CN113621640B

CN113621640B - 构建谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌的方法

Info

Publication number: CN113621640B
Application number: CN202111019543.4A
Authority: CN
Inventors: 范文超; 杨海锋; 高书良; 丁鹏
Original assignee: Zhejiang Huarui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Huarui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-01
Filing date: 2021-09-01
Publication date: 2023-09-19
Anticipated expiration: 2041-09-01
Also published as: CN113621640A

Abstract

本发明公开了一种构建谷胱二肽生产菌的方法，包括以下步骤：在酿酒酵母菌基因组中整合入一个以上拷贝的γ‑谷氨酰半胱氨酸合成酶基因gshA，筛选得到生产谷胱二肽的酵母菌。

Description

构建谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌的方法

技术领域

本发明属于代谢工程和基因工程领域，具体地说，涉及一种产谷胱二肽的酿酒酵母工程菌的构建方法。

背景技术

谷氨酸-半胱氨酸二肽又称γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸、γ-Glu-Cys，简称谷胱二肽，其CAS号636-58-8，分子式如下。

谷胱二肽是人体内与甘氨酸通过谷胱甘肽合成酶(gshB)合成L-谷胱甘肽(GSH)的底物，人体细胞内谷胱二肽含量很低，但人体细胞可以从外源摄取谷胱二肽快速提升GSH的水平。天然食物中，谷胱二肽一般在牛奶中存在，特别是乳清成分中，其往往以二硫键的形式连接到蛋白上。临床研究证明，HIV病人通过摄取乳清蛋白提取物可以提升人体谷胱甘肽水平。乳清提取物的谷胱二肽已经用于添加到食品和化妆品，也用来治疗遭受重金属或氧化剂中毒的病人。

目前谷胱二肽的合成方法包括化学合成法和酶催化法，但是目前还没有可以工业化进行稳定、低成本生产谷胱二肽的方法，化学法涉及复杂的保护和去保护修饰，工艺复杂，收率太低；酶法，一般需要使用经过甲醇或乙醇酯化的氨基酸底物作为原料，原料的限制性和可获取性不足，限制了工业化生产。

也有人研究了采用微生物发酵法来制备谷胱二肽。发酵法采用廉洁易得的培养基中碳源、氮源作为起始原料，近些年来逐渐成为新研究方向，例如CN104164381A公开了利用大肠杆菌(Escherichia coli)或菠萝泛菌(Pantoea ananatis)发酵来制备γ-谷氨酰半胱氨酸。但目前报道的微生物都是细菌，还没有报道利用真菌比如酵母菌发酵来制备谷胱二肽的研究进展。

考虑到目前谷胱二肽主要用于食品、药品和化妆品，而大肠杆菌因含有内毒素，且普通消费者一般将大肠肝菌视为致病性细菌而产生心理排斥等问题，导致通过某些细菌特别是有致病性风险的细菌发酵获得的谷胱二肽难以向医药、食品和化妆品等行业推广使用。

发明内容

要克服这种市场销售障碍，提高谷胱二肽被食品、保健品和药品销售商和消费者的接受度，发明人尝试了通过公认安全微生物(GRAS)比如谷氨酸棒杆菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等作为菌种通过发酵来生产谷胱二肽的可行性，终于在酿酒酵母中取得了成功，尤其是开发出了通过发酵生产谷胱二肽、但不生产谷胱甘肽的酿酒酵母S288C工程菌，这些研究进展构成了本发明的基础。

本发明的第一个目的在于提供一种构建谷氨酸-半胱氨酸二肽(简称谷胱二肽)生产菌的方法，其包括以下步骤：

A.在酵母菌基因组中整合入一个以上、优选两个以上、更优选三个以上拷贝的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC 6.3.2.2，又称glutamate-cysteine ligase，谷氨酰半胱氨酸连接酶)基因gshA，筛选阳性克隆；

B.筛选得到生产谷氨酸-半胱氨酸二肽(谷胱二肽)的酵母菌。

上述酵母菌可以选自酿酒酵母和面包酵母。

优选地，上述酵母菌是酿酒酵母S288C。

在一种实施方式中，上述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶可以是大肠杆菌来源的gshA酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

为了在酵母菌例如酿酒酵母中表达外源的大肠杆菌来源的gshA酶，对其编码基因进行密码子优化，例如上述基因gshA的核苷酸序列可以为SEQ ID NO:2。

上述步骤A中可以采用质粒转化、同源重组技术或者基因编辑技术将基因gshA整合入酵母菌基因组。

上述基因编辑技术可以采用CRISPR-Cas9系统、CRISPR-Cpf1系统、CRISPR-Cas相关的转座系统INTEGRATE系统或者CAST系统。

上述INTEGRATE系统是指Sam Sternberg研究组开发的基因编辑工具(Insertionof transposable elements by guide RNA-assisted targeting，引导RNA辅助靶向的转座元件插入)；CAST系统是指张锋研究组开发的基因编辑工具(CRISPR-associatedtransposase，CRISPR相关转座酶)。

本发明的第二个目的在于提供一种谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌或称谷胱二肽生产菌，其通过上述的方法构建得到。

本发明的第三个目的在于提供上述的谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌在生产谷胱二肽中的应用。具体而言，通过上述谷胱二肽生产菌菌株的发酵来生产谷胱二肽。

其中，发酵培养基可以是如下组成的YPD-GC培养基：10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖，根据需要在发酵培养至48h，添加1wt％的谷氨酸和1.5wt％半胱氨酸。

按照酿酒酵母的生长习性，发酵温度是30℃左右。

本发明构建的酿酒酵母工程菌是一种公认的安全模式微生物，能够通过发酵直接产生谷胱二肽、但不生产谷胱甘肽，所得到的发酵产物易于被广大食品、保健品和药品销售商和消费者所接受，具有工业化开发利用价值。

附图说明

图1是本发明构建的质粒pET24a-gshA-SC图谱。

图2是pHCas9-Nours质粒图谱，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

图3是pYES2-gRNA-hyg质粒图谱，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

具体实施方式

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(gshA)可催化L-谷氨酸和L-半胱氨酸，依靠ATP供能，生成谷胱二肽(γ-GC)。进一步地，谷胱二肽和甘氨酸可以在谷胱甘肽合成酶(gshB)催化下合成谷胱甘肽(GSH)。

发明人通过基因编辑技术CRISPR-Cas9系统在宿主酿酒酵母S288C基因组中整合入一个以上拷贝的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶gshA基因，筛选得到能产生谷胱二肽的工程菌。出乎预料的是，该工程菌能只产生谷胱二肽、但不再进一步产生谷胱甘肽，发酵产物中几乎检测不到谷胱甘肽，这就为后续的产物分离纯化提供了极大便利。相反，我们在使用其它微生物包括谷氨酸棒杆菌、乳酸菌、面包酵母、某些酿酒酵母菌亚种比如CCTCC M94055等作为宿主构建工程菌时，它们的发酵产物中不仅包含谷胱二肽，还包含谷胱甘肽，尽管两种小肽的比例各不相同。

研究发现，随着基因gshA拷贝数的提高，酿酒酵母S288C工程菌的谷胱二肽生产能力也会有提高，这为根据实际需要开发高产谷胱二肽的工程菌奠定了基础。

研究还发现，在酿酒酵母S288C工程菌的发酵培养基中添加谷氨酸和半胱氨酸，能够有效提高谷胱二肽的生成量。

在本文中，为了描述简便，有时会将gshA酶与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。

在本文中，对于本发明，术语“谷胱二肽基因工程生产菌”、“谷胱二肽基因工程菌”、“谷胱二肽生产菌”都表示构建的酿酒酵母工程菌S288C-XII-2::gshA、S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA和S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA-X-3::gshA，尤其是酿酒酵母工程菌S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA-X-3::gshA。

为了在酿酒酵母比如S288C中最佳地表达gshA酶SEQ ID NO:1，本发明对其表达基因进行了密码子优化。

密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。

经过针对酿酒酵母偏好性进行密码子优化，上述gshA酶SEQ ID NO:1的编码基因分别可以是SEQ ID NO:2。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

培养基：

LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

YPD20培养基：10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖。(固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

YPAD培养基：10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖，0.4g/L硫酸腺嘌呤。(固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

YPD-GC培养基：10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖，根据需要在发酵培养至48h，添加1wt％的谷氨酸和1.5wt％半胱氨酸。

以下实施例中，当使用含卡那霉素的培养基时，所述卡那霉素在培养基中的终浓度为50μg/ml。

转化子发酵验证：

阳性转化子进行摇瓶发酵验证。将转化子分别接种YPD-GC培养基进行发酵，30℃、220rpm培养3天。阳性转化子的谷氨酸-半胱氨酸二肽最高产量为3g/L。

谷胱二肽HPLC检测方法：

仪器设备	安捷伦高效液相色谱仪1260infinity II，DAD检测器
		色谱柱	依利特BDS-C18色谱柱
流动相A	0.1％高氯酸
		流动相B	乙腈
A：B	95：5
		仪器	Waters
色谱柱	Agilent-SB-Aq
		流速(mL/min)	1L/min
进样量(uL)	5μL
		柱温(℃)	40
波长(nm)	210nm
		运行时间(min)	10min
稀释液	纯水

谷胱二肽的保留时间大约是4.15min。

实施例中使用的引物序列信息如表1所示。

表1、引物序列

实施例中所使用的出发菌株酿酒酵母S288C由上海工业生物技术研发中心惠赠；质粒pHCas9-Nours和质粒pYES2-gRNA-hyg图谱和碱基序列由中国科学院上海生命科学研究院杨晟课题组提供，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成；质粒pET24a-gshA-SC委托苏州金唯智生物科技有限公司合成。任何单位和个人都可以获得这些质粒用于验证本发明，但未经允许不得用作其他用途，包括开发利用、新药申报、科学研究和教学。

实施例1：构建gshA基因供体质粒

1.1根据大肠杆菌BL21(DE3)来源的gshA基因的氨基酸序列SEQ ID NO:1，进行酿酒酵母偏好性密码子优化，得到其编码基因序列SEQ ID NO:2，并在基因两端设计限制性内切酶位点Nde I和XhoI，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET24a-gshA-SC，质粒图谱见图1，全长6791bp。

1.2制备Donor DNA：以pET2a-gshA-SC质粒为模板，以XII-2-gshA-F，XII-2-gshA-R为引物进行PCR扩增。扩增体系50μl，分为25μl 2×fx KOD buffer，10μl 2mM dNTPs，0.5μl XII-2-gshA-F(50μM)，0.5μl XII-2-gshA-R(50μM)，0.2μl pET2a-gshA-SC(100ng/μl)质粒1μl Fx KOD，12.8μl ddH₂O，35个循环数，该体系中所用的酶购买来自东洋纺(上海)生物科技生物有限公司，货号KFX-101，下同。

PCR程序设置见表2。

表2、PCR扩增程序设置

步骤	温度	时间	循环
				1	95℃	5min	1
2	94℃	30s	35
				3	60℃	30s	35
4	68℃	1min30s	35
				5	68℃	10min	1
6	16℃	5min	1

扩增片段长1.5kb，命名为XII-2-gshA片段，切胶回收。

按照类似的PCR方法，以酿酒酵母S288C基因组为模板，以XII-2-up-F和XII-2-up-R为引物进行PCR扩增，片段长200bp，命名为XII-2-up片段，切胶回收。

以酿酒酵母S288C基因组为模板，以XII-2-TEF1-F和XII-2-TEF1-R为引物进行PCR扩增，片段长400bp，切胶回收，称为XII-2-P。

以酿酒酵母S288C基因组为模板，以XII-2-CYC1-F和XII-2-CYC1-R为引物进行PCR扩增，片段长200bp，切胶回收，称为XII-2-T，切胶回收。

以酿酒酵母S288C基因组为模板，以X11-2-down-F和X11-2-down-R为引物进行PCR扩增，片段长200bp，命名为XII-2-down片段，切胶回收。

以上述XII-2-up、XII-2-P、XII-2-T、XII-2-down、XII-2-gshA片段为模板，进行overlap PCR，扩增体系50μl，分为25μl 2×fx KOD buffer，10μl 2mM dNTPs，0.5μl XII-2-up-F(50μM)，0.5μl X11-2-down-R(50μM)，2.1μl模板(0.2μl XII-2-up，0.5μl XII-2-P，0.2μl XII-2-T，0.2μl XII-2-down，1μl XII-2-gshA)，1μl Fx KOD，10.9μl ddH₂O，35个循环数，PCR程序设计见表2，改变之处为第4步骤的延伸时间变为2min30s，片段长2.5kb，称为XII-2-gshA-donor片段，切胶回收，得到gshA基因供体，用于基因编辑操作。

实施例2：构建pHCas9-Nours/S288C菌株

将质粒pHCas9-Nours(质粒图谱见图2，碱基序列为SEQ ID NO:3，含诺尔丝菌素抗性基因Nours)转化进入酿酒酵母S288C细胞内：抽提pHCas9-Nours质粒，通过醋酸锂转化的方法转化进入S288C菌株中。

1、从平板挑酿酒酵母S288C单菌落或甘油管转接菌株到YPD20培养基活化培养，普通试管好氧，一般需12-24h；

2、活化好的酵母菌液稀释10到20倍，测OD600，此时OD应为0.4-0.5，按初始OD600＝0.1-0.2转接入50ml 2×YPAD(组分见附录S1)摇瓶，30度，240rpm培养至OD600为0.8—1.0，约4—5小时；

3、于20℃，3000g离心5min，收集菌体，用1/2体积无菌水重悬。20℃，3000g离心5min。1/2体积无菌水再洗一次，20℃，3000g离心5min，收集菌体。用1ml无菌水重悬后转至1.5ml EP管，12000g离心30秒，收集菌体；

4、收集菌体同时，打开100℃金属浴，将鱼精DNA处理5min，立即置于冰上备用；

5、用1ml无菌水重悬，每管100微升分装备用；

6、取分装好的酵母菌，12000g离心30s，丢弃上清，按顺序依次加入以下成分：

PEG3350(50％(w/v))240微升，

LiAc(1M)36微升，

鱼精ssDNA(2mg/L，使用之前100度放置5min后立马插入冰上)50微升，

DNA(质粒pHCas9-Nours)+H₂O 34微升，

涡旋振荡混匀。

7、于42℃热激15min；

8、12000g离心30s去上清，加入1ml YPD培养基(针对抗性marker筛选)或者1mlddH₂O重悬，复苏2h或不复苏取200微升菌液涂布适当平板Nours平板；

9、平板30℃培养，得到pHCas9-Nours/S288C菌株。

实施例3：构建pYES2-gRNA-XII-2-hyg质粒

pYES2-gRNA-hyg质粒图谱见图2，碱基序列为SEQ ID NO:4。以pYES2-gRNA-hyg为模板，以XII-2-gRNA-F和gRNA-R为引物进行PCR环扩，扩增体系50μl，分为25μl 2×fx KODbuffer，10μl 2mM dNTPs，0.5μl XII-2-gRNA-F(50μM)，0.5μl gRNA-R(50μM)，0.2μlpYES2-gRNA-hyg质粒1μl Fx KOD，12.8μl ddH₂O，35个循环数，PCR程序设计见表2，改变之处为第4步骤的延伸时间变为6min，片段长6kb。

用DpnI(酶购买自赛默飞世尔科技，货号FD1703)消化后转入大肠杆菌DH5a细胞中，涂布含amp的LB平板，置于37℃培养过夜。以引物XII-2-gRNA-TF和gRNA-TR进行鉴定，鉴定PCR体系15μl，7.5μl 2×specific taq master Mix，0.2μl XII-2-gRNA-TF，0.2μlgRNA-TR,7.1μl ddH₂O，阳性克隆有700bp的条带，阴性无条带，相关PCR程序见表3，随机接种3个阳性转化子，抽提质粒，称为pYES2-gRNA-XII-2-hyg质粒，其含有潮霉素抗性基因Hyg，冻于-20℃冰箱，备用基因组编辑,菌落PCR鉴定用酶均购买自上海近岸科技有限公司，货号E010-02B，下同。

表3、鉴定PCR程序设置

步骤	温度	时间	循环
				1	95℃	5min	1
2	94℃	30s	30
				3	60℃	30s	30
4	72℃	40s	30
				5	72℃	10min	1
6	16℃	5min	1

实施例4：构建含一拷贝gshA基因的S288C-XII-2::gshA菌株

基因组编辑：将实施例3中构建的pYES2-gRNA-XII-2-hyg质粒和实施例1中构建的XII-2-gshA-donor按照实施例2中描述的醋酸锂转化方法转化进入实施例2中构建的pHCas9-Nours/S288C菌株，复苏，涂布含诺尔丝菌素nour+潮霉素hyg的YPD20平板，置于30℃培养箱培养约48h。

鉴定：挑选含诺尔丝菌素nour+潮霉素hyg的YPD20平板上生长的单克隆，利用XII-2-TF和XII-2-TR进行菌落PCR鉴定，鉴定用酶为上述的taq酶，PCR程序设置同表3，以S288C基因组为对照，引物换成XII-2-TF，XII-2-TR，第4步时间变成2min40s，阳性克隆2.8kb，阴性1.7kb，称为一拷贝Nour+gRNA菌株，或称pHCas9-Nours+gRNA/S288C-XII-2::gshA。

挑选克隆进行传代，丢失质粒，得到诺尔丝菌素抗性菌，称为pHCas9-Nours/S288C-XII-2::gshA。

挑选克隆进行传代，丢失质粒，得到无抗菌，称为S288C-XII-2::gshA。

实施例5：构建含两拷贝gshA基因的S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA菌株参照实施例1-4的方法构建含两拷贝gshA基因的S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA菌株。

5.1制备Donor DNA：以pET24a-ghsA-SC质粒为模板，以XI-1-gshA-F和XI-1-gshA-R为引物进行PCR扩增，扩增体系50μl，分为25μl 2×fx KOD buffer，,10μl 2mMdNTPs，0.5μl XI-1-gshA-F(50μM)，0.5μl XI-1-gshA-R(50μM)，0.2μl pET2a-gshA-SC(100ng/μl)质粒1μl Fx KOD，12.8μl ddH₂O，35个循环数，PCR程序设置见表2。片段长1.5kb，命名为XI-1-gshA片段，切胶回收。

按照类似的PCR方法，以酿酒酵母S288C基因组为模板，以XI-1-up-F和XI-1-up-R为引物进行PCR扩增，片段长200bp，命名为XI-1-up片段，切胶回收。

以酿酒酵母S288C基因组为模板，以XI-1-TEF1-F和XI-1-TEF1-R为引物进行PCR扩增，片段长400bp，切胶回收，称为XI-1-P。

以S288C基因组为模板，以XI-1-CYC1–F和XI-1-CYC1-R为引物进行PCR扩增，片段长200bp，切胶回收，称为XI-1-T，切胶回收。

以S288C基因组为模板，以XI-1-down-F和XI-1-down-R为引物进行PCR扩增，片段长200bp，命名为XI-1-down片段，切胶回收。

以XI-1-up、XI-1-P、XI-1-T、XI-1-down、XI-1-gshA片段为模板，进行overlapPCR，片段长2.5kb，称为XI-1-gshA-donor片段，切胶回收。

5.2构建pYES2-gRNA-XI-1-hyg质粒：以pYES2-gRNA-hyg为模板，以XI-1-gRNA-F、gRNA-R为引物进行PCR环扩，扩增体系50μl，分为25μl 2×fx KOD buffer，10μl 2mMdNTPs，0.5μl XI-1-gRNA-F(50μM)，0.5μl gRNA-R(50μM)，0.2μl pYES2-gRNA-hyg质粒1μlFx KOD，12.8μl ddH₂O，35个循环数，PCR程序设计见表2，改变之处为第4步骤的延伸时间变为6min，片段长6kb，用DpnI消化后转入DH5a宿主中，涂布amp的LB平板，置于37℃培养过夜。以XI-1-gRNA-TF和gRNA-TR进行鉴定，鉴定PCR体系15μl，7.5μl 2×specific taq masterMix，0.2μl XI-1-gRNA-TF，0.2μl gRNA-TR，7.1μl ddH₂O，阳性克隆有700bp的条带，阴性无条带,相关PCR程序见表3，阳性克隆有700bp的条带，阴性无条带，随机接种3个阳性转化子，抽提质粒，称为pYES2-gRNA-XI-1-hyg质粒，冻于-20℃冰箱，备用基因组编辑。

5.3基因组编辑：将pYES2-gRNA-XI-1-hyg质粒和XI-1-gshA-donor以上述的醋酸锂转化方法转化进入pHCas9-Nours/S288C-XII-2::gshA菌株，复苏，涂布含诺尔丝菌素nour+潮霉素hyg的YPD20平板，置于30℃培养箱培养约48h。

鉴定：挑选Nours+hyg平板上生长的单克隆，利用XI-1-TF和XI-1-TR进行菌落PCR鉴定，鉴定用酶为上述的taq酶，PCR程序设置同表3，以S288C基因组为对照，引物换成XI-1-TF，XI-1-TR，第4步时间变成2min30s，阳性克隆2.6kb，阴性1.6kb，称为两拷贝Nour+gRNA菌株，或称pHCas9-Nours+gRNA/S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA。

挑选克隆进行传代，丢失质粒，得到诺尔丝菌素抗性菌，称为pHCas9-Nours/S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA。

挑选克隆进行传代，丢失质粒，得到无抗菌，称为S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA。

实施例6：构建含三拷贝gshA基因的S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA-X-3::gshA菌株

参照实施例1-5的方法构建含三拷贝gshA基因的S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA菌株。

6.1制备Donor DNA：以pET24a-ghsA-SC质粒为模板，以X-3-gshA-F和X-3-gshA-R为引物进行PCR扩增，扩增体系50μl，分为25μl 2×fx KOD buffer，10μl 2mM dNTPs，0.5μlX-3-gshA-F(50uM)，0.5μl X-3-gshA-R(50μM)，0.2μl pET2a-gshA-SC(100ng/μl)质粒1μlFx KOD，12.8μl ddH2O，35个循环数，PCR程序设置见表2。片段长1.5kb，命名为X-3-gshA片段，切胶回收。

按照类似的PCR方法，以酿酒酵母S288C基因组为模板，以X-3-up-F和X-3-up-R为引物进行PCR扩增，片段长200bp，命名为X-3-up片段，切胶回收。

以S288C基因组为模板，以X-3-TEF1-F和X-3-TEF1-R为引物进行PCR扩增，片段长400bp，切胶回收，称为X-3-P。

以S288C基因组为模板，以X-3-CYC1–F和X-3-CYC1-R为引物进行PCR扩增，切胶回收，称为X-3-T，长度200bp，切胶回收。

以S288C基因组为模板，以X-3-down-F和X-3-down-R为引物进行PCR扩增，片段长200bp，命名为X-3-down片段，切胶回收。

以X-3-up、X-3-P、X-3-T、X-3-down和X-3-gshA片段为模板，进行overlap PCR，扩增体系50μl，分为25μl 2×fx KOD buffer，10μl 2mMdNTPs，0.5μl X-3-up-F(50μM)，0.5μlX-3-down-R(50μM)，2.1μl模板(0.2μl X-3-up，0.5μl X-3-P，0.2μl X-3-T，0.2μl X-3-down，1μl X-3-gshA)，1μl Fx KOD，10.9μl ddH₂O，35个循环数，PCR程序设计见表2，改变之处为第4步骤的延伸时间变为2min30s，片段长2.5kb，称为X-3-gshA-donor片段，胶回收。

6.2构建pYES2-gRNA-X-3-hyg质粒：以pYES2-gRNA-hyg为模板，以X-3-gRNA-F和gRNA-R为引物进行环扩，扩增体系50μl，分为25μl 2×fx KOD buffer，10μl 2mM dNTPs，0.5μl X-3-gRNA-F(50μM)，0.5μl gRNA-R(50uM)，0.2μl pYES2-gRNA-hyg质粒1μl Fx KOD，12.8μl ddH₂O，35个循环数，PCR程序设计见表2，改变之处为第4步骤的延伸时间变为6min，片段长6kb。

用DpnI消化后转入宿主DH5a中，涂布amp的LB平板，置于37℃培养过夜。以X-3-gRNA-TF和gRNA-TR进行鉴定，鉴定PCR体系15μl，7.5μl 2×specific taq master Mix，0.2μl X-3-gRNA-TF，0.2μl gRNA-TR，7.1ul ddH₂O，阳性克隆有700bp的条带，阴性无条带,相关PCR程序见表3阳性克隆有700bp的条带，阴性无条带，随机接种3个阳性转化子，抽提质粒，称为pYES2-gRNA-X-3-hyg质粒，冻于-20℃冰箱，备用基因组编辑。

6.3基因组编辑：将pYES2-gRNA-X-3-hyg质粒和X-3-gshA-donor以上述的醋酸锂转化方法转化进入pHCas9-Nours/S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA菌株，复苏，涂布含诺尔丝菌素nour+潮霉素hyg的YPD20平板，置于30℃培养箱培养约48h。

鉴定：挑选Nours+hyg平板上生长的单克隆，利用X-3-TF和X-3-TR进行菌落PCR鉴定，鉴定用酶为上述的taq酶，PCR程序设置同表3，以S288C基因组为对照，引物换成X-3-TF，X-3-TR，第4步时间变成2min30s，阳性克隆2.6kb，阴性1.7kb，称为三拷贝Nour+gRNA菌株，或称为pHCas9-Nours/S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA-X-3::gshA。

挑选克隆进行传代丢质粒，得到的无抗菌。挑选克隆进行传代，丢失质粒，得到无抗菌，称为S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA-X-3::gshA。

实施例7：系列工程菌发酵生产谷胱二肽的验证

通过摇瓶发酵验证不同菌株发酵生产谷胱二肽的水平。

分别从酿酒酵母S288C、工程菌S288C-XII-2::gshA、S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA和S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA-X-3::gshA四种菌株的YPD20培养平板上挑取单菌落，分别接种于盛有25mL YPD20培养基的250mL摇瓶中，于30℃、220rpm培养48h，得种子培养液。

将各个菌株的种子培养液按1v/v％接种量分别转接至盛有50mL YPD-GC培养基的500mL摇瓶中，培养72h。

将各个发酵液3000g离心5min，取上清，通过HPLC检测谷胱二肽含量，结果见表4。

表4、不同拷贝数gshA基因的酿酒酵母菌发酵生产谷胱二肽的检测结果

菌种编号	gshA基因拷贝数	谷胱二肽产量g/L
			S288C	0	0.1
S288C-XII-2::gshA	1	1.2
			S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA	2	2.2
S288C-XII-2::gshA-XI-1::gshA-X-3::gshA	3	3.0

通过将gshA基因SEQ ID NO:2整合入酿酒酵母S288C基因组，获得的工程菌能够发酵产生谷胱二肽；随着基因gshA拷贝数的提高，酿酒酵母S288C工程菌的谷胱二肽生产能力也会提高，三拷贝的阳性转化子的谷胱二肽产量能够达到3g/L，显示出工业化应用潜力。

序列表

<110> 浙江华睿生物技术有限公司

<120> 构建谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌的方法

<130> SHPI2110301

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 518

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 1

Met Ile Pro Asp Val Ser Gln Ala Leu Ala Trp Leu Glu Lys His Pro

1 5 10 15

Gln Ala Leu Lys Gly Ile Gln Arg Gly Leu Glu Arg Glu Thr Leu Arg

20 25 30

Val Asn Ala Asp Gly Thr Leu Ala Thr Thr Gly His Pro Glu Ala Leu

35 40 45

Gly Ser Ala Leu Thr His Lys Trp Ile Thr Thr Asp Phe Ala Glu Ala

50 55 60

Leu Leu Glu Phe Ile Thr Pro Val Asp Gly Asp Ile Glu His Met Leu

65 70 75 80

Thr Phe Met Arg Asp Leu His Arg Tyr Thr Ala Arg Asn Met Gly Asp

85 90 95

Glu Arg Met Trp Pro Leu Ser Met Pro Cys Tyr Ile Ala Glu Gly Gln

100 105 110

Asp Ile Glu Leu Ala Gln Tyr Gly Thr Ser Asn Thr Gly Arg Phe Lys

115 120 125

Thr Leu Tyr Arg Glu Gly Leu Lys Asn Arg Tyr Gly Ala Leu Met Gln

130 135 140

Thr Ile Ser Gly Val His Tyr Asn Phe Ser Leu Pro Met Ala Phe Trp

145 150 155 160

Gln Ala Lys Cys Gly Asp Ile Ser Gly Ala Asp Ala Lys Glu Lys Ile

165 170 175

Ser Ala Gly Tyr Phe Arg Val Ile Arg Asn Tyr Tyr Arg Phe Gly Trp

180 185 190

Val Ile Pro Tyr Leu Phe Gly Ala Ser Pro Ala Ile Cys Ser Ser Phe

195 200 205

Leu Gln Gly Lys Pro Thr Ser Leu Pro Phe Glu Lys Thr Glu Cys Gly

210 215 220

Met Tyr Tyr Leu Pro Tyr Ala Thr Ser Leu Arg Leu Ser Asp Leu Gly

225 230 235 240

Tyr Thr Asn Lys Ser Gln Ser Asn Leu Gly Ile Thr Phe Asn Asp Leu

245 250 255

Tyr Glu Tyr Val Ala Gly Leu Lys Gln Ala Ile Lys Thr Pro Ser Glu

260 265 270

Glu Tyr Ala Lys Ile Gly Ile Glu Lys Asp Gly Lys Arg Leu Gln Ile

275 280 285

Asn Ser Asn Val Leu Gln Ile Glu Asn Glu Leu Tyr Ala Pro Ile Arg

290 295 300

Pro Lys Arg Val Thr Arg Ser Gly Glu Ser Pro Ser Asp Ala Leu Leu

305 310 315 320

Arg Gly Gly Ile Glu Tyr Ile Glu Val Arg Ser Leu Asp Ile Asn Pro

325 330 335

Phe Ser Pro Ile Gly Val Asp Glu Gln Gln Val Arg Phe Leu Asp Leu

340 345 350

Phe Met Val Trp Cys Ala Leu Ala Asp Ala Pro Glu Met Ser Ser Ser

355 360 365

Glu Leu Ala Cys Thr Arg Val Asn Trp Asn Arg Val Ile Leu Glu Gly

370 375 380

Arg Lys Pro Gly Leu Thr Leu Gly Ile Gly Cys Glu Thr Ala Gln Phe

385 390 395 400

Pro Leu Pro Gln Val Gly Lys Asp Leu Phe Arg Asp Leu Lys Arg Val

405 410 415

Ala Gln Thr Leu Asp Ser Ile Asn Gly Gly Glu Ala Tyr Gln Lys Val

420 425 430

Cys Asp Glu Leu Val Ala Cys Phe Asp Asn Pro Asp Leu Thr Phe Ser

435 440 445

Ala Arg Ile Leu Arg Ser Met Ile Asp Thr Gly Ile Gly Gly Thr Gly

450 455 460

Lys Ala Phe Ala Glu Ala Tyr Arg Asn Leu Leu Arg Glu Glu Pro Leu

465 470 475 480

Glu Ile Leu Arg Glu Glu Asp Phe Val Ala Glu Arg Glu Ala Ser Glu

485 490 495

Arg Arg Gln Gln Glu Met Glu Ala Ala Asp Thr Glu Pro Phe Ala Val

500 505 510

Trp Leu Glu Lys His Ala

515

<210> 2

<211> 1557

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgatcccag acgtttctca agctttggct tggttggaaa agcacccaca agctttgaag 60

ggtatccaaa gaggtttgga aagagaaact ttgagagtta acgctgacgg tactttggct 120

actactggtc acccagaagc tttgggttct gctttgactc acaagtggat cactactgac 180

ttcgctgaag ctttgttgga attcatcact ccagttgacg gtgacatcga acacatgttg 240

actttcatga gagacttgca cagatacact gctagaaaca tgggtgacga aagaatgtgg 300

ccattgtcta tgccatgtta catcgctgaa ggtcaagaca tcgaattggc tcaatacggt 360

acttctaaca ctggtagatt caagactttg tacagagaag gtttgaagaa cagatacggt 420

gctttgatgc aaactatctc tggtgttcac tacaacttct ctttgccaat ggctttctgg 480

caagctaagt gtggtgacat ctctggtgct gacgctaagg aaaagatctc tgctggttac 540

ttcagagtta tcagaaacta ctacagattc ggttgggtta tcccatactt gttcggtgct 600

tctccagcta tctgttcttc tttcttgcaa ggtaagccaa cttctttgcc attcgaaaag 660

actgaatgtg gtatgtacta cttgccatac gctacttctt tgagattgtc tgacttgggt 720

tacactaaca agtctcaatc taacttgggt atcactttca acgacttgta cgaatacgtt 780

gctggtttga agcaagctat caagactcca tctgaagaat acgctaagat cggtatcgaa 840

aaggacggta agagattgca aatcaactct aacgttttgc aaatcgaaaa cgaattgtac 900

gctccaatca gaccaaagag agttactaga tctggtgaat ctccatctga cgctttgttg 960

agaggtggta tcgaatacat cgaagttaga tctttggaca tcaacccatt ctctccaatc 1020

ggtgttgacg aacaacaagt tagattcttg gacttgttca tggtttggtg tgctttggct 1080

gacgctccag aaatgtcttc ttctgaattg gcttgtacta gagttaactg gaacagagtt 1140

atcttggaag gtagaaagcc aggtttgact ttgggtatcg gttgtgaaac tgctcaattc 1200

ccattgccac aagttggtaa ggacttgttc agagacttga agagagttgc tcaaactttg 1260

gactctatca acggtggtga agcttaccaa aaggtttgtg acgaattggt tgcttgtttc 1320

gacaacccag acttgacttt ctctgctaga atcttgagat ctatgatcga cactggtatc 1380

ggtggtactg gtaaggcttt cgctgaagct tacagaaact tgttgagaga agaaccattg 1440

gaaatcttga gagaagaaga cttcgttgct gaaagagaag cttctgaaag aagacaacaa 1500

gaaatggaag ctgctgacac tgaaccattc gctgtttggt tggaaaagca cgcttaa 1557

<210> 3

<211> 10778

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

catagcttca aaatgtttct actccttttt tactcttcca gattttctcg gactccgcgc 60

atcgccgtac cacttcaaaa cacccaagca cagcatacta aatttcccct ctttcttcct 120

ctagggtgtc gttaattacc cgtactaaag gtttggaaaa gaaaaaagag accgcctcgt 180

ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa aatttttatc acgtttcttt ttcttgaaaa 240

tttttttttt tgattttttt ctctttcgat gacctcccat tgatatttaa gttaataaac 300

ggtcttcaat ttctcaagtt tcagtttcat ttttcttgtt ctattacaac tttttttact 360

tcttgctcat tagaaagaaa gcatagcaat ctaatctaag ttttaattac aaaatgcctc 420

caaaaaagaa gagaaaggtc gacaagaagt actccattgg gctcgatatc ggcacaaaca 480

gcgtcggctg ggccgtcatt acggacgagt acaaggtgcc gagcaaaaaa ttcaaagttc 540

tgggcaatac cgatcgccac agcataaaga agaacctcat tggcgccctc ctgttcgact 600

ccggggagac ggccgaagcc acgcggctca aaagaacagc acggcgcaga tatacccgca 660

gaaagaatcg gatctgctac ctgcaggaga tctttagtaa tgagatggct aaggtggatg 720

actctttctt ccataggctg gaggagtcct ttttggtgga ggaggataaa aagcacgagc 780

gccacccaat ctttggcaat atcgtggacg aggtggcgta ccatgaaaag tacccaacca 840

tatatcatct gaggaagaag cttgtagaca gtactgataa ggctgacttg cggttgatct 900

atctcgcgct ggcgcatatg atcaaatttc ggggacactt cctcatcgag ggggacctga 960

acccagacaa cagcgatgtc gacaaactct ttatccaact ggttcagact tacaatcagc 1020

ttttcgaaga gaacccgatc aacgcatccg gagttgacgc caaagcaatc ctgagcgcta 1080

ggctgtccaa atcccggcgg ctcgaaaacc tcatcgcaca gctccctggg gagaagaaga 1140

acggcctgtt tggtaatctt atcgccctgt cactcgggct gacccccaac tttaaatcta 1200

acttcgacct ggccgaagat gccaagcttc aactgagcaa agacacctac gatgatgatc 1260

tcgacaatct gctggcccag atcggcgacc agtacgcaga cctttttttg gcggcaaaga 1320

acctgtcaga cgccattctg ctgagtgata ttctgcgagt gaacacggag atcaccaaag 1380

ctccgctgag cgctagtatg atcaagcgct atgatgagca ccaccaagac ttgactttgc 1440

tgaaggccct tgtcagacag caactgcctg agaagtacaa ggaaattttc ttcgatcagt 1500

ctaaaaatgg ctacgccgga tacattgacg gcggagcaag ccaggaggaa ttttacaaat 1560

ttattaagcc catcttggaa aaaatggacg gcaccgagga gctgctggta aagcttaaca 1620

gagaagatct gttgcgcaaa cagcgcactt tcgacaatgg aagcatcccc caccagattc 1680

acctgggcga actgcacgct atcctcaggc ggcaagagga tttctacccc tttttgaaag 1740

ataacaggga aaagattgag aaaatcctca catttcggat accctactat gtaggccccc 1800

tcgcccgggg aaattccaga ttcgcgtgga tgactcgcaa atcagaagag accatcactc 1860

cctggaactt cgaggaagtc gtggataagg gggcctctgc ccagtccttc atcgaaagga 1920

tgactaactt tgataaaaat ctgcctaacg aaaaggtgct tcctaaacac tctctgctgt 1980

acgagtactt cacagtttat aacgagctca ccaaggtcaa atacgtcaca gaagggatga 2040

gaaagccagc attcctgtct ggagagcaga agaaagctat cgtggacctc ctcttcaaga 2100

cgaaccggaa agttaccgtg aaacagctca aagaagacta tttcaaaaag attgaatgtt 2160

tcgactctgt tgaaatcagc ggagtggagg atcgcttcaa cgcatccctg ggaacgtatc 2220

acgatctcct gaaaatcatt aaagacaagg acttcctgga caatgaggag aacgaggaca 2280

ttcttgagga cattgtcctc acccttacgt tgtttgaaga tagggagatg attgaagaac 2340

gcttgaaaac ttacgctcat ctcttcgacg acaaagtcat gaaacagctc aagaggcgcc 2400

gatatacagg atgggggcgg ctgtcaagaa aactgatcaa tgggatccga gacaagcaga 2460

gtggaaagac aatcctggat tttcttaagt ccgatggatt tgccaaccgg aacttcatgc 2520

agttgatcca tgatgactct ctcaccttta aggaggacat ccagaaagca caagtttctg 2580

gccaggggga cagtcttcac gagcacatcg ctaatcttgc aggtagccca gctatcaaaa 2640

agggaatact gcagaccgtt aaggtcgtgg atgaactcgt caaagtaatg ggaaggcata 2700

agcccgagaa tatcgttatc gagatggccc gagagaacca aactacccag aagggacaga 2760

agaacagtag ggaaaggatg aagaggattg aagagggtat aaaagaactg gggtcccaaa 2820

tccttaagga acacccagtt gaaaacaccc agcttcagaa tgagaagctc tacctgtact 2880

acctgcagaa cggcagggac atgtacgtgg atcaggaact ggacatcaat cggctctccg 2940

actacgacgt ggatcatatc gtgccccagt cttttctcaa agatgattct attgataata 3000

aagtgttgac aagatccgat aaaaatagag ggaagagtga taacgtcccc tcagaagaag 3060

ttgtcaagaa aatgaaaaat tattggcggc agctgctgaa cgccaaactg atcacacaac 3120

ggaagttcga taatctgact aaggctgaac gaggtggcct gtctgagttg gataaagccg 3180

gcttcatcaa aaggcagctt gttgagacac gccagatcac caagcacgtg gcccaaattc 3240

tcgattcacg catgaacacc aagtacgatg aaaatgacaa actgattcga gaggtgaaag 3300

ttattactct gaagtctaag ctggtctcag atttcagaaa ggactttcag ttttataagg 3360

tgagagagat caacaattac caccatgcgc atgatgccta cctgaatgca gtggtaggca 3420

ctgcacttat caaaaaatat cccaagcttg aatctgaatt tgtttacgga gactataaag 3480

tgtacgatgt taggaaaatg atcgcaaagt ctgagcagga aataggcaag gccaccgcta 3540

agtacttctt ttacagcaat attatgaatt ttttcaagac cgagattaca ctggccaatg 3600

gagagattcg gaagcgacca cttatcgaaa caaacggaga aacaggagaa atcgtgtggg 3660

acaagggtag ggatttcgcg acagtccgga aggtcctgtc catgccgcag gtgaacatcg 3720

ttaaaaagac cgaagtacag accggaggct tctccaagga aagtatcctc ccgaaaagga 3780

acagcgacaa gctgatcgca cgcaaaaaag attgggaccc caagaaatac ggcggattcg 3840

attctcctac agtcgcttac agtgtactgg ttgtggccaa agtggagaaa gggaagtcta 3900

aaaaactcaa aagcgtcaag gaactgctgg gcatcacaat catggagcga tcaagcttcg 3960

aaaaaaaccc catcgacttt ctcgaggcga aaggatataa agaggtcaaa aaagacctca 4020

tcattaagct tcccaagtac tctctctttg agcttgaaaa cggccggaaa cgaatgctcg 4080

ctagtgcggg cgagctgcag aaaggtaacg agctggcact gccctctaaa tacgttaatt 4140

tcttgtatct ggccagccac tatgaaaagc tcaaagggtc tcccgaagat aatgagcaga 4200

agcagctgtt cgtggaacaa cacaaacact accttgatga gatcatcgag caaataagcg 4260

aattctccaa aagagtgatc ctcgccgacg ctaacctcga taaggtgctt tctgcttaca 4320

ataagcacag ggataagccc atcagggagc aggcagaaaa cattatccac ttgtttactc 4380

tgaccaactt gggcgcgcct gcagccttca agtacttcga caccaccata gacagaaagc 4440

ggtacacctc tacaaaggag gtcctggacg ccacactgat tcatcagtca attacggggc 4500

tctatgaaac aagaatcgac ctctctcagc tcggtggaga cagcagggct gaccccaaga 4560

agaagaggaa ggtgtgattt tggacctcga gtcattggac ctcgagtcat gtaattagtt 4620

atgtcacgct tacattcacg ccctcccccc acatccgctc taaccgaaaa ggaaggagtt 4680

agacaacctg aagtctaggt ccctatttat ttttttatag ttatgttagt attaagaacg 4740

ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacagac gcgtgtacgc atgtaacatt 4800

atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat ttgcggccgg 4860

taccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cgacgcgccc tgtagcggcg 4920

cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc 4980

tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ctagagatct 5040

gtttagcttg cctcgtcccc gccgggtcac ccggccagcg acatggaggc ccagaatacc 5100

ctccttgaca gtcttgacgt gcgcagctca ggggcatgat gtgactgtcg cccgtacatt 5160

tagcccatac atccccatgt ataatcattt gcatccatac attttgatgg ccgcacggcg 5220

cgaagcaaaa attacggctc ctcgctgcag acctgcgagc agggaaacgc tcccctcaca 5280

gacgcgttga attgtcccca cgccgcgccc ctgtagagaa atataaaagg ttaggatttg 5340

ccactgaggt tcttctttca tatacttcct tttaaaatct tgctaggata cagttctcac 5400

atcacatccg aacataaaca accgttgaca attaatcatc ggcatagtat atcggcatag 5460

tataatacga caaggtgagg aactaaacca tgggtaccac tcttgacgac acggcttacc 5520

ggtaccgcac cagtgtcccg ggggacgccg aggccatcga ggcactggat gggtccttca 5580

ccaccgacac cgtcttccgc gtcaccgcca ccggggacgg cttcaccctg cgggaggtgc 5640

cggtggaccc gcccctgacc aaggtgttcc ccgacgacga atcggacgac gaatcggacg 5700

acggggagga cggcgacccg gactcccgga cgttcgtcgc gtacggggac gacggcgacc 5760

tggcgggctt cgtggtcgtc tcgtactccg gctggaaccg ccggctgacc gtcgaggaca 5820

tcgaggtcgc cccggagcac cgggggcacg gggtcgggcg cgcgttgatg gggctcgcga 5880

cggagttcgc ccgcgagcgg ggcgccgggc acctctggct ggaggtcacc aacgtcaacg 5940

caccggcgat ccacgcgtac cggcggatgg ggttcaccct ctgcggcctg gacaccgccc 6000

tgtacgacgg caccgcctcg gacggcgagc aggcgctcta catgagcatg ccctgcccct 6060

aatcagtact gacaataaaa agattcttgt tttcaagaac ttgtcatttg tatagttttt 6120

ttatattgta gttgttctat tttaatcaaa tgttagcgtg atttatattt tttttcgcct 6180

cgacatcatc tgcccagatg cgaagttaag tgcgcagaaa gtaatatcat gcgtcaatcg 6240

tatgtgaatg ctggtcgcta tactgctgtc gattcgatac taacgccgcc atccagtgtc 6300

gaaaacgggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag 6360

tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc 6420

atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg 6480

actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata 6540

agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa 6600

cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aatttcctga tgcggtattt tctccttacg 6660

catctgtgcg gtatttcaca ccgcataggg taataactga tataattaaa ttgaagctct 6720

aatttgtgag tttagtatac atgcatttac ttataataca gttttttagt tttgctggcc 6780

gcatcttctc aaatatgctt cccagcctgc ttttctgtaa cgttcaccct ctaccttagc 6840

atcccttccc tttgcaaata gtcctcttcc aacaataata atgtcagatc ctgtagagac 6900

cacatcatcc acggttctat actgttgacc caatgcgtct cccttgtcat ctaaacccac 6960

accgggtgtc ataatcaacc aatcgtaacc ttcatctctt ccacccatgt ctctttgagc 7020

aataaagccg ataacaaaat ctttgtcgct cttcgcaatg tcaacagtac ccttagtata 7080

ttctccagta gatagggagc ccttgcatga caattctgct aacatcaaaa ggcctctagg 7140

ttcctttgtt acttcttctg ccgcctgctt caaaccgcta acaatacctg ggcccaccac 7200

accgtgtgca ttcgtaatgt ctgcccattc tgctattctg tatacacccg cagagtactg 7260

caatttgact gtattaccaa tgtcagcaaa ttttctgtct tcgaagagta aaaaattgta 7320

cttggcggat aatgccttta gcggcttaac tgtgccctcc atggaaaaat cagtcaagat 7380

atccacatgt gtttttagta aacaaatttt gggacctaat gcttcaacta actccagtaa 7440

ttccttggtg gtacgaacat ccaatgaagc acacaagttt gtttgctttt cgtgcatgat 7500

attaaatagc ttggcagcaa caggactagg atgagtagca gcacgttcct tatatgtagc 7560

tttcgacatg atttatcttc gtttcctgca ggtttttgtt ctgtgcagtt gggttaagaa 7620

tactgggcaa tttcatgttt cttcaacact acatatgcgt atatatacca atctaagtct 7680

gtgctccttc cttcgttctt ccttctgttc ggagattacc gaatcaaaaa aatttcaaag 7740

aaaccgaaat caaaaaaaag aataaaaaaa aaatgatgaa ttgaattgaa aagctgtggt 7800

atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 7860

gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca 7920

agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 7980

cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 8040

ggtttcttag gacggatcgc ttgcctgtaa cttacacgcg cctcgtatct tttaatgatg 8100

gaataatttg ggaatttact ctgtgtttat ttatttttat gttttgtatt tggattttag 8160

aaagtaaata aagaaggtag aagagttacg gaatgaagaa aaaaaaataa acaaaggttt 8220

aaaaaatttc aacaaaaagc gtactttaca tatatattta ttagacaaga aaagcagatt 8280

aaatagatat acattcgatt aacgataagt aaaatgtaaa atcacaggat tttcgtgtgt 8340

ggtcttctac acagacaaga tgaaacaatt cggcattaat acctgagagc aggaagagca 8400

agataaaagg tagtatttgt tggcgatccc cctagagtct tttacatctt cggaaaacaa 8460

aaactatttt ttctttaatt tcttttttta ctttctattt ttaatttata tatttatatt 8520

aaaaaattta aattataatt atttttatag cacgtgatga aaaggaccca ggtggcactt 8580

ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 8640

atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 8700

tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 8760

tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 8820

gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 8880

aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 8940

gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 9000

ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 9060

gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 9120

gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 9180

atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 9240

ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 9300

cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 9360

cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 9420

gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 9480

cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 9540

cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 9600

taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 9660

ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 9720

aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 9780

caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 9840

taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 9900

gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 9960

cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 10020

taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 10080

agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 10140

ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 10200

gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 10260

acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 10320

acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 10380

tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 10440

ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 10500

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 10560

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttacc 10620

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcctatg ttgtgtggaa 10680

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcgcg 10740

caattaaccc tcactaaagg gaacaaaagc tggagctc 10778

<210> 4

<211> 6008

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ttgggaatcc ccgaacatcg cctcgctcca gtcaatgacc gctgttatgc ggccattgtc 60

cgtcaggaca ttgttggagc cgaaatccgc gtgcacgagg tgccggactt cggggcagtc 120

ctcggcccaa agcatcagct catcgagagc ctgcgcgacg gacgcactga cggtgtcgtc 180

catcacagtt tgccagtgat acacatgggg atcagcaatc gcgcatatga aatcacgcca 240

tgtagtgtat tgaccgattc cttgcggtcc gaatgggccg aacccgctcg tctggctaag 300

atcggccgca gcgatcgcat ccatggcctc cgcgaccggc tgcagaacag cgggcagttc 360

ggtttcaggc aggtcttgca acgtgacacc ctgtgcacgg cgggagatgc aataggtcag 420

gctctcgctg aattccccaa tgtcaagcac ttccggaatc gggagcgcgg ccgatgcaaa 480

gtgccgataa acataacgat ctttgtagaa accatcggcg cagctattta cccgcaggac 540

atatccacgc cctcctacat cgaagctgaa agcacgagat tcttcgccct ccgagagctg 600

catcaggtcg gagacgctgt cgaacttttc gatcagaaac ttctcgacag acgtcgcggt 660

gagttcaggc tttttaccca tggttgttta tgttcggatg tgatgtgaga actgtatcct 720

agcaagattt taaaaggaag tatatgaaag aagaacctca gtggcaaatc ctaacctttt 780

atatttctct acaggggcgc ggcgtgggga caattcaacg cgtctgtgag gggagcgttt 840

ccctgctcgc aggtctgcag cgaggagccg taatttttgc ttcgcgccgt gcggccatca 900

aaatgtatgg atgcaaatga ttatacatgg ggatgtatgg gctaaatgta cgggcgacag 960

tcacatcatg cccctgagct gcgcacgtca agactgtcaa ggagggtatt ctgggcctcc 1020

atgtcactag ttctttgaaa agataatgta tgattatgct ttcactcata tttatacaga 1080

aacttgatgt tttctttcga gtatatacaa ggtgattaca tgtacgtttg aagtacaact 1140

ctagattttg tagtgccctc ttgggctagc ggtaaaggtg cgcatttttt cacaccctac 1200

aatgttctgt tcaaaagatt ttggtcaaac gctgtagaag tgaaagttgg tgcgcatgtt 1260

tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc aatttcatcc atcaattcct 1320

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 1380

ggcaccgagt cggtggtgct ttttttgttt tttatgtcta gatcctagga tccaagcttg 1440

gtaccgagct cgtcgacgaa ttctgcagat atccatcaca ctggcggccg ctcgagcatg 1500

catctagagg gccgcaggcc ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 1560

tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 1620

tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 1680

ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa gcccaggaac cgtaaaaagg 1740

ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 1800

gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 1860

gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 1920

ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 1980

tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 2040

gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 2100

tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 2160

tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 2220

tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 2280

ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 2340

ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 2400

gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 2460

aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 2520

aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 2580

cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggagcg cttaccatct ggccccagtg 2640

ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 2700

cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc attcagtcta 2760

ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 2820

ttggcattgc tacaggcatc gtggtgtcac tctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 2880

ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 2940

gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 3000

ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 3060

ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 3120

gcccggcgtc aatacgggat aatagtgtat cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 3180

ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 3240

cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 3300

ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 3360

aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatgggtaat aactgatata attaaattga 3420

agctctaatt tgtgagttta gtatacatgc atttacttat aatacagttt tttgaaaagc 3480

tagcttatcg atgataagct gtcaaagatg agaattaatt ccacggacta tagactatac 3540

tagatactcc gtctactgta cgatacactt ccgctcaggt ccttgtcctt taacgaggcc 3600

ttaccactct tttgttactc tattgatcca gctcagcaaa ggcagtgtga tctaagattc 3660

tatcttcgcg atgtagtaaa actagctaga ccgagaaaga gactagaaat gcaaaaggca 3720

cttctacaat ggctgccatc attattatcc gatgtgacgc tgcagcttct caatgatatt 3780

cgaatacgct ttgaggagat acagcctaat atccgacaaa ctgttttaca gatttacgat 3840

cgtacttgtt acccatcatt gaattttgaa catccgaacc tgggagtttt ccctgaaaca 3900

gatagtatat ttgaacctgt ataataatat atagtctagc gctttacgga agacaatgta 3960

tgtatttcgg ttcctggaga aactattgca tctattgcat aggtaatctt gcacgtcgca 4020

tccccggttc attttctgcg tttccatctt gcacttcaat agcatatctt tgttaacgaa 4080

gcatctgtgc ttcattttgt agaacaaaaa tgcaacgcga gagcgctaat ttttcaaaca 4140

aagaatctga gctgcatttt tacagaacag aaatgcaacg cgaaagcgct attttaccaa 4200

cgaagaatct gtgcttcatt tttgtaaaac aaaaatgcaa cgcgacgaga gcgctaattt 4260

ttcaaacaaa gaatctgagc tgcattttta cagaacagaa atgcaacgcg agagcgctat 4320

tttaccaaca aagaatctat acttcttttt tgttctacaa aaatgcatcc cgagagcgct 4380

atttttctaa caaagcatct tagattactt tttttctcct ttgtgcgctc tataatgcag 4440

tctcttgata actttttgca ctgtaggtcc gttaaggtta gaagaaggct actttggtgt 4500

ctattttctc ttccataaaa aaagcctgac tccacttccc gcgtttactg attactagcg 4560

aagctgcggg tgcatttttt caagataaag gcatccccga ttatattcta taccgatgtg 4620

gattgcgcat actttgtgaa cagaaagtga tagcgttgat gattcttcat tggtcagaaa 4680

attatgaacg gtttcttcta ttttgtctct atatactacg tataggaaat gtttacattt 4740

tcgtattgtt ttcgattcac tctatgaata gttcttacta caattttttt gtctaaagag 4800

taatactaga gataaacata aaaaatgtag aggtcgagtt tagatgcaag ttcaaggagc 4860

gaaaggtgga tgggtaggtt atatagggat atagcacaga gatatatagc aaagagatac 4920

ttttgagcaa tgtttgtgga agcggtattc gcaatgggaa gctccacccc ggttgataat 4980

cagaaaagcc ccaaaaacag gaagattgta taagcaaata tttaaattgt aaacgttaat 5040

attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa cgaatagccc 5100

gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt 5160

ccagtttcca acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa 5220

agggtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg 5280

tcgaggtgcc gtaaagcagt aaatcggaag ggtaaacgga tgcccccatt tagagcttga 5340

cggggaaagc cctgatgaat atcttgtggt aggggtttgg gaaaatcatt cgagtttgat 5400

gtttttcttg gtatttccca ctcctcttca gagtacagaa gattaagtga gagatcccag 5460

tatagcgacc agcattcaca tacgattgac gcatgatatt actttctgcg cacttaactt 5520

cgcatctggg cagatgatgt cgaggcgaaa aaaaatataa atcacgctaa catttgatta 5580

aaatagaaca actacaatat aaaaaaacta tacaaatgac aagttcttga aaacaagaat 5640

ctttttattg tcagtactga ttattccttt gccctcggac gagtgctggg gcgtcggttt 5700

ccactatcgg cgagtacttc tacacagcca tcggtccaga cggccgcgct tctgcgggcg 5760

atttgtgtac gcccgacagt cccggctccg gatcggacga ttgcgtcgca tcgaccctgc 5820

gcccaagctg catcatcgaa attgccgtca accaagctct gatagagttg gtcaagacca 5880

atgcggagca tatacgcccg gagccgcggc gatcctgcaa gctccggatg cctccgctcg 5940

aagtagcgcg tctgctgctc catacaagcc aaccacggcc tccagaagaa gatgttggcg 6000

acctcgta 6008

Claims

1.一种只产生谷胱二肽、但不产生谷胱甘肽的谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌，其特征在于，通过包括以下步骤的方法构建：

A.在酵母菌S288C基因组中整合入一个以上拷贝的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因gshA，所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶是大肠杆菌来源的gshA酶，其氨基酸序列为SEQ IDNO:1，筛选阳性克隆；

B.筛选得到生产谷氨酸-半胱氨酸二肽的酵母菌。

2.如权利要求1所述的谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌，其特征在于，步骤A是在酵母菌基因组中整合入两个以上拷贝的基因gshA，筛选阳性克隆。

3.如权利要求1所述的谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌，其特征在于，步骤A是在酵母菌基因组中整合入三个以上拷贝的基因gshA，筛选阳性克隆。

4.如权利要求1-3中任一项所述的谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌，其特征在于，步骤A中所述的酿酒酵母S288C是上海工业生物技术研发中心提供的酿酒酵母S288C。

5.如权利要求1所述的谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌，其特征在于，所述基因gshA的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

6.如权利要求1所述的谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌，其特征在于，步骤A中采用质粒转化、同源重组技术或者基因编辑技术将基因gshA整合入酵母菌基因组。

7.如权利要求6所述的谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌，其特征在于，所述基因编辑技术采用CRISPR-Cas9系统。

8.如权利要求6所述的谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌，其特征在于，所述基因编辑技术采用CRISPR-Cpf1系统、CRISPR-Cas相关的转座系统INTEGRATE系统或者CAST系统。

9.如权利要求1-8中任一项所述的谷氨酸-半胱氨酸二肽生产菌在生产谷胱二肽中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，通过菌株的发酵来生产谷胱二肽。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，发酵培养基中添加谷氨酸和半胱氨酸。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，发酵培养基是如下组成的YPD-GC培养基：10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖，在发酵培养至48h，添加1wt％的谷氨酸和1.5wt％半胱氨酸。