JP4453781B2 - γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードするDNA - Google Patents
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Description
キャンディダ・ユティリスは単位糖あたりの生育がサッカロマイセス・セレビシエよりよいと報告されている(非特許文献5)。また、厳格な好気条件下ではエタノールの副生が生じない為(非特許文献6)、培養上エタノールの副生に注意する必要性が低い。
(1)最小培地で培養したとき、対数増殖期に乾燥菌体当たり1重量%以上のγ−グルタミルシステインを含有するキャンディダ・ユティリス。
(2)最小培地がSD培地である(1)のキャンディダ・ユティリス。
(3)グルタチオン合成酵素活性が0.005μmol GSH/mgタンパク質/時間以下である(1)又は(2)のキャンディダ・ユティリス。
(4)細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下するようにグルタチオン合成酵素をコードする遺伝子が改変された(1)〜(3)のいずれかのキャンディダ・ユティリス。
(5)γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子の発現量が上昇するように改変された(1)〜(4)のいずれかのキャンディダ・ユティリス。
(6)(1)〜(5)のいずれかのキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物、もしくはγ−グルタミルシステインを含む前記培養物の分画物又は熱処理によってシステインが生成したこれらの培養物もしくは分画物を含む飲食品。
(7)飲食品が発酵食品調味料である(6)の飲食品。
(8)(1)〜(5)のいずれかのキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養して得られる培養物を用いて製造された酵母エキス。
(9)(1)〜(5)のいずれかのキャンディダ・ユティリスを好適な条件で培養し、得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することを特徴とする、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有食品の製造法。
(10)下記(A)又は(B)に示すタンパク質をコードするDNA。
(A)配列番号43に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)配列番号43に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質。
(11)下記(a)又は(b)に示すDNAである(10)のDNA。
(a)配列番号42の塩基番号110〜2101の記載の塩基配列を含むDNA。
(b)配列番号42の塩基番号110〜2101の記載の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質。
<1>本発明のキャンディダ・ユティリス
本発明のキャンディダ・ユティリスは、最小培地で培養したとき、対数増殖期に乾燥酵母菌体当たり1重量%以上、好ましくは1.5重量%以上、より好ましくは2.0重量%以上のγ−グルタミルシステインを含有する。
〔SD培地組成〕
グルコース 2%
Nitrogen Base 1倍濃度
(10倍濃度Nitrogen Baseは、1.7gのBacto Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate(Difco社)と5gの硫酸アンモニウムを混合したものを100mlの滅菌水に溶解し、pHを5.2程度に調整し、フィルター濾過滅菌したもの)
95,p7171−7177、Curr Genet 1986;10(8):573−578、WO 98/14600)により、細胞内のグルタチオン合成酵素活性が低下するように改変することにより、取得することができる。グルタチオン合成酵素活性が低下するとは、グルタチオン合成酵素活性が消失することを含む。また、細胞内のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性が上昇するように改変することによっても、γ−グルタミルシステインを含有するキャンディダ・ユティリスを育種することができる。γ−グルタミルシステイン合成酵素活性は、Jacksonの方法(Jackson,R.C.,Biochem.J.,111,309(1969))によって測定することができる。
って、この状態では野生型グルタチオン合成酵素遺伝子が機能する。
でキャンディダ・ユティリスに導入することによって、増強することができる。γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ由来の遺伝子や、後述するキャンディダ・ユティリス由来の遺伝子が挙げられる。
本発明のDNAは、下記の(A)又は(B)のタンパク質をコードするDNAである。(A)配列番号43に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)配列番号43に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質。
る。変異処理としては、γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードするDNAをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードするDNAを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NG)もしくはEMS等の通常に変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
上記のようにして得られるγ−グルタミルシステインを産生する酵母を好適な条件で培養
して得られた培養物又はその分画物は、γ−グルタミルシステインを含有する。培養物は、酵母菌体を含む培養液であってもよいし、それから採取された酵母菌体、菌体破砕物、又は菌体抽出物(酵母エキス)であってもよい。菌体破砕物又は酵母エキスから、γ−グルタミルシステインを含む画分を得てもよい。
<実施例1>
γ−グルタミルシステインを産生するキャンディダ・ユティリスの構築
<1>キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素をコードすると予測される遺伝
子断片の取得
キャンディダ・ユティリスATCC15239株をYPD試験管培地で30℃で振とう培養し、Genとるくん酵母用(宝酒造(株)、Code9084)を用いて、菌体から染色体を回収した。
〔YPD培地組成〕
グルコース 2%
ペプトン 2%
酵母エキス 1%
(pH5.0)
(1) QEVAVVYYR(配列番号1)
(2) GSKKIQQ(配列番号2)
(3) VLKPQREGGGNN(配列番号3)
(4) ISELGIYG(配列番号4)
(5) GGVAAGF(配列番号5)
(6) GSKKIQQ(配列番号6)
(7) EGGGNN(配列番号7)
(8) PQREGGG(配列番号8)
00bpに相当する領域に、3本のバンドが検出された。PCRは、前記と同様の条件で行った。これらの3本のバンドを各々切り出し、ゲルからDNAを回収した。各々のバンドを、pGEM−T Easy vector(Promega社)に、DNA ligation Kit ver.2(宝酒造(株))を用いて連結し、大腸菌JM109コンピテントセル(宝酒造(株)、Code9052)を形質転換した。得られた形質転換体の一つからキャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素をコードしていると予測される遺伝子断片を含んでいると予測される形質転換体を取得した。形質転換体が持つインサートの塩基配列を常法に従い、決定した。
1回目PCR:AAG ATA TAC CCA TTG GAT GG(配列番号12)
及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
2回目PCR:TCA GAT CTT GGT AAA GAG GC(配列番号13)
及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
3回目PCR:AGA CTG GCA TTT GAG TCT CC(配列番号14)
及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
PCR産物をpGEM−T Easy vectorに連結し、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体が持つインサートの塩基配列を解析し、キャンディダ・ユティリスのグルタチオン合成酵素を含んでいると予測される遺伝子断片情報を取得した。
キャンディダ・ユティリスATCC15239より回収した染色体DNAを鋳型として、前記配列番号15及び16のプライマーを用いてPCRを行った。PCRは、Pyrobest(宝酒造(株))を用いて、製造者の指示にしたがい、次の条件で行った。98℃2分→98℃20秒、55℃30秒、72℃2分を40サイクル。
AGENE社、Catalog#200518)を用いて、部位特異的組換えによりクローニング断片の2箇所の塩基配列を置換し、HindIII及びKpnI切断部位を導入し、CGSH2Ctermi/pGEMT−Easyベクターを得た。部位特異的組換えに使用したプライマーは以下のとおりである。
〔1度目の変異導入(HindIII切断部位の導入)〕
GAA GCC TCA GCA TGA AGC TTG TGG TAA TAA CAT TTA C(配列番号19)
G TAA ATG TTA TTA CCA CAA GCT TCA TGC TGA GGC TTC(配列番号20)
〔2度目の変異導入(KpnI切断部位の導入)〕
CGA CCA ATC GAC TGG TAC CGT TAT CAA AAA CTC TG(配列番号21)
CA GAG TTT TTG ATA ACG GTA CCA GTC GAT TGG TCG(配列番号22)
CCC AAG CTT CTC TAC TTG CTT CTG CTC AAC(配列番号23)
GCA GGT ACC AAC TTC CGA AAA CAG TAA TGA AC(配列番号24)
常法(Luisらの手法、FEMS Microbiology Letters 165(1998)335−340)に従い、ATCC15239由来のウラシル要求性株ATCC15239ura−株を取得した。ATCC15239ura−株は、後述するようにURA3遺伝子によって相補されたことから、ura3変異株であると推定される。
まず、ATCC15239ura−株をYPD試験管培地で一晩30℃で培養した。培養産物をYPDフラスコ培地(坂口フラスコ500ml容、50ml張り込み)に植菌し、30℃で振とう培養した。対数増殖期に集菌し、4℃に冷やした1Mソルビトール溶液で、菌体を3回洗浄した。洗浄菌体を冷やした1Mソルビトール溶液に懸濁した。懸濁液に、50μl(2μg)のグルタチオン合成酵素遺伝子破壊カセットを加え、0.2cmキュベット中でよく混合し、エレクトロポレーション(Gene Pulser system(BioRad社)を使用、インピーダンス200Ω、キャパシタンス125μF、設定電圧1.5kVに設定)を行なった。キュベットに、1mlの冷やした1Mソルビトールを注ぎ、キュベットを10分間氷上で冷却した。菌体懸濁液をSDプレートにスプレッ
ドし、30℃で静地培養した。
ATCC15239Δgsh2株をYPD培地に植菌し、30℃で振とう培養した。培養物をSD培地(2L容フィン付三角フラスコに400ml張り込み)に2%植菌し、30℃で振とう培養した。対数増殖期に菌体を集菌し、4℃に冷やした1Mソルビトールで菌体を2回洗浄した。洗浄菌体を0.1mMのPMSF(フェニルメタンスルフォニルフルオリド)を含む10mM Tris−HClバッファー(pH7.5)0.5mlに懸濁した。懸濁液にガラスビーズ(GLASS BEADS 425−600microns Acid−washed(SIGMA社、コードG−8772))を加え、BEAD−BEATER(和研薬株式会社)を用いて細胞を破砕した。細胞の破砕は顕微鏡で確認した。その後、1mlの前記バッファーを加え、遠心操作により、ガラスビーズ及び細胞デブリを取り除いた。このようにして、細胞粗抽出液を得た。細胞粗抽出液をULTRAFREE−15 Biomax10(MILLIPORE社、Cat.No UFV2BGC40)を用いて精製し、酵素液を得た。酵素液の蛋白量は、Bradford法により定量した。発色はプロテインアッセイCBB溶液(ナカライ社、Code29449−15)を用いて行い、595nmの吸収を測定した。標準曲線はAlbumin standard(PIERCE社、No.23210)を用いて作成した。
〔反応液〕
100mM γ−グルタミルシステイン 100μl
100mM MgCl2 100μl
50mM ATP 100μl
100mM Gly 100μl
1M Tris−HCl(pH8.0) 85.5μl
160mM PEP 12.5μl
1mg/ml PK 2μl
酵素液(1〜10mg蛋白)
精製水
合計 2ml
PEP:ホスホエノールピルビン酸(SIGMA社、Code P−7127)
PK :ピルビン酸キナーゼ(SIGMA社、Code P−1903)
上記組成の反応液を、酵素量1〜10mg蛋白の範囲で30℃で0〜2時間反応させた。メタクリル酸を1/5当量加えて反応を停止させた後、反応液のpHを8.0に調整し、生成したGSH量を定量した。この時の酵素活性は検出限界以下であり、検出されなかった。
γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の取得
<1>γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子ホモログの取得
サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベのγ−グルタミルシステイン合成酵素のアミノ酸配列(Ohtake et al(Yeast 1991 Dec;7(9):953−961)、Mutoh et al(J Biochem(Tokyo)1995 Feb;117(2):283−288)から、以下の相同性が高い配列を選定した。
(1) MGFGMG(配列番号25)
(2) GWRVEFR(配列番号26)
用いたプライマーは以下の通りである。
1回目のPCR:TGA ACA GAG CTC GTT ACC TC(配列番号29)
及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
2回目のPCR:TCA TGG GCT AAT TTT GCA CC(配列番号30)
及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
3回目のPCR:TTC CTA GCA TTG ACG GCA GC(配列番号31)
及び3’RACEキット付属のAUAPプライマー
cDNA一次鎖調製のためのRT(逆転写)に用いたプライマーは以下の通りである。
AGC ACC AGA AAT GAC GTT C(配列番号32)
用いたプライマーは以下の通りである。
1回目のPCR:CCA TCT GAC GAC ATC CTG CTG(配列番号33)
及びキットに付属のAUAPプライマー
2回目のPCR:GTC AGC TAA GTG GCC TTT G(配列番号34)
及びキットに付属のAUAPプライマー
3回目のPCR:CAC TGG CGC TGC TGC CGT C(配列番号35)
及びキットに付属のAUAPプライマー
TGA TCT TCT GCT GTT CAT GTT(配列番号36)
製造者の指示に従って作製したcDNAライブラリーより、以下のプライマーを用いて3回のPCRを行なった。
用いたプライマーは以下の通りである。
1回目のPCR:CTC CAC GTA CAA GTA GTT CTC(配列番号37)
及びキットに付属のAUAPプライマー
2回目のPCR:CAG CGA ATC ACC GTT GTA CGG(配列番号38)
及びキットに付属のAUAPプライマー
3回目のPCR:AGC CAG CGG TGT CGC CTC(配列番号39)
及びキットに付属のAUAPプライマー
得られた形質転換体がもつインサートの塩基配列を解析し、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子を含んでいると予測される遺伝子断片情報を取得した。
用いたプライマーは以下のとおりである。
プライマーF2:GGG TTT GTT GTC TAT CGG CTT AAG(配列番号40)
プライマーR2:AGC TGT CTT GGT CGT CAT ATC CAT(配列番号41)
サッカロマイセス・セレビシエにおけるγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の発現
<1>グルタチオン合成酵素活性が低下したサッカロマイセス・セレビシエ
グルタチオン合成酵素活性が低下したサッカロマイセス・セレビシエとして、国際公開WO 2001/090310号パンフレットに記載のサッカロマイセス・セレビシエNα3株を用いた。
Nα3株は、サッカロマイセス・セレビシエのウラシル要求性酵母一倍体であるNα1株(国際公開WO 2001/090310号パンフレットに記載)を親株として、弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子置換株として構築された菌株である。
(1)GSH1遺伝子置換カセットの作製
まず、前記Nα1株の染色体DNAを鋳型として、γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子(配列番号44)の中流領域から末端領域までをPCR法により増幅した。PCR反応は、KOD dash(TOYOBO社)を使用して、製造者の指示に従い、次の条件で行った。下記に示す組成の反応液を用いて、94℃1分の後、94℃30秒、60℃40秒、74℃1分を30サイクル繰り返すことにより行った。プライマーはGF1(gtg gac gac cgt act ccg aag)(配列番号46)及びGR1(acc caa atc gat aat gtc aac)(配列番号47)を用いた。
次に、部位特異的変異法により、GSH1dash/pGEMに含まれるγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子(配列番号44)の、同遺伝子がコードするγ−グルタミルシステイン合成酵素(配列番号45)の372番目、373番目に対応するアミノ酸セリン及びリジンに対応するコドンを終止コドンに置換した。この操作は、QuickChange Site−Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE社)を用い、製造者のプロトコルに従って行った。プライマーはQCF1(ctt ttc ttg ggt ggg tag taa ttt ttc aat agg act)(配列番号48)、QCR1(agt cct att gaa aaa tta cta cc
c acc caa gaa aag)(配列番号49)を用いた。このようにしてプラスミドGSH1Mdash/pGEMを作製した。
上記のようにして作製した遺伝子置換カセットを用いて、Nα1株のγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の遺伝子置換を行った。Nα1株を前培養した後に、培養物を50mlのYPD培地に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を1Mソルビトールに懸濁し、遺伝子置換カセットを混和して、エレクトロポレーションにより形質転換を行った。形質転換株を1mMのグルタチオンを含むSDプレートで培養し、生育する株を選択した。遺伝子置換カセットが染色体上の目的の位置に組み込まれたことをPCRによって確認し、得られた株をNα4中間体とした。次に、変異型γ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子のみを染色体上に残す為、以下の操作を行った。Nα4中間体を1mMのグルタチオンを添加したYPD培地で培養し、培養産物を1mMのグルタチオンを含むSDFOAプレートに蒔いた。プレート上に生育してきた株のグルタチオン合成酵素遺伝子の配列を決定し、目的の部位の配列が正しく置換されていることを確認し、Nα4株を得た(図4)。
次に、上記のように取得したNα4株のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性が弱化しているか否か調べた。大竹らは、サッカロマイセス・セレビシエYNN27株より変異処理により取得したYH1株のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を測定しており(Agric.Biol.Chem54(12)3145−3150,1990)、その方法に準じて活性を測定した。その結果、Nα4株のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性は検出限界以下であった。次に、Nα4株をSD培地で培養し、対数増殖期の細胞内のγ−グルタミルシステイン及びグルタチオン含有量を測定したが、γ−グルタミルシステインは検出されず、グルタチオンは0.01%であった。また、Nα4株は2mMのメチルグリオキサールに感受性を示したことから、YH1株と同様にγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子が置換されていることが確認された。
キャンディダ・ユティリスの染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素遺伝子ホモログのORF領域を増幅した。PCRは、Pyrobest(宝酒造)を用いて製造者の指示に従って次の条件で行った。98℃2分→98℃20秒、55℃30秒、72℃2分を40サイクル。N末端側には制限酵素KpnI切断部位を付加したプライマーCGSH1F1(GAG TAC GGT ACC ATG GGG CTG CTA TCA TTA GGG AC)(配列番号50
)を、C末端側にはXbaI切断部位CGSH1R1(CCC TTA TCT AGA TTA AGC CTT TGG GTT GTT TAT C)(配列番号51)をそれぞれ用いて前記の条件でPCRを行い、増幅産物をQIAquick PCR purification Kitを用いて精製した。精製したPCR産物及びpAUR123ベクター(宝酒造)を、各々制限酵素KpnI、XbaIで切断した後連結し、大腸菌JM109コンピテントセルを形質転換した。このようにしてCGSH1/pAUR123ベクターを作製した。次に、CGSH1/pAUR123ベクター及びpYES2ベクターを制限酵素BamHIで切断した。CGSH1/pAUR123ベクターからはCGSH1のORFとpAUR123ベクター由来のプロモーターを含む領域を回収し、切断末端を脱リン酸化したpYES2ベクターと連結し、大腸菌JM109コンピテントセルを形質転換した。このようにして、キャンディダ・ユティリスのγ−グルタミルシステイン合成酵素ホモログの発現ベクターCGSH1/pYES2ベクターを作製した(図5)。
次に、CGSH1/pYES2ベクターをNα3株及びNα4株に導入した形質転換体を取得した。Nα3株又はNα4株を前培養した後に、培養物を50mlの液体培地(1mMのグルタチオンを含有するYPD培地)に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を1Mソルビトールに懸濁し、CGSH1/pYES2ベクターを混和して、エレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換株を1mMのグルタチオンを含むSDプレートで培養し、生育する株を選択した。Nα3株及びNα4株はウラシル要求性を示し、CGSH1/pYES2ベクターを含有する場合のみSD培地で生育することができる。得られた形質転換体がCGSH1/pYES2ベクターを含有することを常法により確認した。
Claims (3)
- 下記(A)又は(B)に示すタンパク質をコードするDNA。
(A)配列番号43に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)配列番号43に示すアミノ酸配列において、1〜15個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質。 - 下記(a)又は(b)に示すDNAである請求項1に記載のDNA。
(a)配列番号42の塩基番号110〜2101の塩基配列を含むDNA。
(b)配列番号42の塩基番号110〜2101の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 下記(a)又は(b)に示すDNAである請求項1に記載のDNA。
(a)配列番号42の塩基番号110〜2101の塩基配列を含むDNA。
(b)配列番号42の塩基番号110〜2101の塩基配列と95%以上の相同性を有し、かつ、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
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