgtac aagtagttct c <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213〉人造的 <220> <223〉引子 <400> 35 cagcgaatca ccgttgtacg g <210> 36 <211〉 18 <212> DNA <213〉人造的 <220〉 <223>引子 <400> 36 1343948 18 24

agccagcggt gtcgcctc <210> 37 <211〉 24 <212> DNA <213；>人造的 <220> <223〉引子 <400> 37 gggtttgttg tctatcggct taag <210> 38 <211〉 24 <212> DNA <213〉人造的 <220〉 <223〉引子 <400> 38 agctgtcttg gtcgtcatat ccat 24 <210> 39 <211> 2160 <212> DNA <213> _酒酵母 <220〉 <221> CDS <222> (1).. (2034) <223> <400> 39 atg gga etc tta get ttg ggc aeg cct ttg cag tgg ttt gag tet agg 48

Met Gly Leu Leu Ala Leu Gly Thr Pro Leu Gin Trp Phe Glu Ser Arg 15 10 15

-21 - 1343948 acg tac aat gaa cac ata agg gat gaa ggt ate gag cag ttg ttg tat 96

Thr Tyr Asn Glu His lie Arg Asp Glu Gly lie Glu Gin Leu Leu Tyr 20 25 30 att ttc caa get get ggt aaa aga gac aat gac cct ett ttt tgg gga 144 lie Phe Gin Ala Ala Gly Lys Arg Asp Asn Asp Pro Leu Phe Trp Gly 35 40 45 gac gag ett gag tac atg gtt gta gat ttt gat gat aag gag aga aat 192

Asp Glu Leu Glu Tyr Met Val Val Asp Phe Asp Asp Lys Glu Arg Asn 50 55 60 tet atg etc gac gtt tgc cat gac aag ata etc act gag ett aat atg 240

Ser Met Leu Asp Val Cys His Asp Lys lie Leu Thr Glu Leu Asn Met 65 70 75 80 gag gat teg tee ett tgt gag get aac gat gtg agt ttt cac cct gag 288

Glu Asp Ser Ser Leu Cys Glu Ala Asn Asp Val Ser Phe His Pro Glu 85 90 95 tat ggc egg tat atg tta gag gca aca cca get tet cca tat ttg aat 336

Tyr Gly Arg Tyr Met Leu Glu Ala Thr Pro Ala Ser Pro Tyr Leu Asn 100 105 110 tac gtg ggt agt tac gtt gag gtt aac atg caa aaa aga cgt gee att 384

Tyr Val Gly Ser Tyr Val Glu Val Asn Met Gin Lys Arg Arg Ala He 115 120 125 gca gaa tat aag eta tet gaa tat geg aga caa gat agt aaa aat aac 432

Ala Glu Tyr Lys Leu Ser Glu Tyr Ala Arg Gin Asp Ser Lys Asn Asn 130 135 140 ttg cat gtg ggc tee agg tet gtc cct ttg acg ctg act gtc ttc ccg 480

Leu His Val Gly Ser Arg Ser Val Pro Leu Thr Leu Thr Val Fhe Pro 145 150 155 160 agg atg gga tgc ccc gac ttt att aac att aag gat ccg tgg aat cat 528

Arg Met Gly Cys Pro Asp Phe lie Asn lie Lys Asp Pro Trp Asn His 165 170 175 aaa aat gee get tee agg tet ctg ttt tta ccc gat gaa gtc att aac 576

Lys Asn Ala Ala Ser Arg Ser Leu Phe Leu Pro Asp Glu Val lie Asn 180 185 190 aga cat gtc agg ttt cct aac ttg aca gca tee ate agg acc agg cgt 624

Arg His Val Arg Phe Pro Asn Leu Thr Ala Ser lie Arg Thr Arg Arg 195 200 205 ggt gaa aaa gtt tgc atg aat gtt ccc atg tat aaa gat ata get act 672

Gly Glu Lys Val Cys Met Asn Val Pro Met Tyr Lys Asp lie Ala Thr 210 215 220 cca gaa acg gat gac tee ate tac gat ega gat tgg ttt tta cca gaa 720

Pro Glu Thr Asp Asp Ser He Tyr Asp Arg Asp Trp Phe Leu Pro Glu -22- 1343948 225 230 235 240 gac aaa gag gcg aaa ctg get tee aaa ccg ggt ttc att tat atg gat 768

Asp Lys Glu Ala Lys Leu Ala Ser Lys Pro Gly Phe lie Tyr Met Asp 245 250 255 tee atg ggt ttt ggc atg ggc tgt teg tgc tta caa gtg acc ttt cag 816

Ser Met Gly ?he Gly Met Gly Cys Ser Cys Leu Gin Val Thr Phe Gin 260 265 270 gca ccc aat ate aac aag gca cgt tac ctg tac gat gca tta gtg aat 864

Ala Pro Asn lie Asn Lys Ala Arg Tyr Leu Tyr Asp Ala Leu Val Asn 275 280 285 ttt gca cct ata atg eta gee ttc tet gee get gcg cct get ttt aaa 912

Phe Ala Pro lie Met Leu Ala Phe Ser Ala Ala Ala Pro Ala Phe Lys 290 295 300 ggt tgg eta gee gac caa gat gtt cgt tgg aat gtg ata tet ggt gcg 960

Gly Trp Leu Ala Asp Gin Asp Val Arg Trp Asn Val lie Ser Gly Ala 305 310 315 320 gtg gac gac cgt act ccg aag gaa aga ggt gtt gcg cca tta eta ccc 1008

Val Asp Asp Arg Thr f^ro Lys Glu Arg Gly Val Ala Pro Leu Leu Pro 325 330 335 aaa tac aac aag aac gga ttt gga ggc att gee aaa gac gta caa gat 1056

Lys Tyr Asn Lys Asn Gly Phe Gly Gly lie Ala Lys Asp Val Gin Asp 340 345 350 aaa gtc ett gaa ata cca aag tea aga tat agt teg gtt gat ett ttc 1104

Lys Val Leu Glu lie Pro Lys Ser Arg Tyr Ser Ser Val Asp Leu Phe 355 360 365 ttg ggt ggg teg aaa ttt ttc aat agg act tat aac gac aca aat gta 1152

Leu Gly Gly Ser Lys Phe Phe Asn Arg Thr Tyr Asn Asp Thr Asn Val 370 375 380 cct att aat gaa aaa gta tta gga ega eta eta gag aat gat aag gcg 1200

Pro lie Asn Glu Lys Val Laj Gly Arg Leu Leu Glu Asn Asp Lys Ala 385 390 395 400 cca ctg gac tat gat ett get aaa cat ttt gcg cat etc tac ata aga 1248

Pro Leu Asp Tyr Asp Leu Ala Lys His Phe Ala His Leu Tyr lie Arg 405 410 415 gat cca gta tet aca ttc gaa gaa ctg ttg aat cag gac aac aaa aeg 1296

Asp Pro Val Ser Thr Rie Glu Glu Leu Leu Asn Gin Asp Asn Lys Thr 420 425 430 tet tea aat cac ttt gaa aac ate caa agt aca aat tgg cag aca tta 1344

Ser Ser Asn His Phe Glu Asn lie Gin Ser Thr Asn Trp Gin Thr Leu 435 440 445 cgt ttt aaa ccc ccc aca caa caa gca acc ccg gac aaa aag gat tet 1392 -23- 1343948

Arg Phe Lys Pro Pro Thr Gin Gin Ala 450 455 cct ggt tgg aga gtg gaa ttc aga cca

Pro Gly Trp Arg Val Glu Phe Arg Pro 465 470 ttt gag aac get geg tat tee gtg etc

Hie Glu Asn Ala Ala Tyr Ser Val Leu 485 att ttg acc ttt tee gat aat att aac lie Leu Thr Phe Ser Asp Asn lie Asn 500 505 gta tgg gaa aat atg aag ata gee cat

Val Trp Glu Asn Met Lys lie Ala His 515 520 gaa aaa ttt cat tgg aaa aaa tea ttt

Glu Lys Phe His Trp Lys Lys Ser Phe 530 535 act gaa gat tat tet ata age gag att

Thr Glu Asp Tyr Ser lie Ser Glu lie 545 550 ata ttt cct caa ttt gtt aeg cca ate lie Phe Pro Gin Phe Val Thr Pro He 565 acc aaa gat tgg aaa gaa tta aag cat

Thr Lys Asp Trp Lys Glu Leu Lys His 580 585 tac tat tat tta aag eta att tet gat

Tyr Tyr Tyr Leu Lys Leu lie Ser Asp 595 600 aca aca gca aaa ttc ttt aga aat ttt

Thr Thr Ala Lys Phe Phe Arg Asn Phe 610 615 aaa cat gat tea aaa att tea aag teg

Lys His Asp Ser Lys lie Ser Lys Ser 625 630 aeg tgt gat aga ett acc cat tta gac

Thr Cys Asp Arg Leu Thr His Leu Asp 645 tee ttt tta gga get gaa att gca gaa

Ser Phe Leu Gly Ala Glu lie Ala Glu 660 665

Thr Pro Asp Lys Lys Asp Ser 460 ttt gaa gtg caa eta tta gat 1440 Fhe Glu Val Gin Leu Leu Asp 475 480 ata tac ttg att gtc gat age 1488 lie Tyr Leu lie Val Asp Ser 490 495 gca tat att cat atg tee aaa 1536 Ala Tyr lie His Met Ser Lys 510 cac aga gat get ate eta ttt 1584 His Arg Asp Ala lie Leu Phe 525 ege aac gac acc gat gtg gaa 1632 Arg Asn Asp Thr Asp Val Glu 540 ttc cat aat cca gag aat ggt 1680 Phe His Asn Pro Glu Asn Gly 555 560 eta tgc caa aaa ggg ttt gta 1728 Leu Cys Gin Lys Gly Phe Val 570 575 tet tee aaa cac gag aga eta 1776 Ser Ser Lys His Glu Arg Leu 590 aga gca age ggt gaa ttg cca 1824 Arg Ala Ser Gly Glu Leu Pro 605 gta eta caa cat cca gat tac 1872 Val Leu Gin His Pro Asp Tyr 620 ate aat tat gat ttg ett tet 1920 He Asn Tyr Asp Leu Leu Ser 635 640 gat tea aaa ggt gaa ttg aca 1968 Asp Ser Lys Gly Glu Leu Thr 650 655 tat gta aaa aaa aat aag cct 2016 Tyr Val Lys Lys Asn Lys Pro 670 -24 - 1343948 tea ata gaa age aaa tgt taaactcctt ttacttcggt tgtgaaagaa Ser lie Glu Ser Lys Cys 675 agttgacatt atcgatttgg gtgacacggt gattgaaaaa gcaacgacca gtattatacc tctttttttt attattcagt ttatattttt gcaagt <210〉 40 <211〉 678 <212> PRT <213〉釀酒酵母 <400> 40

Met Gly Leu Leu Ala Leu Gly Thr Pro Leu Gin Trp Phe Glu Ser Arg 1 5 10 15

Thr Tyr Asn Glu His lie Arg Asp Glu Gly lie Glu Gin Leu Leu Tyr 20 25 30 lie Phe Gin Ala Ala Gly Lys Arg Asp Asn Asp Pro Leu Phe Trp Gly 35 40 45

Asp Glu Leu Glu Tyr Met Val Val Asp Phe Asp Asp Lys Glu Arg Asn 50 55 60

Ser Met Leu Asp Val Cys His Asp Lys lie Leu Thr Glu Leu Asn Met 65 70 75 80

Glu Asp Ser Ser Leu Cys Glu Ala Asn Asp Val Ser Rie His Pro Glu 85 90 95

Tyr Gly Arg Tyr Met Leu Glu Ala Thr Pro Ala Ser Pro Tyr Leu Asn 100 105 110

Tyr Val Gly Ser Tyr Val Glu Val Asn Met Gin Lys Arg Arg Ala lie 115 120 125

Ala Glu Tyr Lys Leu Ser Glu Tyr Ala Arg Gin Asp Ser Lys Asn Asn 130 135 140

Leu His Val Gly Ser Arg Ser Val Pro Leu Thr Leu Thr Val Phe Pro 145 150 155 160

Arg Met Gly Cys Pro Asp Phe lie Asn lie Lys Asp Pro Trp Asn His 165 170 175

Lys Asn Ala Ala Ser Arg Ser Leu Phe Leu Pro Asp Glu Val lie Asn 180 185 190

Arg His Val Arg Rie Pro Asn Leu Thr Ala Ser lie Arg Thr Arg Arg 195 200 205

Gly Glu Lys Val Cys Met Asn Val Pro Met Tyr Lys Asp lie Ala Thr 210 215 220 2064 2124 2160 -25- 1343948

Pro Glu Thr Asp Asp Ser lie Tyr Asp Arg Asp Trp Rie Leu Pro Glu 225 230 235 240

Asp Lys Glu Ala Lys Leu Ala Ser Lys Pro Gly Phe lie Tyr Met Asp 245 250 255

Ser Met Gly Phe Gly Met Gly Cys Ser Cys Leu Gin Val Thr Phe Gin 260 265 270

Ala Pro Asn lie Asn Lys Ala Arg Tyr Leu Tyr Asp Ala Leu Val Asn 275 280 285

Phe Ala Pro lie Met Leu Ala Phe Ser Ala Ala Ala Pro Ala Phe Lys 290 295 300

Gly Trp Leu Ala Asp Gin Asp Val Arg Trp Asn Val lie Ser Gly Ala 305 310 315 320

Val Asp Asp Arg Thr Pro Lys Glu Arg Gly Val Ala Pro Leu Leu Pro 325 330 335

Lys Tyr Asn Lys Asn Gly Phe Gly Gly lie Ala Lys Asp Val Gin Asp 340 345 350

Lys Val Lai Glu lie Pro Lys Ser Arg Tyr Ser Ser Val Asp Leu Phe 355 360 365

Leu Gly Gly Ser Lys Phe Phe Asn Arg Thr Tyr Asn Asp Thr Asn Val 370 375 380

Pro lie Asn Glu Lys Val Leu Gly Arg Leu Leu Glu Asn Asp Lys Ala 385 390 395 400

Pro Leu Asp Tyr Asp Leu Ala Lys His ftie Ala His Leu Tyr lie Arg 405 410 415

Asp Pro Val Ser Thr Phe Glu Glu Leu Leu Asn Gin Asp Asn Lys Thr 420 425 430

Ser Ser Asn His Phe Glu Asn lie Gin Ser Thr Asn Trp Gin Thr Leu 435 440 445

Arg Phe Lys Pro Pro Thr Gin Glri Ala Thr Pro Asp Lys Lys Asp Ser 450 455 460

Pro Gly Trp Arg Val Glu Phe Arg Pro Phe Glu Val Gin Leu Leu Asp 465 470 475 480

Phe Glu Asn Ala Ala Tyr Ser Val Leu lie Tyr Leu lie Val Asp Ser 485 490 495 lie Leu Thr Phe Ser Asp Asn lie Asn Ala Tyr lie His Met Ser Lys 500 505 510

Val Trp Glu Asn Met Lys lie Ala His His Arg Asp Ala He Leu Phe 515 520 525

Glu Lys Phe His Trp Lys Lys Ser Phe Arg Asn Asp Thr Asp Val Glu 530 535 540

Thr Glu Asp Tyr Ser lie Ser Glu lie Rie His Asn Pro Glu Asn Gly -26- 1343948 545 550 555 560 lie Phe Pro Gin Phe Val Thr Pro He Leu Cys Gin Lys Gly Phe Val 565 570 575

Thr Lys Asp Trp Lys Glu Leu Lys His Ser Ser Lys His Glu Arg Leu 580 585 590

Tyr Tyr Tyr Leu Lys Leu lie Ser Asp Arg Ala Ser Gly Glu Leu Pro 595 600 605

Thr Thr Ala Lys Phe Phe Arg Asn Phe Val Leu Gin His Pro Asp Tyr 610 615 620

Lys His Asp Ser Lys lie Ser Lys Ser lie Asn Tyr Asp Leu Leu Ser 625 630 635 640

Thr Cys Asp Arg Leu Thr His Leu Asp Asp Ser Lys Gly Glu Leu Thr 645 650 655

Ser Phe Leu Gly Ala Glu lie Ala Glu Tyr Val Lys Lys Asn Lys Pro 660 665 670

Ser lie Glu Ser Lys Cys 675 <210> 41 <211〉 21 <212> DNA <213>人造的 <220> <223〉引子 <400> 41 gtggacgacc gtactccgaa g 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213〉人造的 <220> <223〉弓丨子 <400> 42 acccaaatcg ataatgtcaa c 21 -27- 1343948 <210〉 43 <211> 36 <2i2> m <213〉人造的 <220〉 <223〉引子 <400> 43 cttttcttgg gtgggtagta atttttcaat aggact 36 <210> 44 <211> 36 <212> DNA <213〉人造的 <220〉 <223〉弓丨子 <400> 44 agtcctattg aaaaattact acccacccaa gaaaag 36 <210〉 45 <211> 34 <212> DNA <213〉人造的 <220〉 <223〉引子 <400> 45 agattgggta ccatgagtat tcctcagtta tctg 34

<210> 46 <211> 33 <212> DNA 28- 1343948 <213〉人造的 <220> <223>引子 <400> 46 atccggtcta gactattgga gagcaacacc ate 33 <210> 47 <211> 35 <212> DNA <213〉人造的 <220> <223〉引子 <400> 47 gagtacggta ccatggggct gctatcatta gggac 35 <210> 48 <211〉 34 <212> DNA <213〉人造的 <220> <223>引子 <400> 48 cccttatcta gattaagcct ttgggttgtt tatc 34 <210〉 49 <211〉 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 29- 1343948 <400> 49 ggttctaaga agattcagca <210〉 50 <211〉 20 <212> DNA <213〉 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 50 ccctcggaaa aggagacgaa <210〉 51 <211> 37 <212〉 DNA <213〉 人工序列 <220> <223>引子 <400> 51 gaagcctcag catgaagctt gtggtaataa catttac <210> 52 <211〉 37 <212〉 DNA <213> 人工序列 <220> <223〉 引子 <400> 52 gtaaatgtta ttaccacaag cttcatgctg aggcttc <210> 53 <211> 35 1343948 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉引子 <400> 53 cgaccaatcg actggtaccg ttatcaaaaa ctctg 35 <210> 54 <211> 35 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400> 54 cagagttttt gataacggta ccagtcgatt ggtcg 35 <210〉 55 <211〉 30 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉弓[子 <400> 55 cccaagcttc tctacttgct tctgctcaac 30 <210> 56 <211> 32 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉引子 <400> 56 gcaggtacca acttccgaaa acagtaatga ac 32 -31 -

Claims (1)

1343948 公· "口-本]ioc?年（月"）Ω修（真)止尽 第093124062號專利申請案中文申請專利範圍修正本 民國100年1月7 日修正 十、申請專利範圍 1. —種經分離之DNA，其編碼下述（A)或（B)所定義 之蛋白質： (A) 具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的蛋白質； (B) 具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列且具有穀胱甘 肽合成酶（GSH)活性的蛋白質，該胺基酸序列包括取代、 刪除、插入或添加1至2 5個胺基酸。 2. 如申請專利範圍第1項之DNA，其係如下述（a)或 (b)所定義： (a) 包含SEQ ID NO: 1之核苷酸編號58至1 48 5的 核苷酸序列之DNA ; (b) 於嚴格條件下可與該包含SEQ ID NO: 1之核苷 酸編號58至1485的核苷酸序列之DNA雜交且編碼具有 穀胱甘肽合成酶活性的蛋白質之DNA，該嚴格條件包含 6〇°C、1 X SSC 及 0.1% SDS 下。 3. 一種經如申請專利範圍第1項之經分離之DNA轉 型之產朊假絲酵母（Candida utilis)，該DNA已藉由定位 誘變（site-directed mutagenesis)經修飾，其中該經修飾之 DNA係與產朊假絲酵母之內源性穀胱甘肽合成酶（GSH)基 因同源重組並產生具有穀胱甘肽合成酶活性爲或低於 0.003微莫耳GSH/mg蛋白質/小時之產朊假絲酵母菌株。 4. 一種經已經修飾之DNA轉型之產朊假絲酵母，該 1343948 -DN A係與產朊假絲酵母之內源性穀眺甘肽合成酶（G S H)基 ' 因同源重組，其中該同源重組產生具有穀胱甘肽合成酶活 性爲或低於0.003微莫耳GSH/mg蛋白質/小時之產阮假絲 酵母菌株，且其中該已經修飾之DNA係如下述（c)或（d)所 定義： (c)由SEQ ID NO: 1之核苷酸編號58至981的核苷 酸序列所構成之DNA ; φ (d)於嚴格條件下可與該由SEQ ID NO·· 1之核苷酸 編號58至98 1的核苷酸序列所構成之DNA雜交之DNA ，該嚴格條件包含60°C、1 X SSC及0.1% SDS下。 ' 5.如申請專利範圍第3項之產朊假絲酵母，其中該 • 產朊假絲酵母係進一步經S E Q I D Ν Ο : 3之核苷酸序列轉 型以增強彼之γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酶活性。 6. —種酵母萃取物，其係藉由培養如申請專利範圍 第3項之產朊假絲酵母並萃取該酵母細胞或使該酵母細胞 ♦自溶而產製。 7. —種經如申請專利範圍第2項之經分離之DN Α轉 型之產阮假絲酵母’該DNA已藉由定位誘變經修飾，其 中該經修飾之DNA係與產朊假絲酵母之內源性穀胱甘肽 合成酶（GSH)基因同源重組並產生具有穀胱甘肽合成酶活 性爲或低於0.0 03微莫耳GSH/mg蛋白質/小時之產朊假絲 酵母菌株。 8. 如申請專利範圍第4項之產朊假絲酵母，其中該 產阮假絲酵母係進一步經s E q I 〇 N 0 : 3之核苷酸序列轉 1343948 型以增強彼之γ-麩胺醯基半胱胺酸合成酶活性。 9. 一種酵母萃取物，其係藉由培養如申請專利範圍 第4項之產朊假絲酵母並萃取該酵母細胞或使該酵母細胞 自溶而產製。 -3-