KR100951069B1 - γ-글루타밀시스테인 생산 효모 - Google Patents

γ-글루타밀시스테인 생산 효모 Download PDF

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Abstract

47위치의 트레오닌 잔기가 이소로이신 잔기로 치환되는 변이 및 387위치의 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환되는 변이로부터 선택되는 1개 또는 2개의 변이를 갖는 변이형 글루타티온 신테타제를 보유하며 또한, γ-글루타밀시스테인을 생산하는 효모를 적절한 조건에서 배양하며, 수득되는 배양물 또는 이의 분획물, 또는 가열처리한 배양물 또는 이의 분획물을 음식물 원료에 혼합하며 음식물로 가공함으로써 γ-글루타밀시스테인 또는 시스테인 함유 식품을 제조한다.
Figure R1020047007970
γ-글루타밀시스테인, 시스테인, 글루타티온 신테타제, γ-글루타밀시스테인 신테타제

Description

γ-글루타밀시스테인 생산 효모{γ-Glutamylcysteine-producing yeast}
본 발명은 활성이 약화된 변이형 글루타티온 신테타제를 갖는 효모 및 동 효모의 균체를 이용하는 식품에 관한 것이다. γ-글루타밀시스테인 및 이로부터 제조되는 시스테인은 식품분야에서 유용하다.
시스테인은 식품의 풍미 개선 등을 목적으로 사용되고 있다. 시스테인의 제법에 관해서는 단백질 분해법이나 반합성법 등이 공지되어 있지만, 현재 주로 사용되고 있는 방법은 단백질 분해법과 반합성법이다. 시스테인을 식품의 풍미 개선을 위해 사용하는 것을 목적으로 하여, 시스테인 함량이 높은 천연식품 소재가 요구되고 있지만, 이러한 천연식품 소재는 종래부터 거의 공지되어 있지 않다. 한편, γ-글루타밀시스테인을 함유하는 효모 추출물을 가열 또는 효소처리하면, 고 함량의 시스테인을 함유하는 식품 소재를 수득할 수 있다고 보고되어 있다(WO 00/30474).
γ-글루타밀시스테인은 γ-글루타밀시스테인 신테타제의 작용에 의해 이의 기질인 시스테인과 글루탐산으로부터 합성된다. 또한, 글루타티온은 글루타티온 신테타제의 작용에 의해 기질인 γ-글루타밀시스테인과 글리신으로부터 합성된다. 따라서, 고 함량의 γ-글루타밀시스테인을 축적하는 효모의 육종방법으로서, 글루타티온 신테타제를 암호화하는 유전자의 파괴가 고려된다. 글루타티온 신테타제를 암호화하는 유전자가 파괴된 효모는 문헌[참조: WO 00/30474; 0take et al., Agri. Biol. Chem., 54(12), 3145-3150, 1990; Chris et al., Molecular Biology of the Cel1., 8, 1699-1707, 1997; Inoue et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1395(1998) 315-320]에 보고되었다.
그러나 상기 효모는 모두 생육 속도가 대폭 저하된다는 결점이 있다. 또한, 오다케(Otake) 등은 글루타티온 신테타제를 암호화하는 유전자가 파괴된 효모는 글루타티온을 함유하지 않는 배지에서 배양하면 글루타티온을 함유하는 배지에서 배양할 때보다 생육이 불량한 것으로 보고하고 있다[참조: Otake et al., Agri. Biol. Chem., 54(12), 3145-3150, 1990]. 그러나 일반적으로 글루타티온을 풍부하게 포함하는 배지는 비싸며 또한 글루타티온 자체도 비싸기 때문에 공업적으로 사용하기 위해서는 적당하지 않고, 글루타티온을 충분량 함유하지 않는 염가의 공업수준의 배지에서 상기 효모를 고밀도 배양하는 것도 생육을 위해 부적당하다.
발명의 개시
본 발명은 상기한 기술 배경하에 활성이 약화된 변이형 글루타티온 신테타제를 보유하며 또한, γ-글루타밀시스테인을 생성하는 효모 및 동 효모를 이용하는 γ-글루타밀시스테인 함유 식품을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자 등은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 특정한 변이를 갖는 변이형 글루타티온 신테타제가 γ-글루타밀시스테인의 축적 및 생육에 적절한, 적당한 글루타티온 합성효소 활성을 가지며, 이러한 변이형 효소를 보유하는 효모가 γ-글루타밀시스테인을 축적함을 밝혀내어 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명은 하기와 같다.
(1)47위치의 트레오닌 잔기가 이소로이신 잔기로 치환되는 변이 및 387위치의 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환되는 변이로부터 선택되는 1개 또는 2개의 변이를 갖는 변이형 글루타티온 신테타제를 보유하며 또한, γ-글루타밀시스테인을 생산하는 효모.
(2)다시, 54위치의 프롤린 잔기가 로이신 잔기로 치환되는 변이를 갖는 (1)의 효모.
(3)변이형 글루타티온 신테타제가, 47위치의 트레오닌 잔기가 이소로이신 잔기로 치환되는 변이 및 54위치의 프롤린 잔기가 로이신 잔기로 치환되는 변이를 갖는 (2)의 효모.
(4)변이형 글루타티온 신테타제가, 387위치의 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환하는 변이를 가지며 또한, 54위치의 프롤린 잔기가 로이신 잔기로 치환되는 변이를 갖는 (2)의 효모.
(5)변이를 갖지 않는 글루타티온 신테타제가 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 (1) 내지 (4)중의 어느 하나의 효모.
(6)사카로마이세스(Saccharomyces) 속에 속하는 (1) 내지 (5)중의 어느 하나 의 효모.
(7)(1) 내지 (6)중의 어느 하나의 효모를 적절한 조건에서 배양하여 수득되는 배양물 또는 γ-글루타밀시스테인을 함유하는 당해 배양물의 분획물 또는 열처리에 의해 시스테인이 생성되는 이들 배양물 또는 분획물을 함유하는 음식물.
(8) 알코올 음료, 빵 식품 또는 발효식품 조미료인 (7)의 음식물.
(9)(1) 내지 (6)중의 어느 하나의 효모를 적절한 조건에서 배양하여 수득되는 배양물을 사용하여 제조하는 효모 추출물.
(10)(1) 내지 (6)중의 어느 하나의 효모를 적절한 조건에서 배양하고, 수득되는 배양물 또는 이의 분획물, 또는 가열처리한 상기 배양물 또는 분획물을 음식물 원료에 혼합하고 음식물로 가공하는 것을 특징으로 하는 γ-글루타밀시스테인 또는 시스테인 함유 식품의 제조방법.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 효모는 하기 변이중 하나 또는 둘다를 갖는 변이형 글루타티온 신테타제를 보유하며 또한, γ-글루타밀시스테인을 생산하는 효모이다.
(1)47위치의 트레오닌 잔기가 이소로이신 잔기로 치환되는 변이(이하, 「T47I형」 변이라고 한다).
(2)387위치의 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환되는 변이(이하,
「G387D형」 변이라고 한다).
본 발명에서 「변이형 글루타티온 신테타제를 보유한다」라는 것은 야생형 글루타티온 신테타제를 실질적으로 보유하지 않는 것을 전제로 한다.
또한, 본 발명에서 「γ-글루타밀시스테인을 생산한다」라는 것은 효모 야생주보다 다량의 γ-글루타밀시스테인을 균체내에 축적하는 것을 말한다. 바람직하게는 본 발명의 효모는 SD 배지에서 배양할 때, 이의 대수 증식기에 γ-글루타밀시스테인을 1.0중량% 이상, 바람직하게는 1.1중량% 이상 함유한다. 또한, 본 발명의 효모는 SD 배지에서 배양할 때, 이의 대수 증식기에 글루타티온을 0.0001% 내지 0.1중량%의 범위, 바람직하게는 0.001중량% 내지 0.006중량%의 범위로 함유한다. 여기서 「대수 증식기」란 배양중에 효모의 세포수가 배양시간에 대하여 대수적으로 증가하는 시기를 말한다.
상기 글루타티온 신테타제의 변이 및 하기된 임의적인 변이의 위치는 보고되어 있는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)의 글루타티온 신테타제 유전자(GSH2)가 암호화하는 아미노산 서열[Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395(1998) 315-320, GenBank accession Y13804](서열목록의 서열 2에 기재된다)을 기준으로 한다. 또한, 동 유전자의 염기서열을 서열 1에 기재한다.
예를 들면, 본 발명의 효모가 보유하는 변이형 글루타티온 신테타제가, 기준서열과 비교하여 N 말단 부분에서 1개의 아미노산 잔기 결실되어 있는 경우에는, 47위치 및 387위치는 변이형 글루타티온 신테타제의 N 말단에서 46번째 및 386번째의 아미노산 잔기에 상당한다.
본 발명의 효모는 상기 변이에 추가하여, 추가로 하기 변이의 한쪽 또는 양쪽을 가질 수 있다.
(3) 54위치의 프롤린 잔기가 로이신 잔기로 치환되는 변이(이하, 「P54L형」
변이라고 한다).
본 발명의 효모가 보유하는 변이형 글루타티온 신테타제의 바람직한 양태는 하기와 같다.
(i) T47I형 변이 및 P54L형 변이를 갖는 글루타티온 신테타제.
(ii) G387D형 변이 및 P54L형 변이를 갖는 글루타티온 신테타제.
또한, 상기 변이형 글루타티온 신테타제로서는 변이를 갖지 않는 글루타티온 신테타제가 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.
상기 변이를 갖는 변이형 글루타티온 신테타제는 야생형 글루타티온 신테타제와 비교하여 활성이 약화되어 있으므로 이것을 보유하는 효모는 γ-글루타밀시스테인을 생성한다. 또한, 상기 변이형 글루타티온 신테타제를 보유하는 효모는 약화된 글루타티온 합성효소 활성을 보유하고 있으므로 글루타티온을 함유하지 않는 배지에서도 양호하게 생육할 수 있다.
본 발명의 효모로서는 γ-글루타밀시스테인을 생산할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는 사카로마이세스·세레비시에 등의 사카로마이세스속, 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 등의 시조사카로마이세스속 등에 속하는 효모를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 효모는 2배성 또는 그 이상의 배수성을 갖는 것이 생육이 양호한 점에서 바람직하다. 2배성 또는 그 이상의 배수성을 갖는 효모는 상기 변이형 글루타티온 신테타제를 보유하는 효모의 육종에 사용하는 1배체 효모와 야생형 글루타티온 신테타제 보유주 1배체를 접합시켜 수득된 2배체 효모로부터 변이형 글루타티온 신테타제를 보유하며, γ-글루타밀시스테인을 생산하는 주를 선택함으로써 취득할 수 있다. 동일하게 하여, 3배체 또는 그 이상의 배수성을 갖는 효모를 취득할 수 있다.
본 발명의 효모는 예를 들면, 상기 변이를 갖는 글루타티온 신테타제를 암호화하는 DNA를 사용하는 유전자 치환에 의해 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 효모는 야생형 효모를 통상적인 변이처리, 예를 들면, UV조사 또는 N-메틸-N-니트로소구아니딘(NTG), 에틸메탄설포네이트(EMS), 아질산, 아크리딘 등의 변이제에 의한 처리에 의해 취득할 수 있다. 수득된 변이주가 목적하는 변이를 갖고 있는지의 여부는 예를 들면, PCR법 등에 의해 확인할 수 있다.
유전자 치환은 아래와 같이 실시할 수 있다. 목적하는 변이를 도입한 글루타티온 신테타제를 암호화하는 염기서열을 함유하는 재조합 DNA로 효모를 형질전환시켜, 변이형 글루타티온 신테타제 유전자와 염색체상의 글루타티온 신테타제 유전자 사이가 재조합되도록 한다. 이때, 재조합 DNA에는 숙주의 영양 요구성 등의 형질에 따라서 마커 유전자를 포함시키면 조작하기 쉽다. 또한, 재조합 DNA는 제한효소로 절단하는 등에 의해 직쇄상으로 한 다음, 효모에서 기능하는 복제 제어 영역을 재조합 DNA에서 제거하면 염색체에 재조합 DNA가 편입된 주를 효율적으로 취득할 수 있다.
상기한 바와 같이 염색체에 재조합 DNA가 편입된 주는 염색체 위에 원래 존재하는 글루타티온 신테타제 유전자 서열과의 재조합을 일으키며 야생형 글루타티온 신테타제 유전자와 변이형 글루타티온 신테타제 유전자의 융합 유전자 2개가 재조합 DNA의 다른 부분(벡터 부분 및 마커 유전자)를 끼운 상태로 염색체에 삽입되 어 있다. 따라 이 상태에서는 야생형 글루타티온 신테타제 유전자가 기능한다.
다음에 염색체 DNA 위에 변이형 글루타티온 신테타제 유전자만을 남기기 위해 2개의 글루타티온 신테타제 유전자의 재조합에 의해 1개 카피의 글루타티온 신테타제 유전자를 벡터 부분(마커 유전자를 포함한다)과 함께 염색체 DNA에서 이탈시킨다. 이때, 야생형 글루타티온 신테타제 유전자가 염색체 DNA 위에 잔존되며 변이형 글루타티온 신테타제 유전자가 절단 인출되는 경우와, 반대로 변이형 글루타티온 신테타제 유전자가 염색체 DNA 위에 잔존되며 야생형 글루타티온 신테타제 유전자가 절단 인출되는 경우가 있다. 어느 경우에도 마커 유전자가 이탈되므로 2회째의 재조합이 발생하는 것은 마커 유전자에 대응하는 표현형질에 의해 확인할 수 있다. 또한, 목적하는 유전자 치환주는, PCR에 의해 글루타티온 신테타제 유전자를 증폭시키고, 이의 구조를 조사함으로써 선택할 수 있다.
또한, 유전자 치환에 사용하는 변이형 글루타티온 신테타제 유전자는 글루타티온 신테타제 전체 길이를 암호화하는 것뿐만 아니라, 변이 부위를 함유하는 한, 효소의 일부를 암호화하는 유전자 단편이라도 양호하다. 유전자 단편을 사용하는 경우에도 상기와 동일하게 유전자 치환을 실시하면 염색체 DNA 위의 야생형 글루타티온 신테타제 유전자에 목적하는 변이가 도입된다.
염색체 DNA 위의 글루타티온 신테타제 유전자와 도입하고자 하는 변이형 글루타티온 신테타제 유전자가 유전자 치환법을 적용할 수 없을 정도로 상동성이 낮은 경우에는 염색체 DNA 위의 글루타티온 신테타제 유전자를 파괴한 후에 변이형 글루타티온 신테타제 유전자를 플라스미드 또는 염색체 DNA상에 보유시키면 양호하다.
목적하는 변이를 갖는 변이형 글루타티온 신테타제 유전자는 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 부위 특이적 변이법에 의해 취득할 수 있다. 사카로마이세스·세레비시에의 글루타티온 신테타제 유전자는 염기서열이 보고되어 있으며(문헌참조: Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395(1998) 315-320, GenBank accession Y13804, 서열 1), 상기 염기서열에 근거하여 작제한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하는 PCR에 의해 사카로마이세스·세레비시에 염색체 DNA에서 취득할 수 있다.
효모의 형질전환은 프로토플라스트법, KU법, KUR법, 전기천공법 등의 통상적인 효모의 형질전환에 사용되는 방법을 채용할 수 있다. 또한, 효모의 포자 형성, 1배체 효모의 분리 등의 조작은 문헌[참조: "Chemistry and Organism, Experimental Line 31, Experimental Techniques on Yeasts" First Edition, Hirokawa Shoten; "Bio Manual Series 10, Gene Experimental Methods with Yeast", First Edition, Youdosha, and the like]에 기재되어 있다.
본 발명의 효모는 변이형 글루타티온 신테타제를 보유하는 것에 추가하여 γ-글루타밀시스테인 합성효소 활성이 증강되어 있을 수 있다.
본 발명의 효모는 γ-글루타밀시스테인을 일정량 이상 생성하고 또한, 글루타티온이 존재하지 않도록 하는 공업적으로 사용되는 배지에서의 생육도 양호하므로 단위 시간당 γ-글루타밀시스테인의 생산능이 우수하다.
상기한 바와 같이 수득되는 γ-글루타밀시스테인을 생성하는 효모를 적절한 조건에서 배양하여 수득된 배양물은 γ-글루타밀시스테인을 함유한다. 이러한 배양물 또는 이의 분획물은 γ-글루타밀시스테인을 함유한다. 배양물은 효모 균체를 함유하는 배양액이라도 양호하며 이로부터 채취된 효모 균체, 균체 파쇄물 또는 균체 추출물(효모 추출물)이라도 양호하다. 균체 파쇄물 또는 효모 추출물로부터 γ-글루타밀시스테인을 함유하는 분획을 수득할 수 있다.
γ-글루타밀시스테인을 함유하는 배양물 또는 이의 분획물을 가열함으로써 γ-글루타밀시스테인로부터 시스테인을 유리시킬 수 있다.
배양에 사용하는 배지는 본 발명의 효모가 양호하게 생육되며 또한, γ-글루타밀시스테인을 효율적으로 생산하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 효모는 글루타티온을 함유하지 않는 배지에서도 양호하게 생육될 수 있으므로 통상 공업적으로 사용되는 배지를 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라 사용하는 효모의 형질에 따라서 필요한 영양소를 배지에 첨가한다.
배양조건 및 효모 추출물 등의 조제는 통상적인 효모의 배양 및 효모 추출물의 조제와 동일하게 하여 실시하면 양호하다. 효모 추출물은, 효모 균체의 열수 추출물을 처리하거나 효모 균체 분해물을 처리하여 수득할 수 있다.
γ-글루타밀시스테인 또는 시스테인을 함유하는 배양물 또는 이의 분획물은 음식물의 제조에 사용할 수 있다. 음식물로서는 알코올 음료, 빵 식품 또는 발효식품 조미료를 들 수 있다. 열처리에 의한 γ-글루타밀시스테인으로부터 시스테인의 생성은 음식물의 제조중 또는 제조 후에 실시해도 좋다.
상기 음식물은 γ-글루타밀시스테인 또는 시스테인을 함유하는 배양물 또는 이의 분획물을 음식물 원료에 혼합하여, 음식물로 가공함으로써 제조된다. 본 발명의 음식물은 상기 배양물 또는 분획물을 사용하는 것 이외에는 통상적인 음식물과 동일한 원료를 사용하여, 동일한 방법에 따라 제조할 수 있다. 이러한 원료로서는 예를 들면, 알코올 음료에서는 쌀, 보리, 옥수수 전분 등, 빵 식품에서는 밀가루, 설탕, 식염, 버터, 발효용 효모균 등, 발효 식품 조미료에서는 대두, 밀 등을 들 수 있다.
도 1은 SD 배지 또는 글루타티온을 1mM 함유하는 SD 배지(SDGSH)에서 K2주의 생육을 도시한 도면이다. 각 배지는 필요량의 우라실을 함유한다.
도 2는 SD 배지 또는 글루타티온을 1mM 함유하는 SD 배지(SDGSH)에서 K3주의 생육을 도시한 도면이다. 각 배지는 필요량의 우라실을 함유한다.
도 3은 SD 배지(필요량의 우라실을 함유한다)에서 K1주, K2주 및 K3주의 생육을 도시한 도면이다.
이하, 본 발명을 실시예에 따라 보다 구체적으로 설명한다.
실시예에서 사용하는 배지의 조성은 하기와 같다. 또한, 한천 배지는 정제 한천을 2% 함유한다.
[YPD 배지 조성]
글루코스 2%
펩톤 1%
효모 추출물 0.5%
(pH 5.0)
[SD 배지 조성]
글루코스 2%
질소 염기 1배 농도
[10배 농도 질소 염기는 1.7g의 박토 효모 질소 염기(Bacto Yeast Nitrogen Base) w/o 아미노산 및 황산암모늄(Difco사)과 5g의 황산암모늄을 혼합한 것을 100ml의 멸균수에 용해하고, pH를 5.2정도로 조정하여, 필터 여과 멸균한 것]
[SDF0A 배지 조성]
최종 농도로 50mg/L의 우라실 및 1g/L의 5-플루오로오로트산-수화물을 함유하는 SD 배지
비교예 1 글루타티온 신테타제를 암호화하는 유전자가 파괴된 효모의 육종
식품 용도에 사용되는 시판되는 사카로마이세스 세레비시에를 포자 형성시켜 1배체 빵 효모 S주(MATα)를 취득한다. 또한, S주로부터 우라실을 함유하는 SDFOA 한천 배지를 사용하여, 우라실 요구성주 S2주를 취득한다. S2주로부터 공개 특허 WO 00/30474에 기재된 방법에 따라 글루타티온 신테타제 유전자(GSH2)를 파괴한 효모 K1주를 취득한다.
실시예 1 변이형 글루타티온 신테타제를 갖는 효모의 육종
<1> 약화형 글루타티온 신테타제 유전자 치환용 카세트의 작제
(1) G387D형 글루타티온 신테타제 유전자 치환용 카세트의 작제
프라이머 F1[CATAAAACAACTGAAGCGTTAGCTC(서열 3)] 및 R1[CAGGCCAAAGATTTTCAGTACGAGC(서열 4)]를 사용하여, 피로베스트(Pyrobest) DNA 폴리머라제(다카라슈조)를 사용하여, 제조자가 지시하는 조건에 따라서 S2주의 글루타티온 신테타제 유전자의 ORF의 중간부터 ORF 하류 약 40염기쌍까지를 암호화하는 영역을 PCR법에 의해 증폭한다.
상기한 바와 같이 증폭한 유전자 단편을 정제하여, 하기의 조건으로 72℃에서 10분 동안 효소반응을 실시함으로써 양쪽 말단에 뉴클레오타이드 A를 부가한다.
(반응액 조성)
유전자 단편 용액 5μl
10X PCR 완충액(MgCl2 유리) 5μl
25mM MgCl2 3μl
2.5mM dATP 5μl
Taq DNA 폴리머라제(다카라슈조) 0.5μl
정제수 31.5μl
합계 50μl
이러한 반응 산물을 제조자의 지시에 따라 플라스미드 pGEM-TEasy(Promega 사)에 연결하여, 플라스미드 GSH2MS41/pGEM을 수득한다.
다음에 부위 특이적 변이법에 의해 GSH2MS41/pGEM에 포함되는 글루타티온 신테타제 유전자의 387번째의 아미노산 Gly에 대응하는 코돈(GGT)을 Asp의 코돈(GAT)으로 치환한다. 이러한 조작은 퀵체인지(QuikChangeTM) 부위-지시된 돌연변이 유발 키트(STRATAGENE사)를 사용하여, 제조자의 프로토콜에 따라서 실시한다. 프라이머는 프라이머 F2[CCACAGCGGGAAGATGGCGGAAACAATG(서열 5)], 프라이머 R2[CATTGTTTCCGCCATCTTCCCGCTGTGG(서열 6)]를 사용한다. 이와 같이 플라스미드 GSH2MS41dash/pGEM을 작제한다.
한편, 플라스미드 pYES2(Invitrogen사)에서 2μ ori를 제거한 플라스미드를 작제한다. pYES2를 제한효소 SspI, NheI로 절단하여, 절단 말단을 평활화한 다음, 재환상화시켜 플라스미드 pYES2dash를 수득한다. pYES2dash 및 GSH2MS41dash/pGEM을 모두 제한효소 SacI 및 SphI로 절단하며, pYES2dash에서는 URA3 유전자를 함유하는 단편, GSH2MS41dash/pGEM에서는 변이를 갖는 글루타티온 신테타제 유전자 단편을 절단 인출하여 이들을 연결한다. 이와 같이 플라스미드 GSH2MS41dash/pYES2dash를 작제한다. GSH2MS41dash/pYES2dash를 제한효소 MunI로 절단하여, 카세트 1을 수득한다.
(2) T47I형 글루타티온 신테타제 유전자 치환용 카세트의 작제
프라이머 F3[CTAATATGGATGTCGGCAACCCAAG(서열 7; 글루타티온 신테타제를 암호화하는 GSH2 유전자의 ORF의 약 700염기쌍 상류의 영역에 상당한다.), 프라이머 R3(CCACAGCTTTGGCCAATGCCTTAG(서열 8)]를 사용하여, 피로베스트 DNA 폴리머라제(다카라슈조)를 사용하며, 제조자가 지시하는 조건에 따라서 S2주의 글루타티온 신테타제 유전자를 함유하는 단편을 PCR법에 의해 증폭한다.
상기한 바와 같이 증폭한 유전자 단편을 정제하여, 상기와 동일한 조건에서 72℃로 10분 동안 효소반응을 실시함으로써 양쪽 말단에 뉴클레오타이드 A를 부가한다.
이러한 반응 산물을 제조자의 지시에 따라 플라스미드 pGEM-T Easy(Promega사)에 연결하여, 플라스미드 GSH2FD63/pGEM을 수득한다.
다음에 부위 특이적 변이법에 의해 GSH2FD63/pGEM에 함유되는 글루타티온 신테타제 유전자의 47번째의 아미노산 Thr에 대응하는 코돈(ACT)을 Ile의 코돈(ATT)으로 치환한다. 이러한 조작은 퀵체인지(QuikChangeTM) 부위-지시된 돌연변이 유발 키트(STRATAGENE사)를 사용하여, 제조자의 프로토콜에 따라 실시한다. 프라이머는 프라이머 F4[CGGTGTCACCAGTAATTATCTATCCAACCCC(서열 9)], 프라이머 R4[GGGGTTGGATAGATAATTACTGGTGACACCG(서열 10)]를 사용한다. 이와 같이 플라스미드 GSH2FD63dash/pGEM을 작제한다.
pYES2dash 및 GSH2FD63dash/pGEM을 모두 제한효소 SacI 및 SphI로 절단하며, pYES2dash에서는 URA3 유전자를 함유하는 단편, GSH2FD63dash/pGEM에서는 변이를 갖는 글루타티온 신테타제 유전자 단편을 절단 인출하여 이들을 연결한다. 이와 같이 플라스미드 GSH2FD63dash/pYES2dash를 작제한다. GSH2FD63dash/pYES2dash를 제한효소로 절단하여, 카세트 2를 수득한다.
<2> 약화형 글루타티온 신테타제를 보유하는 효모의 육종
(1) G387D형 글루타티온 신테타제를 보유하는 효모의 육종
상기한 바와 같이 작제한 카세트 1을 사용하여, S2주의 글루타티온 신테타제 유전자의 유전자 치환을 실시한다. S2주를 전기 배양한 후에 배양물을 50ml의 YPD 배지에 계대 이식하고 대수 증식기까지 배양한다. 배양 균체를 1M 소르비톨에 현탁하고 카세트 1을 혼화하여, 전기천공에 의해 형질전환을 실시한다. 형질전환주를 1mM의 글루타티온을 함유하는 SD 한천 배지에서 배양하여, 생육하는 주를 선택한다. 카세트 1이 염색체상의 목적하는 위치에 편입된 것을 PCR에 의해 확인하여, 수득된 주를 K2 중간체라 명명한다. K2 중간체를 배양하여, SDFOA 한천 배지에 도말하며 돋아난 주 중에서 글루타티온 신테타제 유전자가 G387D형으로 치환된 효모 K2주를 취득한다.
K2주의 변이형 글루타티온 신테타제 유전자는 보고되어 있는 사카로마이세스·세레비시에의 글루타티온 신테타제 유전자의 염기서열(Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395(1998) 315-320, GenBank accession Y13804)과 비교한 결과, 상기 G387D형 변이 이외에 54위치의 프롤린 잔기의 코돈(CCT)이 로이신 잔기의 코돈(CTT)으로 치환되어 있다.
(2) T47I형 글루타티온 신테타제를 보유하는 효모의 육종
상기한 바와 같이 작제한 카세트 2를 사용하여, S2주의 글루타티온 신테타제 유전자의 유전자 치환을 실시한다. S2주를 전기 배양한 후에 배양물을 50ml의 YPD 배지에 계대 이식하고 대수 증식기까지 배양한다. 배양 균체를 1M 소르비톨에 현탁하고 카세트 2를 혼화하여, 전기천공에 의해 형질전환을 실시한다. 형질전환주를 1mM의 글루타티온을 함유하는 SD 한천 배지에서 배양하여, 생육하는 주를 선택한다. 카세트 2가 염색체 위의 목적하는 위치에 편입된 것을 PCR에 의해 확인하며, 수득된 주를 K3 중간체라 명명한다. K3 중간체를 배양하여, SDFOA 한천 배지에 도말하며 돋아난 형질전환체를 SD 한천 배지에 도말하여, 돋아난 주를 선택하며 유전자 치환 카세트 2가 도입되어 있는 K3 중간체주를 취득한다. K3 중간체주를 배양하여, SDFOA 한천 배지에 도말하며 돋아난 주 중에서 글루타티온 신테타제가 T47I형으로 치환된 효모 K3주를 취득한다.
K3주의 변이형 글루타티온 신테타제 유전자는 보고되어 있는 사카로마이세스·세레비시에의 글루타티온 신테타제 유전자의 염기서열(Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395(1998) 315-320, GenBank accession Y13804)과 비교한 결과, 상기 T47I형 변이 이외에 54위치의 프롤린 잔기의 코돈(CCT)이 로이신 잔기의 코돈(CTT)으로 치환되어 있다.
(3) 2배체의 효모의 작제
G387D형의 변이형 글루타티온 신테타제를 갖는 1배체 효모(MATα)(K2주)를 통상적인 방법에 따라서 1배체 효모(MATa)와 접합시켜 2배체 효모를 취득한다. 이러한 2배체 효모를 통상적인 방법에 따라 포자 형성시켜 G387D형의 변이형 글루타티온 신테타제를 갖는 1배체 효모(MATa)를 취득한다. G387D형의 변이형 글루타티온 신테타제를 갖는 1배체 효모(MATα)와 G387D형의 변이형 글루타티온 신테타제를 갖는 1배체 효모(MATa)를 접합시켜 동형접합체의 형태로 G387D형의 변이형 글루타티온 신테타제를 갖는 2배체 효모 Z1주를 취득한다. T47I형의 변이형 글루타티온 신테타제를 갖는 2배체 효모 Z2주도 동일한 수법으로 취득한다. Z1주 및 Z2주가 γ-글루타밀시스테인을 건조 효모 균체당 1% 이상 축적함을 확인한다.
<3> 변이형 글루타티온 신테타제를 갖는 효모의 생육 및 γ-글루타밀시스테인 생산성의 검토
(1) K2주 및 K3주의 생육
K1주, K2주 및 K3주를 SD 배지(필요량의 우라실을 함유한다) 또는 글루타티온을 1mM 함유하는 SD 배지(필요량의 우라실을 함유한다)에서 배양한다. 효모의 증식이 대수 증식기에 도달하고 또한 660nm의 흡광도가 1.4이상이 될 때에 생육을 측정한다. 결과를 도 1 내지 3에 도시한다.
K2주의 글루타티온을 함유하는 배지에서의 비증식(specific growth) 속도(1시간당 증식도)는 1.171이며, 글루타티온을 함유하지 않은 배지에서 비증식 속도는 1.161이다. 또한, K3주는 각각 1.169 및 1.156이다. 도 1 내지 3으로부터 또한 비증식 속도로부터 명백한 바와 같이 K2주 및 K3주는 글루타티온을 함유하지 않는 배지에서도 생육이 양호하며, 글루타티온 신테타제 유전자 파괴주보다 공업수준의 배양에 적합하다. 따라서 G387D형 또는 T47I형의 글루타티온 신테타제를 갖는 효모는 공업수준의 글루타티온을 함유하지 않거나 또는 소량밖에 함유하지 않는 배지에서의 배양에서도 적절하게 사용할 수 있다.
(2) K2주, K3주의 γ-글루타밀시스테인 생산성
K1주, K2주 및 K3주를 SD 배지(필요량의 우라실을 함유한다)로 배양한다. 효모의 증식이 대수 증식기로 되며, 또한 660nm의 흡광도가 1.4이상으로 될 때부터 생육 및 γ-글루타밀시스테인의 축적량을 측정한다. 각각의 주의 비증식 속도는 1.104, 1.161 및 1.156이다. 또한, K2주 및 K3주는 글루타티온을 건조 효모 균체당 0.001 이상, 또한 0.006% 이하의 양으로 축적하고 있다. 각각의 주의 대수 증식기에서 건조 효모 균체당의 γ-글루타밀시스테인 축적량은 하기와 같다.
측정개시 후의 배양 시간 γ-글루타밀시스테인
K1주 약 2.6시간 후 1.750
K1주 약 5.3시간 후 1.747
K2주 약 1.5시간 후 1.121
K2주 약 3.8시간 후 1.125
K3주 약 1.5시간 후 1.118
K3주 약 3.8시간 후 1.120

다음에, 단위 시간당 γ-글루타밀시스테인의 생산성을 측정한다. 단위 시간당 γ-글루타밀시스테인의 생산성은 일정시간에 SD 배지(필요량의 우라실을 함유한다) 50ml 중에서 각 주를 배양할 때에 경사구 플라스크 중에 함유되어 있는 γ-글루타밀시스테인의 양이 단위 시간당 얼마만큼 증가했는가에 따라 측정한다. 이의 값은 건조 균체당의 γ-글루타밀시스테인 축적량과 효모의 증식속도에 따라 지배되는 값이다. K1주는 0.116mg/시간, K2주는 0.130mg/시간, K3주는 0.127mg/시간이다.
γ-글루타밀시스테인을 건조 효모 균체당 1중량% 이상 함유하는 효모 및 효모 추출물은 식품의 풍미 개선에 사용할 수 있다고 보고되어 있다(WO 00/30474). 따라서 K2주 및 K3주는 K1주보다 비증식 속도가 빠르므로 γ-글루타밀시스테인을 건조 효모 균체당 1% 이상 함유하는 효모 및 효모 추출물의 제조에 유리하다. 또한, K2주 및 K3주는 K1주보다 단위 시간당 γ-글루타밀시스테인의 생산성도 양호하다. 또한, K2주 및 K3주는 0.001% 이상의 글루타티온을 함유하므로 글루타티온을 함유하지 않도록 하는 공업수준의 배양에도 적합하다. 이상의 관점에서 G387D형, T47I형의 변이형 글루타티온 신테타제를 갖는 효모는 γ-글루타밀시스테인을 함유하는 효모 및 효모 추출물의 제조에 적합하다고 할 수 있다.
(3) K2주 및 K3주의 계대 이식 안정성에 관한 검토
K2주, K3주, Z1주 및 Z2주를 YPD 배지에서 배양한다. K2주, K3주, Z1주 및 Z2주를 10회 계대 이식 배양하여, 복귀 변이의 유무를 조사한다. 계대 이식 배양은 다음과 같이 실시한다. 4ml의 YPD 액체 배지를 함유하는 시험관에 각 주를 접종하여, 30℃에서 진탕 배양한다. 충분하게 생육한 다음, 배양 산물의 일부를 4ml의 YPD 액체 배지를 함유하는 시험관에 계대 이식한다. 이러한 조작을 10회 반복하여 실시한다.
복귀 변이의 확인 유무는 다음과 같이 실시한다. 배양액에서 효모 균체를 집균하여, 염색체 DNA를 회수하며 변이점의 염기서열을 확인한다. 또한, 10mM의 메틸글리옥살을 함유하는 SD 한천 배지(필요량의 우라실을 함유한다)에서 30℃로 배양할 때에 생육의 유무를 확인한다. 이들 결과로부터 K2주, K3주, Z1주, Z2주의 계대 이식 안정성이 나타난다.
(4) P57L 변이에 관한 검토
변이형 글루타티온 신테타제에 대한 P54L 변이의 영향에 관해서 검토를 한다. T47I형 변이 또는 G387D형 변이만을 갖는 글루타티온 신테타제 유전자를 함유하는 플라스미드를 작제한다. 글루타티온 신테타제 유전자를 함유하는 플라스미드로서는 pEGSH2를 사용한다. 동 플라스미드는 문헌[Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395(1998) 315-320]기재된 방법에 따라 작제한다.
우선, 플라스미드 pEGSH2의 글루타티온 신테타제 유전자의 47번째의 아미노산 Thr에 대응하는 코돈(ACT)을 Ile의 코돈(ATT)으로 치환한다. 이러한 조작은 퀵체인지 부위-지시된 돌연변이 유발 키트(STRATAGENE사)를 사용하여, 제조자의 프로토콜에 따라 실시한다. 프라이머는 프라이머 F4[CGGTGTCACCAGTAATTATCTATCCAACCCC(서열 9)], 프라이머 R4[GGGGTTGGATAGATAATTACTGGTGACACCG(서열 10)]를 사용한다. 이와 같이 플라스미드 pEGSH2-T47I를 구축한다.
다음에 플라스미드 pEGSH2의 글루타티온 신테타제 유전자의 387번째의 아미노산 Gly에 대응하는 코돈(GGT)을 Asp의 코돈(GAT)으로 치환한다. 이러한 조작은 퀵체인지 부위-지시된 돌연변이 유발 키트(STRATAGENE사)를 사용하여, 제조자의 프로토콜에 따라 실시한다. 프라이머는 프라이머 F2[CCACAGCGGGAAGATGGCGGAAACAATG(서열 5)], 프라이머 R2[CATTGTTTCCGCCATCTTCCCGCTGTGG(서열 6)]를 사용한다. 이와 같이 플라스미드 pEGSH2-G387D를 구축한다.
한편, K1주에서 우라실 요구성을 나타내는 주 KIdash주를 아래와 같이 취득 한다. K1주를 YPD 배지에서 30℃로 80시간 동안 배양하여, 배양 산물을 SDFOA 플레이트에 도말한다. SDFOA 플레이트에 생육시킨 효모 중에서 우라실 요구성을 나타내며 글루타티온 신테타제가 파괴된 효모 K1dash주를 선택한다.
상기한 바와 같이 수득된 K1dash주를 플라스미드 pEGSH2, pEGSH2-T47I 및 pEGSH2-G387D로 형질전환하여, 각각 pEGSH2/K1dash주, pEGSH2-T47I/K1dash주 및 pEGSH2-G387D/K1dash주를 취득한다. K1dash주에서의 각 플라스미드의 형질전환은 아래와 같이 실시한다. K1dash주를 전기 배양한 후에 배양물을 50ml의 YPD 배지에 계대 이식하고 대수 증식기까지 배양한다. 배양 균체를 1M 소르비톨에 현탁하고 목적하는 플라스미드를 혼화하여, 전기천공에 의해 형질전환을 실시한다. 형질전환주를 1mM의 글루타티온을 함유하는 SD 한천 배지에서 배양하며 생육하는 주를 선택한다.
pEGSH2/K1dash주, pEGSH2-T47I/K1dash주 및 PEGSH2-G387D/K1dash주를 SD 배지에서 30℃에서 30시간 동안 진탕 배양하여, 배양 산물을 SD 배지에 2% 접종하고 30℃에서 진탕 배양한다. 이의 대수 증식기(본 배양 개시 10시간 후)에서 균체내 글루타티온 축적량을 측정한다. pEGSH2/K1dash주는 약 0.80%, pEGSH2-T47I/K1dash주, pEGSH2-G387D/K1dash주는 0.001% 내지 0.006%의 글루타티온을 축적하고 있다.
이상의 결과로부터 P54L이라는 변이를 갖고 있지 않아도 T47I 또는 G387D라는 변이를 갖는 것 만으로 글루타티온 합성효소 활성이 약화되며 미약한 양의 글루타티온을 균체내에 함유할 수 있으며 γ-글루타밀시스테인의 고생산성에 기여하는 것으로 나타난다.
본 발명에 따라 활성이 약화된 변이형 글루타티온 신테타제를 보유하며 또한, γ-글루타밀시스테인을 생성하는 효모가 제공된다. 본 발명의 효모는 γ-글루타밀시스테인 함유 식품 또는 시스테인 함유 식품의 제조에 이용할 수 있다.
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Claims (17)

  1. 47위치의 트레오닌 잔기가 이소로이신 잔기로 치환되는 변이 및 387위치의 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환되는 변이로부터 선택되는 1개 또는 2개의 변이를 갖는 변이형 글루타티온 신테타제를 보유하며 또한, γ-글루타밀시스테인을 생산하는 효모.
  2. 제1항에 있어서, 54위치의 프롤린 잔기가 로이신 잔기로 치환되는 변이를 추가로 갖는 효모.
  3. 제2항에 있어서, 변이형 글루타티온 신테타제가, 47위치의 트레오닌 잔기가 이소로이신 잔기로 치환되는 변이 및 54위치의 프롤린 잔기가 로이신 잔기로 치환되는 변이를 갖는 효모.
  4. 제2항에 있어서, 변이형 글루타티온 신테타제가, 387위치의 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환되는 변이 및 54위치의 프롤린 잔기가 로이신 잔기로 치환되는 변이를 갖는 효모.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 변이를 갖지 않는 글루타티온 신테타제가 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 효모.
  6. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속에 속하는 효모.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 따른 효모를 적절한 조건에서 배양하고, 효모 추출물을 제조함을 포함하는, 효모 추출물의 제조방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 따른 효모를 적절한 조건에서 배양하고, 수득되는 배양물 또는 이의 분획물, 또는 가열처리한 상기 배양물 또는 분획물을 음식물 원료에 혼합하고 음식물로 가공함을 포함하는, γ-글루타밀시스테인 또는 시스테인 함유 식품의 제조방법.
  11. 제5항에 있어서, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속에 속하는 효모.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제5항에 따른 효모를 적절한 조건에서 배양하고, 효모 추출물을 제조함을 포함하는, 효모 추출물의 제조방법.
  15. 제6항에 따른 효모를 적절한 조건에서 배양하고, 효모 추출물을 제조함을 포함하는, 효모 추출물의 제조방법.
  16. 제5항에 따른 효모를 적절한 조건에서 배양하고, 수득되는 배양물 또는 이의 분획물, 또는 가열처리한 상기 배양물 또는 분획물을 음식물 원료에 혼합하고 음식물로 가공함을 포함하는, γ-글루타밀시스테인 또는 시스테인 함유 식품의 제조방법.
  17. 제6항에 따른 효모를 적절한 조건에서 배양하고, 수득되는 배양물 또는 이의 분획물, 또는 가열처리한 상기 배양물 또는 분획물을 음식물 원료에 혼합하고 음식물로 가공함을 포함하는, γ-글루타밀시스테인 또는 시스테인 함유 식품의 제조방법.
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